一种酯酶基因estZ及其编码的蛋白质和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及应用环境微生物和农业领域，更具体地，涉及一种酯酶基因^泛及其 编码的蛋白质和应用。具体用于农作物中农药残留的去除，生产无公害绿色农产品；同时可 用于修复农药污染的土壤、水体等自然环境。
【背景技术】
[0002] 农药的发明和使用为人类的生存和发展做出了巨大的贡献，特别是在农业生产、 农作物病虫害防治、杂草清除等方面发挥了巨大的作用，成为保障农业丰收高产，解决人类 粮食问题不可或缺的重要条件之一。据统计，每年我国通过农药防治，粮食挽回约5845万 吨、棉花101. 5万吨、油料228. 5万吨，每年挽回直接经济损失约800亿元。农药的使用量 稳步增长，已经是提高农民收入、促进农村消费、保障国民经济稳定发展的必然选择。但是， 农药的使用也是一把双刃剑，由于农药的不科学使用特别是超剂量和超范围使用致使农药 残留问题日益突出，引起了一系列的食品安全问题和环境安全问题。一方面农药残留污染 直接导致农产品中农药超标，产品品质下降，严重威胁到人们的生命安全和我国农副产品 的销售。据统计，我国每年遭受残留农药污染的作物面积超过10亿亩。另一方面，环境中 残留农药通过食物链富集最终进入人体内，直接威胁到人类的生命健康；此外，人类所施用 到田间的农药被植物体所截留的不足20%，有80%以上进入环境中，不仅被植物体所截留的 部分会产生残留毒性，而且进入环境中的部分也会通过食物链达到生物富集，进而产生残 留毒性，给生态系统造成巨大的破坏。因此，消除环境及农产品中的农药残留污染已成为科 研工作者亟待解决的具有重大经济和社会意义的科研命题。
[0003] 生物降解技术（Biodegradation)可用于去除环境及农产品中各类有机污染物， 与传统化学、物理处理方法相比具有操作简便、经济实用、无二次污染等优点。因此，研究利 用微生物降解菌剂或酶制剂产品治理农药残留污染已成为近年来研究的热点。目前许多发 达国家和大公司企业都投入巨资以从事农药残留生物降解制剂的研究和开发，如美国BCI 公司、美国工程服务生物修复公司已经将降解制剂产品规模化生产，国内的北京佳农新贸 易发展有限公司已成功生产"比亚"降解酶制剂可用于去除有机磷类农药残留。但是，目前 还没有同时针对拟除虫菊酯类和甲氧基丙烯酸酯类农药残留的生物降解制剂产品。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于针对现有技术的上述不足，提供一种新的降解农药的酯酶基因 该基因可用于农作物中农药残留的去除，生产无公害绿色农产品；同时可用于修复农 药污染的土壤、水体等自然环境。
[0005] 本发明的另一目的是提供该基因编码的蛋白质。
[0006] 本发明又一目的是提供该基因及其编码的蛋白质的应用。
[0007] 本发明的目的通过以下技术方案予以实现： 一种能降解含酯键农药的酯酶基因eWZ，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0008] 本发明所述酯酶基因是从一株能够降解含酯键农药的铜绿假单胞菌 (/ ?>5(9饥/6_/7<3>5<36?/7/ 1§7'/7〇>5<3)菌株？401中克隆得到。所述菌株已于2014年12月5日保藏 于中国典型培养物保藏中心（CCTCC)，保藏号是CCTCC M 2014630。发明人通过质谱分析 发现：菌株PA01可以使高效氯氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、溴氰菊酯、氯氰菊酯、甲氰菊酯、联 苯菊酯、醚菌酯、吡唑醚菌酯和嘧菌酯等含有酯键的农药的酯键发生断裂，使其失去农药毒 性。
[0009] 从菌株中克隆酯酶基因M泛的具体方法为转座子标签法。菌株PA01能在基础 培养基平板上利用高效氯氰菊酯等农药为唯一碳源生长，通过双亲株杂交使供体大肠杆菌 S17-1中的pBT20质粒上的转座子mariner随机插入PA01基因组后，利用转座子上的庆大 霉素抗性基因和降解过程中产生水解圈与否筛选突变株，并利用Tail-PCR技术克隆出被 插入失活的基因片段，然后再进行功能验证。
[0010] 用上面的策略筛选到一株不能在基础培养基加农药的平板上产生水解圈的突 变株，进一步的降解实验表明该突变子不能降解高效氯氰菊酯等农药。设计引物，进行 Tail-PCR，多次PCR测序后，拼接结果表明插入位点为PA3734基因中间，该基因是功能未知 的酯酶基因，全长为1206bp (编码401个氨基酸)，命名为mL?。这是一种新的降解农药的 酯酶基因。
[0011] 一种能降解含酯键农药的酯酶Estz，其氨基酸序列如SEQIDN0. 2所示。
[0012] 含有如上所述酯酶基因的重组克隆载体pUCP19- ￡^泛，将如上所述的酯酶基 因刀的核酸片段插入pUCP19的EcoR I和Xba I位点之间所得。
[0013] 含有如上所述能降解含酯键农药的酯酶基因的重组表达载体 pET28a(+)-His-Pl，所述的重组表达载体优选将所述的酯酶基因的核苷酸片段插入 pET28a(+)的BamH I和EcoR I位点之间所得。
[0014] 含有如上所述降解含酯键农药的酯酶基因的基因工程菌。
[0015] 所述的基因工程菌优选以大肠杆菌BL21为出发菌株。
[0016] 如上所述酯酶基因在降解农作物、农产品、土壤或水体中含酯键农药的应 用。
[0017] 如上所述酯酶基因构建降解含酯键农药的转基因作物中的应用。
[0018] 如上所述酯酶Estz在去除农作物、农产品、土壤或水体中含酯键农药残留的应 用。
[0019] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果： 1.本发明利用转座子标签法成功从一株铜绿假单胞菌aerygifliosa)菌 株PA01中克隆出降解含酯键农药的酯酶基因eWZ。在GenBank比对结果表明该基因为一 种新的降解农药的酯酶基因，全长(从起始密码子到终止密码子）为1206bp，G + C含量为 65. 2%，编码401个氨基酸。
[0020] 2.本发明提供的酯酶Estz能催化降解高效氯氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、溴氰菊 酯、氯氰菊酯、甲氰菊酯、联苯菊酯、醚菌酯、吡唑醚菌酯和嘧菌酯等含有酯键的农药。生产 的酶制剂可用于蔬菜、水果、茶叶、棉花或烟草等农产品中的农药残留去除，提高农产品品 质及增加附加值。
[0021] 3.酯酶基因^泛可进一步用于构建转基因作物，彻底解决农业生产中农药残留 超标问题，生产无公害绿色农产品；也可用于修复农药污染的土壤、水体等自然环境，解决 环境污染问题，保护生态环境和人类健康。
【附图说明】
[0022] 图1.酯酶基因隆的策略图。
[0023] 图2?酯酶基因e>sdBL21 (pET28a(+))中表达策略图。
[0024] 图3.酯酶EstZ蛋白电泳图谱；其中泳