鹿结核病自然感染与卡介苗免疫间接酶联免疫吸附检测法
【技术领域】
[0001] 本发明属于兽医领域。具体涉及间接酶联免疫吸附检测法。
【背景技术】
[0002] 流行病学调查表明，目前鹿结核病（Deer tuberculosis)已经成为危害我国养鹿 业最为严重的传染病。研究表明，卡介苗（Bacillus化Imette-Gu紅in，BCG)是预防鹿结核 病的有效制剂。然而，随着BCG在鹿群中的应用，产生了一个严重的问题，即用现行的诊断 方法根本无法区分出BCG免疫鹿与野毒感染鹿。该是长期困扰养鹿业的一大难题。该问题 的出现，严重地干扰了鹿结核病的诊断和防制，限制了 BCG在鹿群中的应用，致使鹿结核病 的流行日趋严重。目前，没有能够有效区分自然感染与卡介苗免疫的诊断方法。
[000引
【发明内容】
： 本发明的目的是提供一种鹿结核病自然感染与卡介苗免疫间接酶联免疫吸附检测法。 用于鹿结核病自然感染与卡介苗免疫的鉴别诊断，克服目前没有有效方法能够区分自然感 染与卡介苗免疫的不足。
[0004] 本发明检测方法选用的生物材料；纯化蛋白GST-RV3872-74-75为诊断抗原，牛血 清白蛋白BSA，兔抗鹿IgG-HRP，标准阳性血清，标准阴性血清，待检血清。
[0005] 本发明检测方法的步骤： 1包被抗原： 在酶标板上选定待检血清孔、阴性对照孔、阳性对照孔、抗原对照孔、抗体对照孔、酶结 合物对照孔、空白对照孔，将纯化蛋白GST-RV3872-74-75用抗原稀释液稀释成ll-44ng/mL 后，等量加入上述各孔中。在35-42C湿盒内0. 5-2小时后4°C过夜包被。
[0006] 2、封闭 次日将板内液体弃去，3 X 3'洗涂，加入浓度1%的W PBST为溶剂BSA溶液封闭，加入量 均相同于步骤1所加抗原的体积量，35-42°C湿盒内赔育0. 5-2小时； 3、加血清 用血清稀释液将待检血清按血清比稀释液为1 ;200-1600的比例稀释，在待检血清孔 中加待检血清、标准阳性对照孔和抗体对照孔加阳性血清，标准阴性血清对照孔加阴性血 清，抗原对照孔加入血清稀释液，加入量均相同于步骤1所加抗原的体积量，35-42C湿盒 内赔育0.5-2小时，3X3'洗涂。
[0007] 4、加酶结合物一兔抗鹿IgG-HRP 将兔抗鹿IgG-HRP用抗原稀释液按兔抗鹿IgG-HRP比稀释液为1 ;10000-80000的比 例稀释，将兔抗鹿IgG-HRP液加入全部待检血清孔和对照孔中，每孔加入量相同于步骤1加 入的抗原液体积量，35-42C湿盒内赔育0. 5-2小时，3 X 3'洗涂。
[000引 5、加底物 在完成步骤4的酶标板上全部待检血清孔和对照孔中加底物溶液，每孔加入量相同于 步骤1加入的抗原液体积量，35-42C湿盒内赔育10-20分钟； 6、终止反应 在完成步骤5的酶标板上全部待检血清孔和对照孔中加2摩尔质量硫酸终止反应；每 孔加入量为步骤1加入的抗原液体积的1/2。
[0009] 7、用酶联免疫检测仪测量 将完成步骤6的培养板置于酶联免疫检测仪上，在490nm处空白调零，测各孔的0D值； 计算出待检样品的〇〇49。的平均值X与标准差SD，根据统计学原理，当0D 49。> X+3SD时，可 W 99. 9%判定为阳性。
[0010] 上述的抗原稀释液为：按碳酸轴（Na2C〇3)0. 318g，碳酸氨轴（NaHC〇3)0. 560g，加 去离子水后得1000 mL溶液的用料比例，先用少量固体物溶解，待完全溶化后补全部去离子 水，混匀所得到的溶液。
[0011] 上述的血清稀释液为：按牛血清白蛋白0. Ig，洗液100血的比例，溶化混匀所得 溶液。
[0012] 上述的底物溶液观用现配）为：巧樣酸0. 46 7g，磯酸氨二轴 (化2册〇4 ? 12&0) 1. 841g，加去离子水100血，溶化后加邻苯二胺0. 0 4g，溶化混匀后加过 氧化氨化〇2)〇. 15血，混匀。
[0013] 本发明中使用的兔抗鹿IgG-HRP按W下原料用量比例及过程制备： 将45mg辣根过氧化物酶（HRP)溶于1血纯水中，加入新配制的0. 1摩尔质量化I化 水溶液3血，混匀置冰箱中4C 30min，取出后加入2. 5%己二醇水溶液3血，于室温下轻 微揽拌比后，加入纯化兔抗鹿IgG 41mg，并调节反应液抑值至9.0,混匀，置4C过夜， 加入化肌4溶液巧mg/血）0.3血，置4°C冰箱中化，将上述结合物混合液加入等体积饱 和（NH4)2S04溶液，置4°C冰箱中30min，40(K)r/min离也15min，将得到的沉淀物溶于适量 0. 01摩尔质量pH7. 4磯酸盐缓冲液中，并在PBS中透析过夜，中间换液H次，次日再离也， 除去不溶物，即得辣根过氧化物酶（HRP) -兔抗鹿IgG结合物。最后，用PBS加至4. 5mL分 装。一2(TC冷冻保存备用。
[0014] 本发明的积极效果是；在完成兔抗鹿二抗的基础上，进一步对鹿结核病自然感染 与卡介苗免疫间接化ISA的诊断抗原进行筛选，W纯化蛋白GST-RV3872-74-75作为最佳抗 原并确立了最佳试验步骤和条件，建立一种特异性强，敏感性高，简便快捷，耗资少的鹿结 核病自然感染与卡介苗免疫鉴别诊断方法。
[0015] W纯化蛋白GST-RV3872-74-75为抗原技术效果说明 表1特异性实验结果
【主权项】
1. 鹿结核病自然感染与卡介苗免疫间接酶联免疫吸附检测法，其特征是： (1) 使用的生物材料有：纯化蛋白GST-RV3872-74-75为诊断抗原、牛血清白蛋白BSA、 兔抗鹿IgG-HRP、标准阳性血清、标准阴性血清、待检血清； (2) 检测步骤是： ① 包被抗原 在酶标板上选定试验孔、阴性对照孔、阳性对照孔、抗原对照孔、抗体对照孔、酶结合物 对照孔、空白对照孔；将牛型提纯蛋白衍生物用抗原稀释液稀释成ll_44ng/mL后，等量加 入上述各孔中，在35-42°C湿盒内0. 5-2小时后4°C过夜包被； ② 封闭 次日将经步骤①的酶标板内液体弃去，3 X 3'洗涤，加入浓度1%以PBST为溶剂的BSA 溶液封闭，封闭液，加入量均相同于步骤1所加抗原的体积量，35-42°C湿盒内孵育0. 5-2小 时； ③ 加血清 按血清比稀释液为I :200-1600的比例稀释血清，在完成步骤②的酶标板中的待检血 清孔中加待检血清、标准阳性对照孔和抗体对照孔加阳性血清，标准阴性血清对照孔加阴 性血清，抗原对照孔加入血清稀释液，加入量均相同于步骤1所加抗原的体积量，35-42°C 湿盒内孵育0.5-2小时，3X3'洗涤； ④ 加酶结合物一兔抗鹿IgG-HRP 将兔抗鹿IgG-HRP用抗原稀释液按兔抗鹿IgG-HRP比稀释液为I :10000-80000的比 例稀释，将兔抗鹿IgG-HRP液加入经步骤③的酶标板上全部待检血清孔和对照孔中，每孔 加入量相同于步骤1加入的抗原液体积量，35-42°C湿盒内孵育0. 5-2小时，3X3'洗涤； ⑤ 加底物 在完成步骤④的酶标板上全部待检血清孔和对照孔中加底物溶液，每孔加入量相同于 步骤1加入的抗原液体积量，35-42°C湿盒内孵育10-20分钟； ⑥ 终止反应 在完成步骤⑤的酶标板上全部待检血清孔和对照孔中加2摩尔质量硫酸终止反应；每 孔加入量为步骤①加入的抗原液体积的1/2 ; ⑦ 用酶联免疫检测仪测量 将完成步骤⑥的培养板置于酶联免疫检测仪上，在490nm处空白调零，测各孔的OD值； 计算出待检样品的〇〇49(|的平均值X与标准差SD，根据统计学原理，当OD 49(|> X+3SD时，可 以99. 9%判定为阳性。
2. 根据权利要求1所述的鹿结核病自然感染与卡介苗免疫间接酶联免疫吸附检测法， 其特征是：其中的抗原稀释液为按碳酸钠（Na 2CO3)O. 318g、碳酸氢钠（NaHCO3)O. 560g、加去 离子水后得1000 mL溶液的用料比例，先用少量固体物溶解，待完全溶化后补全部去离子 水，混匀所得到的溶液。
3. 根据权利要求1所述的鹿结核病自然感染与卡介苗免疫间接酶联免疫吸附检测法， 其特征是：其中的血清稀释液为按牛血清白蛋白〇. lg、洗液IOOmL的比例，溶化混匀所得溶 液。
4. 根据权利要求1所述的鹿结核病自然感染与卡介苗免疫间接酶联免疫吸附检测法， 其特征是：其中的兔抗鹿IgG通过以下过程制备： 取来自健康鹿的血清，用50%饱和（NH4 )2S04盐析一次后，再用37. 5%饱和（NH4 ) #04盐 析三次，提取鹿血清IgG，充分透析至无 NH4+、S042+，以0. OlM pH8. 0磷酸缓冲液透析平衡；过 DEAE-32柱，以0. OlM pH8. 0磷酸缓冲液洗脱，收集蛋白部分，测定蛋白含量；以聚丙烯酰 胺圆盘电泳鉴定其纯度，以鹿血清对照，若在加有过柱鹿血清IgG的凝胶管内仅有一条带， 且此带的位置恰与加鹿血清的凝胶柱上的Y-球蛋白带组中最后一条带相一致，将所提鹿 血清IgG浓缩，-20°C冰箱中保存备用。
5.根据权利要求1所述的鹿结核病自然感染与卡介苗免疫间接酶联免疫吸附检测法， 其特征是：所使用的兔抗鹿IgG-HRP按以下原料比例及过程制备： 将45mg辣根过氧化物酶（HRP)溶于I mL纯水中，加入新配制的0. 1摩尔质量NaIO4 水溶液3 mL，混匀置冰箱中4°C 30min，取出后加入2. 5%乙二醇水溶液3 mL，于室温下轻 微搅拌Ih后，加入纯化兔抗鹿IgG 41mg，并调节反应液pH值至9.0,混匀，置4°C过夜，力口 入NaBH4溶液（5mg/mL) 0. 3 mL，置4°C冰箱中3h，将上述结合物混合液加入等体积饱和 (NH4)2SO 4溶液，置4°C冰箱中30min，4000r/min离心15min，将得到的沉淀物溶于适量0. 01 摩尔质量PH7. 4磷酸盐缓冲液中，并在PBS中透析过夜，中间换液三次，次日再离心，除去 不溶物，即得辣根过氧化物酶（HRP) -兔抗鹿IgG结合物，最后，用PBS加至4. 5mL分装，一 20°C冷冻保存备用。
【专利摘要】鹿结核病自然感染与卡介苗免疫间接酶联免疫吸附检测法。该检测法选用的生物材料有：纯化蛋白GST-Rv3872-74-75，牛血清白蛋白BSA，兔抗鹿IgG-HRP，标准阳性血清，标准阴性血清，待检血清。检测步骤包括包被抗原、封闭、加血清、加酶结合物—兔抗鹿IgG-HRP、加底物、终止反应、用酶联免疫检测仪测量。本发明的积极效果是：在完成兔抗鹿二抗的基础上，进一步对鹿结核病自然感染与卡介苗免疫间接ELISA的诊断抗原进行筛选，以纯化蛋白GST-Rv3872-74-75作为最佳抗原并确立了最佳试验步骤和条件，建立一种特异性强，敏感性高，简便快捷，耗资少的鹿结核病自然感染与卡介苗免疫鉴别诊断方法。
【IPC分类】G01N33-543
【公开号】CN104569378
【申请号】CN201410814703
【发明人】杜锐, 王文玉, 曾范利, 时坤, 宗颖, 李健明, 刘东旭
【申请人】杜锐, 吉林农业大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月25日