表达海肾或萤火虫荧光素酶基因的prrsv重组质粒的构建方法以及应用
【专利说明】表达海肾或萤火虫荧光素酶基因的PRRSV重组质粒的构建 方法以及应用
【背景技术】：
[0001] 本发明属于生物工程领域，具体地说，涉及一种病毒的重组质粒的构建方法和应 用，更具体地说，涉及到能够表达海肾和萤火虫荧光素酶的猪繁殖与呼吸综合征病毒重组 质粒的构建与其在指征PRRSV复制水平上的应用。
[0002] 猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS) 是一种严重影响养猪业的接触性传染病，给世界各国造成的经济损失巨大。其病原PRRSV 一直处于不断的变异及进化过程中。目前，反向遗传操作被广泛应用于研宄PRRSV的生物 学特性、致病机理、毒力决定因子以及不断变异的分子机制，而其基因组作为外源基因表达 载体的研宄也被广泛开展。PRRSV的基因组中除0RF1和0RF2以及0RF4和0RF5外，其结构 蛋白编码框架之间有少则几个多则逾百的碱基重叠（overlap)。相关研宄表明：0RF重叠区 的影响会导致嵌合病毒失去感染性，因此可选择非重叠区或者将重叠区拉开作为外源基因 的插入位点。需要注意的是外源基因的插入原则应以能在最小程度上改变病毒基因组为基 础。但即便如此，插入外源基因也会在传代过程中逐渐丢失编码序列以致无法发挥其功能。 呈现遗传不稳定性。Dr. DongwanYoo 2009年报道了其在ORFlb和0RF2之间插入了 GFP基 因，如果在其3'端下游插入一个二级结构简单的（由其自身及周围序列形成）转录调控序 列6(TRS6)的拷贝，让外源基因的表达被一个独立的转录子所引导。所构建的突变体克隆 能够在至少37代次的传达过程中保遗传稳定。Dr. Chengbao Wang的研宄则表明TRS6拷贝 的插入同样能够使在其他位点插入的外源序列稳定。而Dr. Dongwan Yoo在构建时在外源基 因插入点的5'端和3'端分别引入了两个外源的酶切位点Afl II和Mlu I，以方便下游的 替换或者插入操作，但是这或多或少可能对亲本病毒的生物学特性造成影响。Dr. Chengbao Wang所依赖的反向遗传操作系统是细菌人工染色体，而其外源基因的插入位点在0RF7和 3' UTR之间。这个位点并没有编码基因的重叠，另外0RF7编码的是PRRSV病毒表达量最 大的核衣壳蛋白（N protein)，因此这里也是外源基因插入的一个很好的选择。而他们同样 选取了 TRS6作为外源基因的转录调控序列。在TRS6的引导下，GFP这个外源基因仍然得 到了很好的稳定的表达。
[0003] 荧光素酶（英文名称：Luciferase)是自然界中能够产生生物荧光的酶的统称，其 中最有代表性的是一种学名为Photinus pyrail的萤火虫体内的焚光素酶。在相应的化 学反应中，荧光的产生是来自于荧光素的氧化，有些情况下反应系统中也包括三磷酸腺苷 (ATP)。萤火虫发出的淡黄绿色的光是由其体内的荧光素酶产生的，这并不是一个简单的过 程，早在很久以前，人们就已经通过对细菌、真菌、海葵及萤火虫的研宄，发现了生物的发光 现象。荧光素酶的辅因子，即荧光素，能与氧结合形成一个高度紧张的复合物，当这个氧化 物在ATP的参与下被破坏时，产生C02,从而形成具有较高活性的形式，即可发光。与02结合 的是荧光素酶中的荧光素，222酶蛋白种类多样，决定了荧光素也有不同的大小和形状。对 发光系统进行分析发现荧光素或荧光素酶不是特定的分子，而是对于所有能够产生荧光的 底物和其对应的酶的统称，虽然它们各不相同，不同的能够控制发光的生物体用不用的荧 光素酶来催化不同的发光反应，最为人所知的发光生物是萤火虫，另外目前应用比较广泛 的海肾荧光素酶的生物体海肾。在本发明中，所插入的海肾荧光素酶基因来源于PGMR-TK， 其编码基因为936bp，萤火虫荧光素酶基因来源于pGL3-Basic，编码基因长度为1653bp。
[0004] 在本发明中，在高致病性蓝耳病细胞致弱疫苗株HuN4-Fl 12的全长感染性克隆骨 架的ORFlb和ORF2a之间分别插入了海肾荧光素酶基因和萤火虫荧光素酶基因，获得了能 够稳定表达这两个荧光素酶基因的重组PRRSV :pA-Rluc和pA-Fluc，对其进行一系列病毒 特性分析及遗传稳定性检测；并在病毒复制、转录、翻译水平对其与亲本病毒进行比较分 析。并通过用这两个带有荧光素酶基因的突变病毒vA-Rluc和vA-Fluc感染MARC-145和 PAM之后，收取细胞裂解物对其进行荧光素酶活性检测的方法对病毒在细胞上的复制水平 进行比较分析，对其作为指征病毒复制水平的一种指标进行评估。
【发明内容】
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[0005] 本发明的目的在于，提供表达海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶基因的PRRSV重组 质粒的构建方法。
[0006] 本发明的构建表达海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶基因的PRRSV重组质粒的方 法，为根据pGMR-TK海肾荧光素酶报告基因载体和pGL3-Basic萤火虫荧光素报告基因载 体中的两个荧光素酶基因序列（上述两个荧光素酶载体均购自上海吉满生物科技有限公 司）以及高致病性蓝耳病细胞致弱疫苗株HuN4-F112的基因序列设计SOE PCR引物，在 HuN4_F112的ORFlb和0RF2之前分别插入Renilla和Firef ly Luciferase基因，并在外源 基因3'端下游插入此病毒的转录调控序列6(TRS6)。将扩增出的两个嵌合片段通过Asc I 和EcoR V双酶切，然后回收PCR产物连接到HuN4-F112的Asc I和EcoR V双酶切载体上， 从而获得了两个嵌合重组质粒pA-Rluc和pA-Fluc〇
[0007] 本发明的嵌合海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶的PRRSV的基因工程重组质 粒，是能够稳定表达海肾焚光素酶（Renilla Luciferase)或萤火虫焚光素酶（firefly Luciferase)的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞传代致弱株HuM-Fl 12的嵌合重组 质粒。
[0008] 本发明的表达 Renilla Luciferase 或 firef ly Luciferase 的 PRRSV 基因工 程重组质粒的构建方法包括以下步骤：首先通过SOE PCR的方法扩增出含有Renilla Luciferase或firefly Luciferase的PRRSV突变片段，然后将扩增出的PCR片段和高致病 性蓝耳病细胞传代致弱疫苗株HuN4-Fl 12进行Asc I和EcoR V酶切，最后将酶切后的突变 PCR片段和HuN4-F112的双酶切片段进行连接，并转化T0P10感受态细胞，然后通过筛选获 得基因工程重组质粒pA-Rluc和pA-Fluc，从而提供了相应的构建方法。
[0009] 使用本发明所构建的重组质粒pA-Rluc和pA-Fluc，转染MARC-145细胞后所拯救 出来的病毒具有和亲本病毒vHuN4-Fl 12相似的病毒生物学特性。并且在至少连续15代次 的传代过程中能够保持遗传稳定性。不同M0I感染MARC-145细胞或者PAM细胞不同时间 点后，收集细胞，通过裂解细胞检测荧光素酶活性值可以对PRRSV在MARC-145或者PAM上 的复制水平进行分析比较，评估其作为指征PRRSV复制水平的另外一种指标的可行性。结 果证明这种方法是可行的。较之其他的方法有一定的简便性和优越性。
【附图说明】
[0010] 图1是pA-Rluc和pA-Fluc嵌合重组质粒的构建示意图
[0011] 图 2 是 SOE PCR 引物扩增 Renilla Luciferase 或 firefly Luciferase 不同的 PCR片段的电泳检测结果，其中，图2a为由pHuN4-F112为模板，引物HF11559和Rluc-Rl/ Fluc-Rl 获得的长度约为 450bp 的两个 PCR 产物 Rluc-SOE-1/Fluc-SOE-l 和以 pHuN4-F112 为模板，引物Rluc-F4/Fluc-F4和HR13090获得的长度约为1100bp的PCR片段Rluc-SOE-4/ Fluc-SOE-4 :图 2a 中另有为分别由 pGMR-TK 和 pGL3-Basic 为模板，Rluc-F2/Fluc-F2 和 Rluc-R2/R3/Fluc-R2/R3为上下游引物所获得的分别为935bp和1700bp左右的PCR产 物Rluc-S0E-2/Fluc-S0E-2 ;图2b为以S0E-1和S0E-2回收产物为模板，引物HF11559 和Rluc-R2/R3/Fluc-R2/R3为上下游引物扩增出的1440bp和2200bp长度的PCR产物 Rluc-S0E-3/Fluc-S0E-3 ;图2c为由S0E-3和S0E-4的回收产物为模板，引物HF11559和 HR13090 扩增出的分别为 2540bp 和 3300bp 长度的 PCR 产物 Rluc-S0E-5/Fluc-S0E-5 ;图 2d 为由S0E-5产物的EcoR V和Asc I双酶切电泳结果。
[0012] 图3a是构建好的嵌合重组质粒pA-Rluc、pA-Fluc以及亲本质粒pHuN4-F112的 EcoR V和Asc I双酶切鉴定结果，图3b是对嵌合重组质粒的Swa I线性化电泳结果，图3c 是对线性化模板的体外转录RNA的电泳鉴定。