酶标板包被液、封闭液及酶标板制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于酶标板包被技术领域，具体涉及酶标板包被液、酶标板封闭液及预包 被酶标板的制作方法。
【背景技术】
[0002] 酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)具有高灵敏 度、高特异性、易于标准化等诸多优点，被广泛应用于生物医疗体外诊断、生命科学研究、食 品安全检测等方面。
[0003] ELISA方法是利用了抗原与抗体的特异反应以及酶与底物产生的颜色反应，原理 为抗原或抗体与酶连接形成酶标抗原或抗体，再与对应的抗体或抗原反应，然后通过酶与 底物产生颜色反应，通过测定颜色的变化来进行定性或定量测定，测定的对象可以是抗体 也可以是抗原。ELISA方法首先需要将抗原或抗体先结合在固相载体上，例如聚苯乙烯材质 的酶标板的微孔中，该过程称为包被。商业化的ELISA试剂盒，在出厂之前酶标板上就已经 预先包被了抗原或抗体。抗原或抗体在酶标板中的包被质量，即包被在固相载体上的各微 孔中的抗原或抗体的均一度直接决定ELISA试剂盒的检测结果的准确性。
[0004] 抗原或抗体在酶标板中的包被质量受机器状态、操作手法、包被条件、环境等因素 的影响，包被过程不可避免的会出现一定几率的不合格的预包被酶标板。而现有的预包被 酶标板制作方法并不能在包被过程中对包被质量进行及时有效的检测，常规的检测方法是 等到包被过程完全结束后再利用与检测指标相对应的成套试剂通过一次到数次的孵育、洗 板、显色、终止等步骤才能明确预包被酶标板的质量，并且用于测试的预包被酶标板也会因 为测试而报废。
[0005] 常规的检测方法并不能对不合格品进行有效鉴别，不同预包被酶标板质量不均， 稳定性得不到保障，从而影响检测结果的稳定性，检测结果的稳定性不够是ELISA方法最糟 诟病的缺点之一，"试剂盒稳定性"问题在国产ELISA试剂盒产品中尤为突出。
【发明内容】
[0006] 因此，针对现有的预包被酶标板制作方法不能对包被均一度进行有效检测的技术 问题，本发明目的在于提供一种酶标板包被液和一种酶标板封闭液以及一种配合使用所述 酶标板包被液和所述酶标板封闭液的可在包被制作过程中进行包被均一度检测的预包被 酶标板的制作方法。
[0007] 本发明的酶标板包被液含有的pH = 9.6的碳酸盐缓冲溶液，还含有葡萄糖-6-磷酸 氢化酶。
[0008] 所述酶标板包被液中，G-6-ro的酶活性为50~500UI/MG;G-6-ro的浓度为5~50μ g/L，优选15~35yg/L，更优选20~30yg/L，最优选25yg/L。
[0009 ]本发明的酶标板封闭液含有pH=8.0的磷酸盐缓冲液、吐温-20和BSA，还含有氧化 型辅酶和6-磷酸葡萄糖。
[0010] 所述酶标板封闭液中，NADP+的浓度为0· 1~lmmol/L，优选0· 15~0.5mol/L，更优 选0 · 2~0 · 4mol/L，最优选0 · 3mmol/L;G-6_P的浓度为0 · 05~lmmol/L，优选0 · 08~0 · 4mmo 1 / 1^，更优选0. lmmol/L。
[0011] 所述酶标板封闭液中，吐温-20的体积分数为0.05%，BSA的浓度为0.5~5g/L，优 选0.5~lg/L，更优选0.5g/L。
[0012] 本发明的预包被酶标板的制作方法，其包括步骤：
[0013] 1)用所述酶标板包被液溶解待包被的抗体或抗原；
[0014] 2)步骤1)得到的酶标板包被液加入待包被的酶标板的各个微孔中，4 °C~37 °C包 被2~10小时；
[0015] 3)所述酶标板用洗涤液洗2~5优选3次，并拍干；
[0016] 4)向所述酶标板的各个微孔中加入所述酶标板封闭液，37°C (封闭1~2小时，然后 弃去封闭液、拍干、烘干；
[0017] 步骤4)中酶标板封闭液封闭0.5~2小时后检测所述酶标板的包被均一度。
[0018]步骤1)中溶解后抗体或抗原在所述酶标板包被液中的浓度为0.1~10yg/mL，优选 1 ~5yg/mL，更优选 2yg/mL。
[0019] 步骤2)中所述酶标板包被液的加入量为50~100μL孔;步骤3)中，所述洗涤液用 量为350yL/孔/次;步骤4)所述酶标板封闭液的加入量为250yL/孔。
[0020] 步骤3)中所述洗涤液可选用通用试剂盒洗涤液，比如含有0.05%吐温-20的磷酸 盐缓冲溶液。
[0021] 步骤4)中检测所述酶标板的包被均一度具体是将所述酶标板各个微孔内封闭液 在340nm波长处的吸光度，计算各个微孔吸光度的变异系数，所述变异系数反映所述酶标板 的包被均一度。
[0022] 本发明关键在于利用G-6-PD、G-6-P和NADP+这一组化合物之间的特异性反应，G-6-PD可使G-6-P释放出H+，同时NADP+还原成还原型辅酶(NADPH)，而利用NADPH在340nm波长 处的特征吸收，可进行精确检测NADPH的量，进而可精确检测G-6-PD的量。
[0023]本发明的预包被酶标板的制作方法，首先使用添加有G-6-ro的酶标板包被液进行 包被，在包被过程中G-6-PD与待包被的抗原或抗体一同包被，在包被并洗涤完后进行封闭 时，使用添加有NADP+和G-6-P的酶标板封闭液，G-6-H)可使G-6-P释放出H+，同时NADP+还原 成NADPH。在封闭过程中或封闭完成时使用酶标仪检测酶标板中各个微孔中的酶标板封闭 液在340nm波长处的吸光度，测得的吸光度即可反映各个微孔中NADPH的量，也就间接反映 各个微孔中包被的G-6-PD的量，再根据各个微孔的吸光度计算酶标板的变异系数，所述变 异系数即反映了 G-6-PD的包被均一度，进而可反映一同包被的抗原或抗体的包被均一度， 变异系数越小，包被均一度越高，以此实现了酶标板包被质量的检测。另外，产生的NADPH具 有抗氧化性可以提高预包被酶标板在保存过程中的稳定性。
[0024]本发明的积极进步效果在于:本发明的预包被酶标板的制作方法可在预包被酶标 板的制作过程中，即封闭过程中，通过测定酶标板微孔内的酶标板封闭液的吸光度来对抗 原或抗体的包被均一度进行无损检测，及时检测预包被酶标板的质量，对不合格的预包被 酶标板进行鉴别，不仅可保证预包被酶标板的品质，而且检测过程不影响预包被酶标板的 后续使用。
【附图说明】
[0025] 图1为实施例1中的常规检测方法的检测数据对比图。
[0026] 图2为实施例2中的牛奶样品中AFM1的检测数据对比图。
[0027]图3为实施例3中的玉米粉样品中AFB1的检测数据对比图。
[0028] 图4为实施例4中的全脂乳清粉样品中叶酸的检测数据对比图。
【具体实施方式】
[0029] 实例1链霉亲和素预包被酶标板的制作
[0030] 1.1试剂配置
[0031] 制作过程需要使用到的试剂包括酶标板包被液、洗涤液和封闭液，可根据表1中的 成分及参数或含量进行配置。
[0032] 表 1
[0034] 1.2制作步骤
[0035] 1)用酶标板包被液溶解链霉亲和素，链霉亲和素浓度为2yg/mL;
[0036] 2)向待包被的96孔的酶标板的各微孔中加入溶有链霉亲和素的酶标板包被液 (100μL孔），4°C包被过夜；
[0037] 3)用洗涤液洗板3次(350μ!7孔/次），并拍干；
[0038] 4)加入封闭液(250μ!7孔），37 °C封闭2小时;使用酶标仪检测酶标板各个微孔内封 闭液在340nm波长处的吸光度，根据测得的各个微孔的吸光度计算出酶标板的变异系数，变 异系数超过5%的计为不合格。弃去封闭液、拍干、烘干(37°C，lh)即得预包被酶标板，真空 干燥包装，避光保存。
[0039] 1.3效果检验
[0040] 不合格产品检出：共包被酶标板50块，其中2块变异系数超过5%，不合格率为4%。
[0041] 分别取一块合格和不合格的预包被酶标板，用常规检测方法进行包被均一度检 测，即分别使用生物素标记辣根过氧化物酶对链霉亲和素的包被均一度进行检测。
[0042] 步骤为：
[0043 ] A、将生物素标记辣根过氧化物酶溶液用磷酸盐缓冲溶液(PBS)稀释10000倍，然后 加入到酶标板的各孔中（1〇〇μLν孔），37°C避光孵育30分钟。
[0044] B、使用洗涤液洗涤酶标板3次，并拍干。
[0045] C、加入3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(TMB)显色液（1 OOyL/孔），37°C避光显色15分钟。 [0046] D、使用1M的硫酸作为终止液（lOOyL/孔），终止显色反应。
[0047] Ε、检测450nm波长的吸光度，计算变异系数。
[0048]如图1所示，经本发明筛选，结果为合格的预包被酶标板变异系数为4.33%，不合 格的预包被酶标板变异系数为7.82%，说明通过本发明筛选的酶标板包被更为均匀。
[0049] 实施例2黄曲霉毒素 Ml单克隆抗体预包被酶标板的制作
[0050] 2.1试剂配置
[0051]根据表2中的成分及参数或含量配置酶标板包被液、洗涤液和封闭液 [0052]表 2
[0054] 2.2制作步骤
[0055] 参考实施例1，区别在于步骤1)中链霉亲和素代替为AFM1单克隆抗体，AFM1单克隆 抗体浓度为0.5y