蛋白质支架的制作方法

专利名称：蛋白质支架的制作方法
蛋白质支架1.相关申请的交叉引用本申请要求2007年10月31日提交的美国临时申请号60/984，209的优先权，该 申请通过引用全文纳入本文。2.发明领域本发明涉及特异性结合靶标的蛋白质支架以及制备、筛选和利用这种支架的方法。3.
背景技术：
本发明涉及可用于，例如产生具有新型结合特征的产物的蛋白质支架。具有相对确定三维结构的蛋白质通常称为蛋白质支架，其可用作设计工程改造产 物的试剂。这些支架通常含有适于特定或随机序列改变的一个或多个区域，常进行这种序 列随机化来产生可从中选择所需产物的蛋白质文库。可利用这种支架的一个具体领域是抗 体模拟设计领域。虽然市场上已有治疗性抗体的一些成功例子(HERCEPTIN , AVASTIN ,
SYNAGIS )，但制备抗体片段作为治疗性蛋白的兴趣不断高涨。其优势在于便于通过分子 生物学技术操作，从而能获得所需结合特性，即在微生物系统中表达这种片段的能力，以及 预计抗体片段的组织穿透力优于全长抗体。一个例子是REOPRO 。此外，已有人致力于开发小的、非抗体治疗剂，即抗体模拟物，从而能利用抗体和 抗体片段的优势，例如结合靶标的亲和力高和免疫原性及毒性低，同时能避免一些缺点，例 如需要结构域内的二硫键，这要求正确折叠和抗体片段易于凝聚及稳定性不如全长IgG。一 个例子是通过缺失单克隆抗体重链可变区的三个β链设计的“小抗体(minibody)”支架， 其涉及免疫球蛋白折叠(Tramontane)等，J. Mol. Recognit. 7 :9，1994)。该蛋白质包含61个 残基，可用于提供两个超变环，很像抗体中的互补决定区(CDR)。这两个环任意排列，并选择 了能结合抗原的产物，但迄今为止该框架因溶解性问题而看来应用有限。用于展示环的另 一框架是淀粉酶抑肽，它是α -淀粉酶的小蛋白抑制剂，含有74个残基，通过两个二硫键组 合在一起的6-链β片层夹心并形成3个CDR-样环(McConnell和Hoess，J. Mol. Biol. 250 460，1995)。测试了其它蛋白质是否能作为框架，并用于展示α螺旋表面上的随机残基(Nord 等，Nat. Biotechnol. 15 :772，1997 ；Nord 等，Protein Eng. 8 :601，1995)，α 螺旋束中 α 螺 旋之间的环(Ku 和 Schultz，Proc. Natl.Acad. Sci. USA 92 :6552，1995)，和由二硫键约束的 环，例如小蛋白酶抑制剂的那些(Markland等，Biochemistry 35 :8045，1996 ；Markland等， Biochemistry 35 :8058，1996 ；Rottgen 禾口 Collins，Gene 164 -.243,1995 ；Wang 等，J. Biol. Chem. 270 12250，1995)。因此，需要开发小的、稳定的、人工抗体-样分子以供各种治疗和诊断应用。本文对参考文献的引用或讨论不应理解为承认这种参考文献是本发明的现有技 术。
4.发明概述本发明提供能结合任何感兴趣化合物的重组非天然产生的蛋白质支架家族。具体 地说，本文所述蛋白质可用于展示与抗体可变区的互补决定区(OTR)类似的确定环。这些 环可经随机化或限制性进化而产生结合多种靶化合物所需的多样性。这些蛋白质可装配成 能结合不同靶标的多特异性支架。本发明提供重组非天然产生的多肽支架(下文称为“本发明支架”)，其包含与衍 生自天然产生的蛋白质序列的多个环区域序列相连的多个β链结构域，其中通过天然产 生的蛋白质序列中相应环序列的至少一个氨基酸的缺失、取代或添加而改变一个或多个所 述环区域序列，其中该多肽支架的β链结构域与天然产生蛋白质序列的相应结构域序列 有至少50%同源性。在一些实施方式中，天然产生的序列是对应于人结合腕蛋白C的蛋白 质序列。具体地说，这些支架包括结合腕蛋白C的第三FnIII结构域(也称为“Τη3”结构 域)。在具体的实施方式中，本发明支架包含选自下组的氨基酸序列SEQ ID N0:l、5-32、 64-67和210。在其它具体实施方式
中，本发明支架可由包含选自下组的序列的核酸编码 SEQ ID NO 33-59。在其它实施方式中，天然产生的序列对应于预测的Tn3结构基序，例如衍生自嗜 热生物的那些，例如但不限于闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)、海葡萄嗜热菌 (Staphylothermus marinus)、嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobusacidocaldarius)、硫磺矿硫化 Bflif (Sulfolobus solfataricus)、禾口硫化卩十菌(Sulfolobustokodaii)。在具体的实施方式中，本发明支架包含选自下组的氨基酸序列SEQ IDNO :2_4、 68-88和210。在其它特定实施方式中，本发明支架可由包含选自下组的序列的核酸编码 SEQ ID NO :89-98。在本发明的另一方面，本发明支架还包括二硫键稳定的支架。通过耐热、耐受离液 变性作用和蛋白酶处理检测到二硫键稳定的支架显示稳定性增加。本发明的支架经工程改造结合感兴趣靶标，如本文所述。这种结合可以，例如显示 至少100 μ M的亲和力。本发明还提供包含至少两个本发明支架的多聚支架(下文称为“本发明的多聚支 架”)。在一些实施方式中，本发明的多聚支架包含至少两个相连的支架，例如但不限于二聚 结构域、氨基酸接头、二硫键、化学交联和IgG分子或其片段或Fc区域。本发明还提供包含多个本发明支架的多肽展示文库(下文称为“本发明文库”)。 本发明文库可用于捕捉和坚定靶标结合支架来构建多聚支架。在另一方面，本发明还提供编码本发明支架和文库的分离核酸分子。本发明还提供制备、利用、筛选、优化和工程改造本发明支架和文库的方法。在还有另一方面，本发明还提供包含本发明支架的药物组合物。本发明还提供通过给予治疗有效量的本发明支架和/或包含本发明支架的药物 组合物来治疗、预防、缓解、检测、诊断或监测患者中疾病或其症状的方法，如本文所述。在具体的实施方式中，本发明提供可用于预防、缓解、检测、诊断或监测疾病，例如 但不限于癌症的TRAIL-R2特异性结合物。在其它具体的实施方式中，本发明的TRAIL-R2 特异性结合支架可用于治疗其中的癌细胞表达TRAIL-R2的癌症。在一些实施方式中，癌症 可包括但不限于肺癌、非霍奇金淋巴瘤、胃肠道癌症、肾癌、卵巢癌、肝癌、胃癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、胰腺癌、肝癌、前列腺癌和黑色素瘤。5.附图简述出于说明本发明的目的，附图描述了本发明的某些实施方式。然而，本发明不限于 附图所述实施方式的确切配置和手段。

图1.支架的重组体总细胞表达.此处显示了表达蛋白质支架的大肠杆菌培养物 的各种重组体裂解液的考马斯染色PAGE凝胶。高度表达的支架以星号(*)表示。图2.基于Tn3的支架的表达和纯化.此处显示了重组体表达和纯化后描述基于 Τη3的支架的考马斯染色PAGE凝胶。不难将Tn3支架纯化至均一。图3Α.基于Τη3的支架的解链温度和测定.该图显示了通过示差扫描量热法检测 基于Τη3支架的热解链曲线。ρΗ 7.0时，测定的Tm是约45°C。图3B.基于Tn3的支架的脲变性特征.该图显示了 ρΗ 7. 5时，基于Τη3的支架在各 种浓度的脲中的变性特征。利用分子的固有荧光的改变检测分子的解折叠情况。对于Τη3支 架，解折叠导致荧光强度增加并向较高波长迁移。如该图所显示的，该分子在低浓度脲(小于 或等于1Μ)中折叠，在较高浓度脲中变性。计算的50%分子解折叠的摩尔浓度约为2Μ。图3C. Τη3支架存在单体状态.该图显示纯化的Τη3支架的尺寸排阻层析分析结 果，从而测定了污染性片段和/或高级结构的相对比例。图上的百分比表示97%以上的支 架以单体形式洗出(通过在线光扫描检测器测定约为IlkDa)，而只有少部分(约3% )在 峰值为21kDa处洗出，可能是二聚体。图4.显示环长度多样性的支架的BC环.该图表示各种Tn3相关蛋白质支架的BC 环的长度多样性。(A)表示衍生自PDB数据库的Τη3相关支架亚组的序列(51条序列)显 示的环长度多样性。(B)表示衍生自瑞士-蛋白质数据库(Swiss-prot database)的序列 (397条序列)显示的环长度多样性。如图所示，各种Tn3相关支架显示长度为7-26个氨基 酸残基。按照本文所用的方案，Τη3中BC环的长度是9个残基。图5.支架的TO环显示环长度多样性.该图表示各种Tn3相关支架的TO环的长 度多样性。该图描述了衍生自PDB数据库的Τη3相关支架亚组的序列所显示的TO环长度 多样性。如图所示，Tn3支架的TO环显示长度为6-18个氨基酸残基。按照本文所用的方 案，Tn3中TO环的长度是10个残基。图6.支架的DE环显示环长度多样性.该图表示各种Tn3相关支架的DE环的长 度多样性。该图描述了衍生自PDB数据库的Τη3相关支架亚组的序列所显示的DE环长度 多样性。如图所示，Τη3支架的DE环显示长度为约4-约17个氨基酸残基。按照本文所用 的方案，Τη3中DE环的长度是6个残基。图7Α.支架的9氨基酸残基BC环显示序列多样性.该图表示瑞士 -蛋白质数据 库的9氨基酸残基BC环(73条序列)显示的序列多样性。利用比对工具，Webl0g0，9氨基 酸残基BC环中特定位置氨基酸的相对发生率由特定位置上单字母密码的大小表示。例如， 所分析的9氨基酸残基BC环3位最常见的氨基酸是脯氨酸(P)，然后是丙氨酸(A)，再然后 是缬氨酸(V)。图7B.支架的12氨基酸残基BC环显示序列多样性.该图表示瑞士-蛋白质数据 库的12氨基酸残基BC(99条序列)环显示的序列多样性。利用比对工具，Webl0g0，12氨 基酸残基BC环中特定位置氨基酸的相对发生率由特定位置上单字母密码的大小表示。例如，所分析的12氨基酸残基BC环3位最常见的氨基酸是脯氨酸(P)，然后是甘氨酸(G)，再 然后是谷氨酰胺(Q)。图8.支架的re环显示序列多样性.该图表示瑞士-蛋白质数据库所有长度的re 环(393条序列)显示的序列多样性。利用比对工具，ffeblogo, TO环中特定位置氨基酸的 相对发生率由特定位置上单字母密码的大小表示。例如，所分析的re环2位最常见的氨基 酸是天冬酰胺(N)，然后是苏氨酸(T)，再然后是赖氨酸(K)。图9. SYNAGIS 特异性Tn3支架的表达和纯化.此处显示了重组体表达和纯化 后描述SYNAGIS 特异性Τη3支架(SynBPOl)的考马斯染色PAGE凝胶。不难将SynBPOl 支架纯化至均一。图9B.测定SYNAGIS 特异性结合支架的Kd.曲线表示通过BIACORE 试验 表征SynBPOl支架与SYNAGIS 的特异性结合亲和力的实验。利用各种浓度的固定化 SYNAGIS 和流动相SynBPOl测定到结合亲和力(Kd)为约16 μ M。图9C. SYNAGIS 特异性结合支架显示与基础支架类似的稳定性.从实施例 3制备的支架文库鉴定SYNAGIS 特异性结合支架。此处显示了通过固有荧光强度检测 蛋白质解折叠情况的脲变性实验结果。在该实验中，随着脲浓度升高，Tn3支架(WT)和 SYNAGIS 特异性结合支架SynBPOl (Al)显示非常相似的变性特征。图9D.结合支架二价结合靶抗体SYNAGIS .曲线表示采用BIAcore试验方式 表征两个支架结合到固定分子上的实验。在该实验中，固定的SYNAGIS 覆盖有ΙμΜ的 SYNAGIS 4寺异性蛋白支架溶液(蓝色曲线)或ΙμΜ的SYNAGIS 特异性蛋白支架 +0. 19 μ M交联mAb溶液(红色曲线)。图10Α.含有天然产生的二硫键的Τη3结构基序的序列比对.该序列比对在线显 示了 21个含有天然产生二硫键的Τη3相关结构基序中半胱氨酸残基的位置，从而测定稳定 性工程改造的候选位置。各Τη3序列内类似着色的Cys残基由二硫键相连。比对包括Τη3 的序列(Iten.pro)以促进鉴定Tn3中对应于含二硫键的支架中半胱氨酸残基的残基和位置。图10Β.靶向二硫键工程改造以增加支架稳定性.该图描述了支架序列中待工程 改造的潜在二硫键位置。为增加稳定性，分别工程改造支架中描述的4个二硫键位置。得 到的重组支架分别称为Tn3SS1、Tn3SS2、Tn3SS3和Tn3ss4。图10C.所选的纯化二硫键工程改造支架的RP-HPLC曲线.图中描述了纯化、还原 和重折叠形成二硫键后(i)Tn3SS3和(ii)Tn3ss4的反相HPLC色谱图。色谱图显示了支架内 所含的半胱氨酸在蛋白质纯化后仅部分氧化(上曲线)，通过DTT处理完全还原(中间曲 线)和重折叠后完全氧化成二硫键(下曲线)。图10D. 二硫键工程改造支架的表达和表征.该图描述了图IOB所示4个二硫键 工程改造支架的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析结果。在还原和非还原条件下分析纯化和重折叠 构建物Tn3 (野生型)、Tn3ssl (1)、Tn3SS2 (2)、Tn3SS3 (3)、Tn3ss4 (4)样品来评估预计的二硫键 形成。所述Tn3SS2形成二硫键连接的二聚体。其它构建物(Tn3、Tn3ssl、Tn3SS3和Tn3ss4)不 对掺入的半胱氨酸残基起反应而形成二聚体，因为纯化和重折叠的含二硫键支架在还原和 非还原条件下作类似迁移。图10E.单二硫键工程改造支架的脲变性特征.该图描述了图A中概述的所选的含二硫键支架，Tn3ssl (SSl)、Tn3SS3(SS3)和Tn3ss4(SS4)以及Tn3(WT)支架的脲变性研究结 果。在该实验中，各种纯化和重折叠支架接触水平升高的脲。监测相对荧光作为解折叠的检 测手段。随着蛋白质解折叠或变得不稳定，相对荧光增加。如图中所示，与Tn3支架相比， 含有Tn3ssl的支架显示对脲的敏感性较高，因此较不稳定。与Tn3相比，支架Tn3SS3和Tn3ss4 也显示对脲介导变性的耐受性更强，因此更稳定。在该实验所检验的支架中，支架Tn3ss4显 示对脲介导变性的耐受性最强。图10F.与Tn3支架相比，Tn3ss4 二硫键工程改造支架显示稳定性增加.该图显示 了比较Tn3支架(圆圈)和含二硫键支架Tn3ss4(正方形)稳定性的盐酸胍变性试验结果。 如该图所示，Tn3ss4支架显示对胍介导变性的耐受性更强，因此与Tn3支架相比更稳定。图10G.与Τη3支架相比，Tn3ss4支架显示高水平的蛋白酶耐受.该图描述了比较 Tn3支架与含Tn3ss4的支架稳定性的蛋白酶敏感性试验结果。在该实验中，相对蛋白酶耐受 性与蛋白质稳定性相关。对于Tn3支架，与嗜热菌蛋白酶温育最低10分钟导致降解。与嗜 热菌蛋白酶温育1小时后，Τη3支架完全降解。含Tn3ss4的支架在完整的16小时过程中显 示嗜热菌蛋白酶耐受性，提示稳定性高于Tn3支架。图10Η. Tn3ss4 二硫键工程改造支架显示高解链温度(Tm).该图描述了比较Tn3支 架(虚线)与含二硫键Tn3ss4支架(实线)的热稳定性研究结果。如解链曲线所示，Tn3ss4 支架显示解链温度(约71°C)高于Tn3支架(约45°C，也参见图3Α)。图101. Tn3ss4 二硫键工程改造的支架存在单体状态.该图描述了 Tn3ss4支架的尺 寸排阻层析/多角度光散射(SEC-MALS)分析曲线。该数据显示纯化的Tn3ss4支架存在单 体状态，在线光散射检测器测定到约llkDa。图10J.纯化的Tn3SS3+4 二硫键工程改造支架的RP-HPLC色谱.该图描述了纯化后、 还原后和重折叠形成二硫键后Tn3SS3+4的反相HPLC色谱图。曲线显示了支架内所含半胱氨 酸在蛋白质纯化后仅部分氧化(上曲线)，通过DTT处理完全还原(中间曲线)和重折叠后 完全氧化成两个二硫键(下曲线)。图10K.含双二硫键的支架Tn3SS3+4显示高稳定性水平.该图显示比较Tn3 (野生 型)支架(圆圈)与含单二硫键的支架，Tn3ss4(正方形)与含双二硫键的支架Tn3SS3+4(三 角形)的稳定性的盐酸胍变性实验结果。如图中所示，与含有单重折叠二硫键的支架Tn3ss4 以及Tn3支架相比，重折叠的双二硫键支架Tn3SS3+4显示对胍介导变性的耐受性更强，因此， 更稳定。图11A.超嗜热生物的支架的表达和纯化.此处显示了表达和纯化各种超嗜热细 菌的预计支架(Tn3结构基序)的考马斯染色PAGE凝胶。将所有预计的支架表达和纯化至 均一。在该图中，T表示总细胞裂解液，S表示可溶性裂解液部分，P表示纯化的蛋白质。图11B.海葡萄嗜热菌的支架显示高水平的热稳定性.该图描述了海葡萄嗜热菌 的支架的热稳定性。重组表达、纯化推定的支架，并对其进行热稳定性测试。如图中所示， 海葡萄嗜热菌的支架显示高解链温度(PH 7. 0时约83°C )。图11C.硫化叶菌的支架显示高水平的稳定性.该图描述了硫化叶菌的支架的热 稳定性。重组表达、纯化推定的支架，并利用示差扫描量热器对其进行热稳定性测试。如图 中所示，硫化叶菌的支架显示高解链温度(pH 3. 0时约98°C )。该支架还在pH 7. 0时显示 高水平的稳定性，然而其在高于75°C的温度下凝聚并从溶液中沉淀。
图11D.海葡萄嗜热菌的支架显示高水平的稳定性.该图描述了盐酸胍变性试验 的结果，证明海葡萄嗜热菌的支架的蛋白质稳定性高。如图中所示，支架解折叠需要高浓度 盐酸胍(胍浓度是5. OM时50%的分子解折叠)，从而证明高稳定性。图11E.硫化叶菌的支架显示高水平的稳定性.该图描述了盐酸胍变性试验的结 果，证明硫化叶菌的支架的蛋白质稳定性高。蛋白质解折叠与分子的相对荧光增加相关。如 图中所示，PH 7.0(圆圈)或Ph 3.0(正方形)时解折叠需要高浓度的胍-HC1，从而证明高 稳定性。图11F.海葡萄嗜热菌的支架显示高水平的蛋白酶耐受性.该图描述了检测海葡 萄嗜热菌的支架的稳定性的蛋白酶敏感性试验结果。在该实验中，相对蛋白酶耐受性与蛋 白质稳定性相关。对于该支架，与嗜热菌蛋白酶温育10分钟导致低水平的降解，其在该时 期维持稳定。海葡萄嗜热菌支架在整个16小时过程中显示嗜热菌蛋白酶耐受。图11G.硫化叶菌的支架显示高水平的蛋白酶耐受性.该图描述了检测硫化叶菌 的支架的稳定性的蛋白酶敏感性试验结果。在该实验中，相对蛋白酶耐受性与蛋白质稳定 性相关。硫化叶菌支架在整个16小时过程中显示嗜热菌蛋白酶耐受。图11H.从宿主细胞纯化海葡萄嗜热菌的支架.该图描述海葡萄嗜热菌支架纯化 中的一步。由于该支架显示高水平的稳定性，可能加热含有重组支架的粗制大肠杆菌裂解 液以除去主要的宿主细胞蛋白质，而保留该支架。泳道1表示热处理前的粗制裂解液。含 有粗制裂解液的PAGE凝胶的考马斯染色显示存在候选支架。70°C，热处理粗制裂解液15 分钟导致宿主细胞蛋白质大量丧失，而该支架完好保存(泳道2)。图111.从宿主细胞纯化海葡萄嗜热菌的支架.该图描述海葡萄嗜热菌支架纯化 中的一步。由于该支架显示高水平的稳定性，可能加热含有重组支架的粗制大肠杆菌裂解 液以降解主要的宿主细胞蛋白质，而保留该支架。泳道1表示蛋白酶处理前的粗制裂解液。 含有粗制裂解液的PAGE凝胶的考马斯染色显示存在该支架。55°C，蛋白酶处理粗制裂解液 45分钟导致宿主细胞蛋白质大量丧失，而该支架完好保存(泳道2)。图11J.从宿主细胞纯化硫化叶菌的支架.该图描述了硫化叶菌支架的纯化。由 于该支架显示高水平的稳定性，可能在PH 3. 0温育含有重组支架的粗制裂解液并将温度 升高至70°C，持续15分钟以除去主要的宿主细胞蛋白质，而保留可溶性支架。泳道1表示 酸或热处理前的粗制大肠杆菌裂解液。泳道2表示将粗制裂解液的pH降低至3. 0后保留 的可溶性蛋白质。泳道3表示将pH降低至3. 0和在70°C温育15分钟后的可溶性蛋白质。 在这些处理中支架耐受并维持在溶液中。图12. SynBPOl与SYNAGIS 结合所需的两个环.该图描述了 SynBPOl及其变体 与结合于平板的SYNAGIS 的结合情况。在该实验中，将SynBPOl的BC和TO环转移至野 生型支架，从而产生SynBPOl的单环变体。对这些变体(仅称为BC和TO)进行基于ELISA 的试验，在该试验中它们显示不结合与平板结合的SYNAGIS 。作为对照，ELISA试验方式 中存在SynBPOl结合。此外，SynBPOl上存在SS4 二硫键突变。称为SynBP01SS4的该变体 在ELISA中不显示与结合于平板的SYNAGIS 有任何结合。图13.通过BIAcore测定TRAIL-R2特异性克隆5E5的结合亲和力.该图描述了 克隆5E5对结合于芯片的TRAIL-R2的亲和力测定。测定的Kd约为700nM。图14.多个TRAIL-R2特异性克隆显示的竞争性结合.该图中描述了各种TRAIL-R2特异性支架的竞争性结合实验的结果。测试了两个TRAIL-R2特异性克隆，5E5和 7G11与展示在噬菌体上的其它TRAIL-R2特异性克隆的竞争性结合。5E5与本身和除2H6 和7G11以外的所有其它克隆竞争。7G11只与本身和2H6竞争。该数据表明有两组克隆识 别TRAIL-R2上的两个不同表位。图15.各种TRAIL-2特异性克隆的竞争.该图中描述了各种TRAIL-R2特异性支架 的竞争性结合实验的结果。测试了 5种TRAIL-R2特异性克隆，1E3、1G11、2B4、1C12和2D3 与展示在噬菌体上的其它TRAIL-R2特异性克隆的竞争性结合。1E3、1C12和2D3与除8B3 和7G11以外的大多数噬菌体展示克隆竞争。可溶性IGll不与噬菌体展示的任何克隆竞争， 2B4在大多数情况下显示低到中等的抑制作用。该数据提示1E3、1C12和2D3识别TRAIL-R2 上的相同表位。图16. TRAIL-R2结合剂抑制细胞活力.该图描述了当与抗-HIS标签抗体和抗小 鼠IgG以2 1 0.5的摩尔比形成复合物时，Colo-205细胞系对5E5、7Gll、lC12、2D3和 1E3处理的敏感性。通过将用TRAIL-R2结合克隆处理的试验信号表示为用不结合TRAIL-R2 的对照Tn3处理细胞获得信号的百分比而获得活细胞百分比。图17Α.表示多价Τη3-融合蛋白例子的图.二价构建物表示融合于抗体Fc区的 Τη3，而四价构建物将Τη3与重链恒定区合伙轻链C κ区融合。图17Β.显示多价Τη3-融合蛋白中蛋白质模块连接键的图.i)在Fc融合构建物 中，N-末端Tn3模块通过肽接头和IgGl的绞链区连接于IgGl的Fc区。接头序列的长度 和组成可以不同，但在实施例16中是-GA-基序。ii)在Ck融合构建物中，N-末端Tn3模 块通过肽接头连接于抗体κ轻链的恒定区。接头序列的长度和组成可以不同，但在实施例 16中是-GGGTPT-基序。iii)在IGHGl融合构建物中，N-末端Tn3模块通过肽接头连接于 IgGl重链的恒定区。接头序列的长度和组成可以不同，但在实施例16中是-GGGTPT-基序。图18.表达多价Τη3构建物.该图代表还原性SDS-PAGE，其显示A蛋白纯化后二 价Τη3构建物(实施例1-3)，和四价Τη3构建物(实施例4_7)的相对大小。样品编号对应 于表10所示那些。表达的所有构建物通过该分析显示预计的大小。图19. Τη3单体和多聚体的结合亲和力.该图描述了利用单价、二价和四价1C12 和DlTn3构建物获得的生物传感器结合实验的传感器图。将TRAIL-R2-FC融合蛋白固定在 传感器芯片上，将样品蛋白质注射在该芯片上。“四”指四价Ck/IGHGl融合构建物。1C12 构建物显示与TRAIL-R2结合改善与化合价呈函数关系，而对照Dl构建物不显示结合。图20.靶向TRAIL-R2的二价Tn3构建物的作用.该图描述了用㈧二价形式的 TRAIL-R2特异性Τη3结合物1C12或⑶加入或未加入交联抗体(抗-人Fe)的二价形式 非特异性Τη3结合物处理的Η2122细胞的生长抑制曲线。与对照非结合物相比，TRAIL-R2 特异性结合物在试验中显示温和活性，该活性在第二抗体存在下降低。图21.靶向TRAIL-R2的四价Τη3构建物的作用.该图描述了用㈧单特异性四 价形式的TRAIL-R2特异性Τη3结合物1C12或⑶加入或未加入交联抗体(抗-人Fe)的 单特异性四价形式的非特异性Τη3结合物处理的Η2122细胞的生长抑制曲线。与对照非结 合物相比，TRAIL-R2特异性结合物在试验中显示有活性，该活性在第二抗体存在下略微降 低。图22.靶向TRAIL-R2的多特异性四价Τη3构建物的作用.该图描述了用㈧双特异性四价形式的TRAIL-R2特异性Tn3结合物1C12和2D3 (1C12融合于IgGl重链的恒定 区，2D3融合于Ck结构域)或(B)加入或未加入交联抗体(抗-人Fe)的双特异性四价 形式的TRAIL-R2特异性结合物2D3和1C12(2D3融合于IgGl重链的恒定区，1C12融合于 Ck结构域)处理的H2122细胞的生长抑制曲线。与对照非结合物相比(如图21所示)， TRAIL-R2特异性结合物在试验中显示有活性，该活性在第二抗体存在下增加。图23. pSec构建物的设计.(A)表示pSeC-0ppA-Tn3的开放读框的氨基酸序列。 分泌入周质空间后，oppA信号肽(下划线所示)SEQ ID N0:227被切割。oppA信号肽内的 倒数第二个残基(斜体字显示)突变成pSeC-0ppA(L25M)-Tn3衍生物中的甲硫氨酸以引入 NcoI克隆位点。(B)描述了 pSec-0ppA(L25M)-Tn3构建物，显示了该构建物内启动子、信号 肽、Tn3和His标签模块的配置。图24.制备分泌的Tn3构建物.(A)表示分泌Τη3的大肠杆菌粗制培养液和周质 组分的SDS-PAGE分析。(B)表示从大肠杆菌培养液纯化的Τη3支架的SDS-PAGE分析。(C) 表示从大肠杆菌培养液纯化的Τη3的HPLC分析。DTT处理后保留时间的漂移与二硫键的存
在一致。图25. SYNAGIS -Fc 二价结合物的SDS-PAGE.该图显示了与Fc区融合的 SynBPOl支架的还原性(泳道1)和非还原性(泳道2) SDS-PAGE分析。这些结果证明融合 的大小正确，还可能表示二聚化。图26. SYNAGIS "Fe 二价结合物与SynBPOl的竞争性结合分析.SynBPOl与 SynBPOl-Fc的竞争性BIAcore分析。简言之，通过胺偶连将SYNAGIS 固定在CM5传 感器芯片表面。以75微升/分钟的流速注射IyM浓度的SynBPOl或SynBPOl-Fc。二价 SynBPOI-Fc构建物显示亲和力高于单结构域结合物。图27.可将Tn3支架偶联于PEG. (A)固定化金属亲和柱纯化STn3 (CTC)(泳道 1-4)和马来酰亚胺衍生PEG处理后(阳离子交换层析之前)的纯化STn3(CTC)(泳道5) 的SDS-PAGE分析。泳道1 表达STn3 (CTC)的细胞的总细胞裂解液；泳道2 =IMAC柱的流出 物；泳道3 IMAC柱的洗涤部分；泳道4 :STn3 (CTC)，未PEG化；泳道5 =PEG化的STn3 (CTC)。 (B)从SP XL阳离子交换柱纯化的PEG化STn3 (CTC)的SDS-PAGE分析。柱梯度组分示于泳 道 1-5。图28. AB、⑶和EF环显示环长度多样性.获得103Fn3序列各自的ABjD和EF环 的长度，利用该数据产生所示的环长度频率分布。对于任何给定的环，所有长度的频率总和 等于103，所分析序列的数量。图29.测定不同pH和离子强度下Tn3的解链温度.这些图显示通过示差扫描量 热器测定PH 7. 0 (20mM磷酸钠缓冲液)(A)、pH 5. 0 (20mM乙酸钠缓冲液)(B)和pH 7. 0的 高盐缓冲液中(含1.0M盐的20mM磷酸钠缓冲液)(C)Tn3支架的热解链温度。有高离子强 度存在下，测定的Tn3的Tm是pH 7. 0时约45°C，pH 5. 0时52°C，pH 7. 0时55°C。反复扫 描(黄色的)PH 7.0样品显示在这些条件下热解链可逆。pH 5. 0时Tn3的热解链是可逆 的。图30Α.设计Τη3的荷电突变体.显示了 Τη3三维结构的代表性草图(pdb代码 lten)。显示了 SEQ ID 1的残基8_90，其中所有Asp和Glu残基的侧链以黄色和白色显示。 设计了一组8个突变体，其中用Asn或Gln替代以黄色显示的Asp和Glu残基。如SEQ ID1编号残基。图30B.纯化的Tn3重组荷电突变体的SDS-PAGE分析.各纯化蛋白质的等份试样 进行SDS-PAGE凝胶电泳。为进行比较，在同一凝胶的不同泳道中对野生型蛋白质进行电 泳，显示迁移率与各种荷电突变体相似。图31Α.稳定Τη3突变的加和性.产生一系列Τη3点突变，其中各Asp或Glu残基替代为Asn或Gin。此处显示了利 用固有荧光检测蛋白质解折叠的脲变性实验结果。在该实验中，与野生型Tn3支架相比，8 种Τη3支架荷电突变体中的5种(E33Q、D49N、E52Q、D53N、E86Q)需要较高浓度的脲来实现
解折叠。图31B.荷电突变的组合导致Tn3稳定性的加和改进.将提高野生型Τη3稳定性的Asp或Glu残基的点突变组合成Τη3的双或三突变。 组合Τη3突变体(E33Q/D49N、D49N/E86Q和E33Q/D49N/E86Q)各自显示稳定性高于任何相 应的点突变体或野生型Τη3。图32.野生型和荷电工程改造Τη3支架的解链温度测定.该图显示通过示差扫描 量热法检测Τη3支架变体在ρΗ 7.0时的热解链曲线。对于野生型Tn3 (A)，测定的Tm是约 45°C，对于 E33Q/D49N Tn3 (B)是 50°C，对于 D49N/E86Q Tn3 (C)是 52°C，对于 E33Q/D49N/ E86Q Tn3 (D)是 52°C。6.详述本文所述的蛋白质支架设计成优于抗体衍生的片段和非抗体框架。本发明支架胜 过抗体片段的主要优点是结构。这些支架衍生自人体液蛋白质中发现的完整、稳定和可溶 性结构模块以及衍生自自然界的其它来源(量热，但不限于嗜热细菌)。因此，它们显示优 于抗体片段的折叠和热稳定特性，而抗体片段的产生包括除去抗体天然折叠的部分，从而 通常暴露完整抗体中包埋在疏水环境中的氨基酸残基，例如可变区和恒定区之间的界面。 这种疏水性残基暴露于溶剂增加了凝聚的可能性。此外，本发明支架提供抗体分子的功能优点。具体地说，虽然支架不是免疫球蛋 白，但它的总体折叠接近IgG重链可变区的折叠，从而其可能在相对取向上以抗体CDR的类 似方式展示其三个环。由于该结构，本发明支架具有类似于天然的抗原结合特性和类似于 抗体的亲和力。因此，可在体外采用类似于体内抗体亲和力成熟方法的环随机化和改组方案。6. IFnIII 结构基序本发明支架依据III型纤连蛋白模块(FnIII)，一种在哺乳动物血液和结构蛋 白中发现的结构域的结构。该结构域常见于迄今为止测序的蛋白质，包括纤连蛋白、结 合腕蛋白、胞内细胞骨架蛋白、细胞因子受体和原核生物酶(Bork和Doolittle，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :8990，1992 ；Bork 等，Nature Biotech. 15 :553，1997 ；Meinke 等， J. Bacteriol. 175 :1910，1993 ；Watanabe 等，J. Biol. Chem. 265 15659，1990)。虽然该结构 域在自然界中多次出现，其氨基酸序列差异很大。具体地说，这些支架包括结合腕蛋白C的 第三FnIII结构域(也称为“Tn3”结构域)。该结构域的总体折叠极其接近最小功能性抗 体片段(即，重链的可变区)的，其包含骆驼和羊驼IgG的完整抗原识别单位。此外，Τη3结构域具有耐受随机化的暴露环序列，从而有助于产生能以高亲和力结合特异性靶标的各种蛋白支架库。这些蛋白质支架可用于设计能实质性结合任何感兴趣化合物的蛋白质(例如，任 何蛋白质)。具体地说，基于本文所述Tn3结构基序的分子可用作支架，其经设计的定向进 化(directed evolution)使得类似于抗体可变区的互补决定区(OTR)的一个或多个环随 机化。这种定向进化方法产生对感兴趣抗原具有高亲和力的抗体-样分子。此外，本文所 述支架可用于展示指定的暴露环(例如，以前依据抗原结合随机化和选择的环)来指导结 合这种引入的环的分子的进化。可进行该类选择以鉴定各CDR-样环或识别组合在非线形 表位结合部分中的两个或所有三个CDR-样环的识别分子。对应于IgG重链抗原结合环的一组Tn3的三个环从氨基酸残基23到31 (BC)、50 到56 (DE)和75到84 (FG)。BC、DE和FG环的长度分别是9、6和10个残基，落在抗体重链 中发现的相应抗原识别环的狭窄范围内，即分别是7-10、4-8和4-28残基长度。或者，在另 一实施方式中，BC、DE和TO环可以分别从氨基酸残基23到31、51到56和75到84。因此， 一旦为高抗原亲和力作了随机化和选择，这些环可与抗原接触，等于抗体中相应环的接触。 Tn3结构域的AB、CD和EF环还可共享该特性，因此，也可用于为高抗原亲和力作随机化和 选择。该方法可与BC、DE和re环的随机化平行或串联进行。在具体的实施方式中，依据人结合腕蛋白C的Tn3结构域的支架的一个或多个环 区域包含以下氨基酸残基I. AB 环内所含的 12-17 ；II. BC 环内所含的 23-31 ；III. CD 环内所含的 39-45 ；IV. DE 环内所含的 50-56 ；V. EF环内所含的60-66 ；和VI. FG 环所含的 75-84。在另一具体实施方式
中，本发明支架包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、 至少5个或至少6个环，其中环包含SEQ ID NO :201、202、203、204、205或206所示氨基酸 序列。在一个实施方式中，本发明支架包含具有SEQ ID NO: 201所示氨基酸序列的AB环。 在另一实施方式中，本发明支架包含具有SEQ ID NO :202所示氨基酸序列的BC环。在另一 实施方式中，本发明支架包含具有SEQ ID NO :203所示氨基酸序列的⑶环。在另一实施方 式中，本发明支架包含具有SEQ ID NO: 204所示氨基酸序列的DE环。在另一实施方式中， 本发明支架包含具有SEQ ID NO :205所示氨基酸序列的EF环。在另一实施方式中，本发明 支架包含具有SEQ ID NO :206所示氨基酸序列的TO环。在一具体实施方式
中，本发明支架 包含具有SEQ ID NO :201所示氨基酸序列的AB环，具有SEQ ID NO :202所示氨基酸序列的 BC环，具有SEQ IDNO :203所示氨基酸序列的⑶环，具有SEQ ID NO 204所示氨基酸序列 的DE环，具有SEQ ID NO 205所示氨基酸序列的EF环，和具有SEQ ID NO: 206所示氨基酸 序列的re环。在另一具体实施方式
中，依据人结合腕蛋白C的Tn3结构域的支架的一个或多个 环区域包含以下氨基酸残基I. AB 环内所含的 11-17 ；II. BC 环内所含的 23-31 ；
III. CD 环内所含的 39-45 ；IV. DE 环内所含的 51-56 ；V. EF环内所含的60-67 ；和VI. FG 环所含的 75-84。在另一具体实施方式
中，本发明支架包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、 至少5个或至少6个环，其中环包含SEQ ID NO :207、202、203、208、209或206所示氨基酸 序列。在一个实施方式中，本发明支架包含具有SEQ ID NO: 207所示氨基酸序列的AB环。 在另一实施方式中，本发明支架包含具有SEQ ID NO :202所示氨基酸序列的BC环。在另一 实施方式中，本发明支架包含具有SEQ ID NO :203所示氨基酸序列的⑶环。在另一实施方 式中，本发明支架包含具有SEQ ID NO: 208所示氨基酸序列的DE环。在另一实施方式中， 本发明支架包含具有SEQ ID NO :209所示氨基酸序列的EF环。在另一实施方式中，本发明 支架包含具有SEQ ID NO :206所示氨基酸序列的TO环。在一具体实施方式
中，本发明支架 包含具有SEQ ID NO :207所示氨基酸序列的AB环，具有SEQ ID NO :202所示氨基酸序列的 BC环，具有SEQ IDNO 203所示氨基酸序列的⑶环，具有SEQ ID NO 208所示氨基酸序列 的DE环，具有SEQ ID NO 209所示氨基酸序列的EF环，和具有SEQ ID NO: 206所示氨基酸 序列的re环。在其它实施方式中，本发明支架包含的环区域是SEQ ID NO: 1-32或68-88中任一 所示同源环区域的变体。本发明提供重组的、非天然产生的多肽支架，其包含连接于多个衍生自天然产生 蛋白质序列的环区域序列的多个β链结构域，其中一个或多个所述环区域序列因天然产 生蛋白质序列中相应环序列的至少一个氨基酸的缺失、取代或添加而有所不同，其中所述 多肽支架的β链结构域与天然产生蛋白质序列的相应结构域序列有至少50%同源性。例 如，这种氨基酸序列可以是但不限于SEQID N0:l-32、60-88和210中的任一种。在另一具 体实施方式中，本发明支架包含人结合腕蛋白C的Τη3结构域的序列。在另一实施方式中， 本发明支架包含与人结合腕蛋白C的Τη3结构域有至少50%同源性的序列。在进一步的实 施方式中，与Τη3结构域的所述同源性是至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少 75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少99 %或更高。在其它实施方式中，所 述天然产生的序列是对应于人结合腕蛋白C的额外Τη3结构基序的蛋白质序列。在其它实 施方式中，所述天然产生的序列是对应于另一结合腕蛋白，或者另一生物(例如但不限于， 鼠、猪、牛或马结合腕蛋白)的结合腕蛋白的Τη3结构基序的蛋白质序列。虽然Τη3代表用于产生抗体模拟物的支架，但其它分子可取代本文所述分子中的 Τη3。这些包括但不限于动物和原核生物的相关Τη3结构基序。此外，还可利用其它蛋白质 的Τη3结构基序。不同生物和母体蛋白质的模块可能最适合于不同应用；例如在设计低ρΗ 下稳定的支架中，从优选在低PH下生长的生物(例如但不限于硫化叶菌)产生蛋白质是最 理想的。在另一实施方式中，可从超嗜热细菌，例如但不限于闪烁古生球菌和海葡萄嗜热菌 鉴定并利用相关Τη3结构基序，二者各自显示在大于70°C时生长最佳。在其它实施方式中， 天然产生的序列对应于嗜热生物的预测Tn3结构基序，例如但不限于闪烁古生球菌、海葡 萄嗜热菌、嗜酸热硫化叶菌、硫磺矿硫化叶菌和硫化叶菌。在还有另一实施方式中，本发明 支架具有的蛋白质序列与对应于上述嗜热生物的Τη3结构基序或预测的Τη3结构基序的任一序列具有至少30 %、至少35 %、至少40 %、至少45 %、至少50 %、至少55 %、至少60 %、至 少65 %、至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %或至少99 %的同 源性。在一些实施方式中，可从SEQ ID NO :2-4和68-88所示氨基酸序列选择嗜热生物的 Tn3结构基序。本发明还提供含7个以上的多个β链的本发明支架。在一个实施方式中，本发明 支架包含多个，至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个或更多个β链。本发明还提供含6个以上的多个环区域的本发明支架。在一个实施方式中，本发 明支架包含多个，至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个或更多个环区域。在一个实施方式中，本发明支架包含至少7个β链，其中所述β链从N-末端向 C-末端称为Α、B、C、D、E、F和G链。在另一实施方式中，本发明支架包含至少7个β链， 各链由环区域隔开，其中所述环区域从N-末端向C-末端称为AB、BC、CD、DE、EF和TO环。 在另一实施方式中，本发明支架包含少于7个β链，各链由环区域隔开。在另一实施方式 中，本发明支架包含少于7个β链，各链由环区域隔开。在另一具体实施方式
中，本发明支架包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、 至少5个、至少6个或至少7个β链，其中所述β链包含选自SEQ ID NO 228-234的氨基 酸序列。在另一具体实施方式
中，本发明支架包含至少7个β链，从N-末端向C-末端称 为A-G，其中所述A链包含SEQ ID Ν0:228所示序列。在另一具体实施方式
中，本发明支架 包含至少7个β链，从N-末端向C-末端称为A-G，其中所述B链包含SEQ ID NO 229所 示序列。在另一具体实施方式
中，本发明支架包含至少7个β链，从N-末端向C-末端称 为A-G，其中所述C链包含SEQ ID Ν0:230所示序列。在另一具体实施方式
中，本发明支架 包含至少7个β链，从N-末端向C-末端称为A-G，其中所述D链包含SEQ ID NO 231所 示序列。在另一具体实施方式
中，本发明支架包含至少7个β链，从N-末端向C-末端称 为A-G，其中所述E链包含SEQ ID Ν0:232所示序列。在另一具体实施方式
中，本发明支架 包含至少7个β链，从N-末端向C-末端称为A-G，其中所述F链包含SEQ ID NO 233所 示序列。在另一具体实施方式
中，本发明支架包含至少7个β链，从N-末端向C-末端称 为A-G，其中所述G链包含SEQ ID Ν0:234所示序列。在另一具体实施方式
中，本发明支架 包含具有SEQ ID NO 228所示序列的A链、具有SEQ ID NO 229所示序列的B链、具有SEQ ID NO :230所示序列的C链、具有SEQ ID NO :231所示序列的D链、具有SEQ ID Ν0:232所 示序列的E链、具有SEQ ID NO 233所示序列的F链和具有SEQ ID NO 234所示序列的G 链。在另一具体实施方式
中，本发明支架包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、 至少5个、至少6个或至少7个β链，其中所述β链包含选自SEQ ID NO :235、229、230、 236、232、237和234的氨基酸序列。在另一具体实施方式
中，本发明支架包含至少7个β 链，从N-末端向C-末端称为A-G，其中所述A链包含SEQ ID Ν0:235所示序列。在另一具 体实施方式中，本发明支架包含至少7个β链，从N-末端向C-末端称为A-G，其中所述B 链包含SEQ ID NO :229所示序列。在另一具体实施方式
中，本发明支架包含至少7个β链， 从N-末端向C-末端称为A-G，其中所述C链包含SEQ ID Ν0:230所示序列。在另一具体 实施方式中，本发明支架包含至少7个β链，从N-末端向C-末端称为A-G，其中所述D链 包含SEQ ID Ν0:236所示序列。在另一具体实施方式
中，本发明支架包含至少7个β链，从N-末端向C-末端称为A-G，其中所述E链包含SEQ ID N0:232所示序列。在另一具体 实施方式中，本发明支架包含至少7个β链，从N-末端向C-末端称为A-G，其中所述F链 包含SEQID Ν0:237所示序列。在另一具体实施方式
中，本发明支架包含至少7个β链，从 N-末端向C-末端称为A-G，其中所述G链包含SEQ ID Ν0:234所示序列。在另一具体实施 方式中，本发明支架包含具有SEQ ID NO :235所示序列的A链、具有SEQ ID NO :229所示 序列的B链、具有SEQ ID NO 230所示序列的C链、具有SEQ ID NO 236所示序列的D链、 具有SEQ ID NO :232所示序列的E链、具有SEQ ID NO :237所示序列的F链和具有SEQ ID NO 234所示序列的G链。在另一实施方式中，本发明支架包含与SEQ ID NO :1_32或68_99中任一所示同源 β链具有至少50%同源性的β链序列。在进一步的实施方式中，所述同源性是至少55%、 至少60 %、至少65 %、至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至 少99%或更高。连接蛋白质支架各链的环可作长度和/或序列多样性随机化。在一个实施方式 中，本发明支架的至少一个环作长度和/或序列多样性随机化。在另一实施方式中，本发明 支架的至少一个环维持恒定，而至少一个额外的环作长度和/或序列多样性随机化。在另 一实施方式中，本发明支架文库中环AB、CD和EF中至少一个维持恒定，而环BC、DE和TO中 至少一个作长度和/或序列多样性随机化。在一具体实施方式
中，本发明支架包含具有以下共有序列的随机化BC环 S-X-a-X-b-X-X-X-G，其中X表示任何氨基酸，其中(a)表示脯氨酸或丙氨酸，其中(b)表示 丙氨酸或甘氨酸。在一具体实施方式
中，本发明支架包含具有以下共有序列的随机化BC环 Α-d-P-X-X-X-e-f-X-I-X-G，其中X表示任何氨基酸，其中(d)表示脯氨酸、谷氨酸或赖氨 酸，其中(e)表示天冬酰胺或甘氨酸，和其中(f)表示丝氨酸或甘氨酸。在一具体实施方式
中，本发明支架包含BC环，其包含具有以下共有序列的11个氨 基酸S-P-c-X-X-X-X-X-X-T-G，其中X表示任何氨基酸，其中(c)表示脯氨酸、丝氨酸或甘 氨酸。在一具体实施方式
中，本发明支架包含具有以下共有序列的随机化re环 X-a-X-X-G-X-X-X-S，其中X表示任何氨基酸，其中(a)表示天冬酰胺、苏氨酸或赖氨酸。在一具体实施方式
中，本发明支架包含具有以下共有序列的随机化re环 X-a-X-X-X-X-b-N-P-A，其中X表示任何氨基酸，其中(a)表示天冬酰胺、苏氨酸或赖氨酸， 和其中(b)表示丝氨酸或甘氨酸。在一具体实施方式
中，本发明支架包含具有以下共有序列的随机化re环 X-a-X-X-G-X-X-S-N-P-A，其中X表示任何氨基酸，其中(a)表示天冬酰胺、苏氨酸或赖氨酸。在一具体实施方式
中，本发明文库包含具有DE环的支架，该环包含6个残基，并经 随机化而含有以下共有序列x-x-x-x-x-x，其中X表示任何氨基酸。在一具体实施方式
中，本发明支架包含含有7个残基的AB环，该环经随机化而含 有以下共有序列K-X-X-X-X-X-a，其中X表示天冬酰胺、天冬氨酸、组氨酸、酪氨酸、异亮氨 酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸或丝氨酸，其中(a)表示丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸或甘氨酸。在一具体实施方式
中，本发明支架包含含有9个残基的AB环，该环经随机化而含 有以下共有序列K-X-X-X-X-X-X-X-a，其中X表示天冬酰胺、天冬氨酸、组氨酸、酪氨酸、 异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸或丝氨酸，其中(a)表示丝氨 酸、苏氨酸、丙氨酸或甘氨酸。在一具体实施方式
中，本发明支架包含含有7、8或9个残基的⑶环，其中⑶环中 各残基经随机化，其中X表示天冬酰胺、天冬氨酸、组氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨 酸、苯丙氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸或丝氨酸。在一具体实施方式
中，本发明支架包含含有8个残基的EF环，该环经随机化而含 有以下共有序列X-b-L-X-P-X-c-X，其中X表示天冬酰胺、天冬氨酸、组氨酸、酪氨酸、异 亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸或丝氨酸，其中(b)表示天冬酰 胺、赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或甘氨酸，和其中(c)表示异亮氨酸、苏氨酸、丝氨 酸、缬氨酸、丙氨酸或甘氨酸。在一些实施方式中，本发明支架可包含约75-约500、约75-约200、约75-约100、 约75-约250或约75-约150个氨基酸。6. 2基于二硫键工程改造的支架的蛋白质为增加本发明支架的稳定性，采用生物信息学方法鉴定适于二硫键工程改造的候 选位置。然而，通过手工检查蛋白质结构来鉴定毗邻的候选残基对进行二硫键设计常因该 类键所要求的严格几何约束性而没有效果(参见Dombkowski，Bioinformatics (生物信息 学)第19卷第14号，2003 1852-1853)。因此，本发明提供在通过热耐受性，对离液变性作 用和蛋白酶处理检测到稳定性增加的位置具有工程改造的二硫键的支架。在一个实施方式中，本发明支架包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个或 至少五个非天然产生的二硫键。在一个实施方式中，本发明支架包含至少一个非天然产生 的二硫键，其中所述至少一个非天然产生的二硫键稳定该支架。在另一实施方式中，本发明 支架在两个β链之间包含至少一个非天然产生的二硫键。例如，所述至少一个非天然产生 的二硫键可在A链和B链之间，或在D链和E链之间，或在F链和G链之间，或在C链和F链 之间形成连接。在另一实施方式中，所述至少一个非天然产生的二硫键在F链和G链之间 形成第一键，在C链和F链之间形成第二连接。在另一实施方式中，本发明支架在两个环区 域之间包含至少一个非天然产生的二硫键。在另一实施方式中，本发明支架在环区域和β 链之间包含至少一个非天然产生的二硫键。在另一实施方式中，本发明支架在同一 β链内 包含至少一个非天然产生的二硫键。在另一实施方式中，本发明支架在同一环区域内包含 至少一个非天然产生的二硫键。在另一实施方式中，本发明支架包含至少一个非天然产生 的二硫键，其中该键位于两个不同支架间。在另一实施方式中，本发明支架包含形成至少二个、至少三个、至少四个或更多个 支架的多聚支架(术语“多聚”定义为有至少二个或更多个支架结合)的二硫键。不难通过本领域熟知的技术检测工程改造二硫键所致的稳定性增加，例如热(Tm) 和离液变性作用(例如，脲或胍)、蛋白酶处理(例如，嗜热菌蛋白酶)或本领域接受的另 一稳定性参数。用于检测蛋白质稳定性的技术的综述可见，例如"Current Protocols in Molecular Biology (最新分子生物学方法)〃和"CurrentProtocols in ProteinScience (最新蛋白质科学方法)"，约翰威利父子公司(JohnWiley and Sons)出版，2007。在一个实施方式中，与二硫键工程改造前的同一支架相比，通过热耐受性、对离液 变性作用、蛋白酶处理的耐受性或本领域熟知的另一稳定性参数检测到本发明的含二硫键 支架显示稳定性增加至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至 少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少 75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%或更多。可通过不同条件下蛋白质所显示的荧光水平检测蛋白质的稳定性。应激下蛋白质 的相对解折叠程度和蛋白质显示的固有荧光之间正相关。检测热特征的合适蛋白质稳定性 试验包括示差扫描量热法(DSC)和圆二色性(⑶)。当蛋白质显示通过DSC或⑶检测的参 数有相当大漂移时，其与解折叠结构相关，产生该漂移的温度称为解链温度(Tm)。在一个实 施方式中，与相同实验条件下工程改造前的同一支架所显示的相比，本发明的二硫键工程 改造支架显示解链温度(Tm)升高，至少高于45°C、至少高于50°C、至少高于55°C、至少高于 60°C、至少高于65°C、至少高于70°C、至少高于71°C、至少高于72°C、至少高于73°C、至少 高于74°C、至少高于75°C、至少高于76°C、至少高于77°C、至少高于78°C、至少高于79°C、 至少高于80°C、至少高于81°C、至少高于82°C、至少高于83°C、至少高于84°C、至少高于 851、至少高于851、至少高于861、至少高于871、至少高于881、至少高于891、至少高 于90°C、至少高于91°C、至少高于92°C、至少高于93°C、至少高于94°C、至少高于94°C、至 少高于95°C、至少高于96°C、至少高于97°C或至少高于98°C、或至少高于100°C、或至少高 于105°或至少高于110°、或至少高于120°。在另一实施方式中，与相同实验条件下二硫键工程改造前的同一支架相比，本发 明的二硫键工程改造支架显示解链温度(Tm)升高至少5%、至少10%、至少15%、至少 20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少 60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、或至少95%或更闻。蛋白质稳定性的另一试验包括将蛋白质接触用于使蛋白质内相互作用失稳定的 离液剂，量热脲或胍(例如，胍-HCl或异硫氰酸胍)。蛋白质接触水平升高的脲或胍后，检 测相对固有荧光来评估50%蛋白质分子解折叠时的数值。该值称为Cm值，表示蛋白质稳定 性的基准值。Cm值越高，蛋白质越稳定。在一个实施方式中，与相似实验条件下在脲变性实 验中检测的二硫键工程改造前的同一支架相比，本发明的二硫键工程改造支架显示Cm升高 至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至 少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少 85%、至少90%、或至少95%或更高。在另一实施方式中，与相似实验条件下在胍变性实验中检测的二硫键工程改造 前的同一支架相比，本发明的二硫键工程改造支架显示Cm升高至少5%、至少10%、至少 15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少 55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、或至少
95%或更高。用于测试蛋白质稳定性的另一试验是蛋白酶耐受性试验。在该试验中，蛋白质稳 定性的相对水平与一定时期内对蛋白酶降解作用的耐受性相关。越耐受蛋白酶处理，蛋白质越稳定。在一个实施方式中，与相似实验条件下在蛋白酶耐受性实验中检测的二硫键工 程改造前的同一支架相比，本发明的二硫键工程改造支架显示稳定性升高至少5%、至少 10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少 50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少 90%、或至少95%或更高。在一些例子中，优选利用稳定性降低的本发明支架，例如但不限于偶联于细胞毒 素或放射性核素的支架。这种支架可能要求非特异性毒性相关的更快清楚速度。在一个 实施方式中，本发明支架包含二硫键，与工程改造前的支架相比，该二硫键使得该支架去稳 定。在一个实施方式中，与相似实验条件下通过热耐受、对离液变性作用、蛋白酶处理的耐 受性或本领域熟知的另一稳定性参数检测的二硫键工程改造前的同一支架相比，含有二硫 键的本发明支架显示稳定性降低至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至 少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少 70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、或至少95%或更多。6. 3支架动力学本发明提供特异性结合靶标(例如，蛋白质)的支架。在一些实施方式中，所述靶 标可以是，例如但不限于细胞表面抗原、可溶性抗原、固定抗原、免疫静止抗原、胞内抗原、 核内抗原、自体抗原、非自体抗原、癌症抗原、细菌抗原或病毒抗原。在一些实施方式中，本发明支架以特定的动力学特异性结合靶标。在一些实施 方式中，通过BIAcore 试验或本领域已知的其它试验检测到本发明支架的结合率常数 或 k。n 比率(支架(Sc)+ 抗原(Ag) (k。n — Sc-Ag)为至少 IO5M-1 S-1、至少 1. 5X IO5MW至 少 2 X IO5M-1 S—1、至少 2. 5 X IO5IT1S人至少 5 X IO5IT1 s \ 至少 IO6M 1S \ 至少 5 X IO6M 1S \ 至 少IO7MW至少5X ΙΟΙ、—1、或至少IO8M-1 s-1、或者k。n比率为约IOV约IO8MW k。n比 率为约1. 5X IO5MY1-约IX IO7IT1 s入k。n比率为约2X IO5-约IX IO6MW k。n比率为约 4. 5 X IO5-约 5 X IO7M-1S^10在一些实施方式中，通过BIAcore 试验或本领域已知的其它试验检测到本发 明支架的k。ff比率(支架(Sc) +抗原(AgkoffBSc-Ag)为小于ΙΟ、—1、小于δΧΙΟ、—1、 小于ICT4S入小于2X ICT4S人小于5X ICT4S人小于l(T5s人小于5Χ l(T5s人小于1 (T6S人小 于δΧΙΟ、—1、小于川 人小于日父川 人小于ΙΟ、—1、小于5X ΙΟ、—1、小于ΙΟ、—1、小于 sxio、-1、或小于 ο—1、—1、或 lo-s-io-^Vuotio、-1、或 lOH1。在一些实施方式中，本发明支架的亲和力常数或Ka (k。n/k。ff)为至少IO2M4、 至少 5 X IO2IT1、至少 IO3IT1、至少 5 X IO3IT1、至少 IO4IT1、至少 5 X IO4IT1、至少 IO5IT1、 至少 5 X IO5IT1、至少 IO6IT1、至少 5 X IO6IT1、至少 IO7IT1、至少 5 X IO7IT1、至少 IO8IT1、至 少 5 X IO8IT1、至少 IO9IT1、至少 5 X IO9IT1、至少 IO10ITi、至少 5 X IO10ITi、至少 IO11ITi、至 少 5 X IO11ITi、至少 IO12IT1、至少 5 X IO12IT1、至少 IO13IT1、至少 5 X IO13IT1、至少 IO14IT1、 至少 5 X IO14IT1、至少 IO15IT1、或至少 5 X IO15IT1、或 102_5 X IO5IT1、IO4-I X IOiciIT1、或 IO5-IX IO8M-1.通过BIAcore 试验或本领域已知的其它试验检测到本发明支架的Ka可以 是最多 ΙΟ、—1、最多 δΧΙ ΑΓ1、最多 ΙΟΙ—1、最多 5 X ΙΟΙ—1、最多 IO13M.1、最多 5 X IO13M.1、最 多 IO14M-1、或最多 5 X IO14MA在一些实施方式中，通过BIAcore 试验或本领域已知的其它试验检测到本发明支架的解离常数或Kd(koff/kon)为小于10_5M、小于5 X 10_5M、小于10_6M、小于5 X 10_6M、 小于 1(Γ7Μ、小于 5X10〃、小于 1(Γ8Μ、小于 5Χ1(Γ8Μ、小于 1(Γ9Μ、小于 5Χ1(Γ9Μ、小于 1(Γ10Μ、 小于 5 X 1(Γ10Μ、小于 1(Γ"Μ、小于 5 X 1(Γ"Μ、小于 1(Γ12Μ、小于 5 X 1(Γ12Μ、小于 1(Γ13Μ、小于 5Χ1(Γ13Μ、小于 1(Γ14Μ、小于 5Χ1(Γ14Μ、小于 1(Γ15Μ、或小于 5 X 1(Γ15Μ。6. 4基于支架的结合蛋白的定向进化本文所述的支架可用于开发新型或改善的靶标结合蛋白的任何技术。在一个具体 实施例中，所述靶标固定在固体支持物，例如柱树脂或微量滴定板孔中，并且靶标与基于支 架的候选结合蛋白文库接触。这种文库可通过CDR-样环的序列和/或长度随机化，由基 于Τη3基序的支架构建的克隆构成。在一个实施方式中，该文库可以是噬菌体、噬菌粒、病 毒、细菌或酵母展示或核糖体展示文库。如果需要，该文库可以是通过，例如Szostak等， 美国专利号6，258，558Β1，美国专利号6，261，804Β1 ；美国专利号5，643，768和美国专利号 5，658，754所述的技术产生的RNA-蛋白质融合文库。或者，其可以是DNA-蛋白质文库(例 如，Lohse 于 1998 年 12 月 2 日提交的 DNA-Protein Fusions and Uses Thereof (DNA-蛋 白质融合及其应用)，美国系列号60/110，549，目前放弃；和1999年12月2日提交的美国 系列号09/453，190所述)。在这点上，细菌噬菌体(噬菌体)展示是能筛选大寡肽文库来鉴定那些文库中能 特异性结合靶标的成员的熟知技术。噬菌体展示是将变体多肽作为外壳蛋白的融合蛋白展 示在噬菌体颗粒表面上的技术(Scott, J. K.和Smith, G. P. (1990) Science 249 :386)。应 用噬菌体展示是基于以下事实，可快速而有效地保存选择性随机化蛋白质变体(或随机克 隆的cDNA)的大文库中以高亲和力结合靶分子的那些序列。现已采用在噬菌体上展示肽 (Cwirla, S. Ε.等，(1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA,87 6378)或蛋白质(Lowman，H.B.等， (1991)Biochemistry，3010832 ；Clackson, T.等(1991)Nature, 352624 ；Marks, J. D.等 (1991)，J. Mol. Biol.，222 581 ；Kang, A. S.等(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88 8363)文库来筛选数百万的多肽或寡肽中具有特异性结合特性的那些(Smith，G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol.，2 :668)。分选随机突变体的噬菌体文库需要构建和扩增大量 变体的方案，这是利用靶标受体的亲和力纯化方法和评估结合富集结果的手段(参见，例 如美国专利号 5，223，409，5，403，484，5，571，689 和 5，663，143)。虽然大多数噬菌体展示方法利用丝状噬菌体，但λ形噬菌体展示系统(W0 95/34683 ；美国专利号 5，627，024)、Τ4 噬菌体展示系统(Ren 等，Gene, 215 439(1998)； Zhu 等，Cancer Research, 58 (15) :3209_3214 (1998) Jiang 等，Infection& Immunity, 65(11) 4770-4777(1997) ；Ren 等，Gene, 195(2) :303_311 (1997) ；Ren, Protein Sci. ,5 1833(1996) ；Efimov 等，Virus Genes，10 173 (1995))和 T7 噬菌体展示系统(Smith 和 Scott, Methods in Enzymology, 217 228-257 (1993)；美国专利号 5，766，905)也是已知 的。现已开发可基础噬菌体展示概念的许多其它改进和改变形式。这些改进形式增 强了展示系统筛选肽文库以便结合所选靶分子和展示功能性蛋白质的能力，所述功能性蛋 白质可能筛选具有所需特性的这些蛋白质。现已开发了噬菌体展示反应的组合反应装置 (TO 98/14277)，噬菌体展示文库已用于分析和控制生物分子相互作用(W0 98/20169 ；WO 98/20159)和受约束螺旋肽的特性(W098/20036)。WO 97/35196描述了分离亲和配体的方法，其中将噬菌体展示文库与其中的配体会结合靶分子的一种溶液和其中的亲和配体不会 结合该靶分子的第二种溶液接触来选择性分离结合配体。WO 97/46251描述的方法用亲和 纯化的抗体生物淘选随机噬菌体展示文库，然后分离结合噬菌体，然后利用微量滴定板孔 通过微量淘选方法分离高亲和力结合噬菌体。利用金黄色葡萄球菌A蛋白作为亲和力标签 也已有报道(Li等· (1998)Mol Biotech.，9 :187)。W097/47314描述了利用底物扣除文库 区分酶特异性，该方法利用组合文库，所述文库可以是噬菌体展示文库。WO 97/09446描述 了采用噬菌体展示选择适用于洗涤剂中酶的方法。选择特异性结合蛋白质的其它方法描述 于美国专利号 5，498，538，5，432，018 和 WO 98/15833。美国专利号5，723，286，5，432，018，5，580，717，5，427，908，5，498，530， 5，770，434，5，734，018，5，698，426，5，763，192 和 5，723，323 也描述了产生肽文库和筛选这
些文库的方法。对于本发明的文库，采用生物信息学方法测定天然产生的Tn3结构基序的环长度 和多样性偏好(参见实施例2)。在该分析中，利用环长度和序列多样性的偏好开发“限制 性随机化(restricted randomization) ”方法。在该限制性随机化方法中，将相对环长度 和序列偏好引入文库开发方案。例如，测定到BC环的一种环长度偏好是9个残基。对含有 9个残基的BC环作进一步分析后，测定在该位置是否有特定氨基酸，或氨基酸组的偏好，或 者该位置是否完全随机。将环长度和序列多样性分析整合入文库开发产生了限制性随机化 (即，随机环内氨基酸可处于的某些位置是有限的)。实施例中描述了限制性随机化方法的 例子(参见实施例2)。本发明还提供包含本文所述本发明支架的文库(下文称为“本发明文库”)。在一 个实施方式中，本发明文库包含非天然产生的多肽支架，其包含与衍生自天然产生的蛋白 质序列的多个环区域序列相连的多个β链结构域，其中通过天然产生的蛋白质序列中相 应环序列的至少一个氨基酸的缺失、取代或添加而改变一个或多个所述环区域序列，其中 该多肽支架的β链结构域与天然产生蛋白质序列的相应结构域序列有至少50%同源性。 在一些实施方式中，天然产生的序列是对应于人结合腕蛋白C的蛋白质序列。在其它实施 方式中，天然产生的序列是对应于人结合腕蛋白C的额外Τη3结构基序的蛋白质序列。在其 它实施方式中，所述天然产生的序列是对应于另一结合腕蛋白，或者另一生物(例如但不 限于，鼠、猪、牛或马结合腕蛋白)的结合腕蛋白的Τη3结构基序的蛋白质序列。在还有另一 实施方式中，所述天然产生的序列是对应于任何生物的Τη3结构基序的蛋白质序列。在其 它实施方式中，所述天然产生的序列对应于嗜热生物的预测Τη3结构基序，例如但不限于 闪烁古生球菌、海葡萄嗜热菌、嗜酸热硫化叶菌、硫磺矿硫化叶菌和硫化叶菌。在还有另一 实施方式中，本发明支架具有的蛋白质序列与对应于上述Τη3结构基序或预测的Τη3结构 基序的任一序列具有至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至 少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至 少99%的同源性。将文库与固定的靶标温育，洗涤支持物以除去非特异性结合的物质，在非常严格 的条件下洗脱最紧密的结合物并进行PCR以回收序列信息或产生新的结合物文库，从而可 用于重复该选择过程，可进一步诱变或不诱变该序列。可进行多轮选择直至获得对抗原具 有足够亲和力的结合物。
在另一实施方式中，本发明文库包含本文所述支架。在一个实施方式中，本发明文 库包含的支架还包含至少7个β链，其中所述β链从N-末端向C-末端称为A、B、C、D、E、 F和G链。在另一实施方式中，本发明空位包含的支架还包含至少7个β链，各链由环区 域隔开，其中所述环区域从N-末端向C-末端称为AB、BC、⑶、DE、EF和TO环。在另一实施 方式中，本发明文库包含的支架还包含至少7个β链，从N-末端向C-末端称为A、B、C、D、 Ε、F和G链，各链由环区域相连，其中所述环区域从N-末端向C-末端称为AB、BC、⑶、DE、 EF禾口 FG环。在具体的实施方式中，本发明文库包含的支架还包含依据人结合腕蛋白C的Τη3 结构域的支架的一个或多个环区域，其包含以下氨基酸残基I. AB 环内所含的 12-17 ；II. BC 环内所含的 23-31 ；III. CD 环内所含的 39-45 ；IV. DE 环内所含的 50-56 ；V. EF环内所含的60-66 ；和VI. FG 环内所含的 75-84。在另一具体实施方式
中，本发明文库包含的支架还包含依据人结合腕蛋白C的 Τη3结构域的支架的一个或多个环区域，其包含以下氨基酸残基I. AB 环内所含的 11-17 ；II. BC 环内所含的 23-31 ；III. CD 环内所含的 39-45 ；IV. DE 环内所含的 51-56 ；V. EF环内所含的60-67 ；和VI. FG 环内所含的 75-84。本发明还提供包含支架的文库，所述支架包含环序列多样性。在一个实施方式中， 本发明文库包含具有至少一个环的支架，该环含有至少一个随机化的位置。在另一实施方 式中，本发明文库包含具有至少一个环的支架，该环含有至少一个随机化的位置，还含有至 少一个维持恒定的位置。在另一实施方式中，本发明文库包含具有环的支架，该环含有至少 一个经限制性随机化的位置。在另一实施方式中，本发明文库包含具有至少一个环的支架， 该环含有至少一个经限制性随机化的位置，还含有至少一个维持恒定的位置。在另一实施 方式中，本发明文库包含具有至少一个环的支架，该环含有至少一个经限制性随机化的位 置，还含有至少一个维持恒定的位置。连接蛋白质支架各链的环可作长度和/或序列多样性随机化。在一个实施方式 中，本发明文库具有含至少一个环的支架，该环作长度和/或序列多样性随机化。在另一实 施方式中，本发明文库具有的支架中至少一个环维持恒定，而至少一个额外的环作长度和/ 或序列多样性随机化。在另一实施方式中，本发明文库具有的支架中环AB、CD和EF中至少 一个、至少两个或所有三个维持恒定，而环BC、DE和re中至少一个、至少两个或所有三个作 长度和/或序列多样性随机化。在另一实施方式中，本发明文库具有的支架中环AB、CD和 EF中至少一个、至少两个或所有三个作随机化，而环BC、DE和TO中至少一个、至少两个或 所有三个作长度和/或序列多样性随机化。
在一具体实施方式
中，本发明文库所包含的支架包含具有以下共有序列的随机化 BC环S-X-a-X-b-X-X-X-G，其中X表示任何氨基酸，其中(a)表示脯氨酸或丙氨酸，其中 (b)表示丙氨酸或甘氨酸。在另一具体实施方式
中，本发明支架包含具有以下共有序列的随机化BC环 Α-d-P-X-X-X-e-f-X-I-X-G，其中X表示任何氨基酸，其中(d)表示脯氨酸、谷氨酸或赖氨 酸，其中(e)表示天冬酰胺或甘氨酸，和其中(f)表示丝氨酸或甘氨酸。在另一实施方式中，本发明文库具有BC环，其包含具有以下共有序列的11个氨基 酸S-P-c-X-X-X-X-X-X-T-G，其中X表示任何氨基酸，其中(c)表示脯氨酸、丝氨酸或甘氨 酸。在一具体实施方式
中，本发明文库所包含的支架包含具有以下共有序列的随机化 re环X-a-X-X-G-X-X-X-S，其中X表示任何氨基酸，其中(a)表示天冬酰胺、苏氨酸或赖氨酸。在另一具体实施方式
中，本发明文库所包含的支架包含具有以下共有序列的随机 化TO环X-a-X-X-X-X-b-N-P-A，其中X表示任何氨基酸，其中(a)表示天冬酰胺、苏氨酸或 赖氨酸，和其中(b)表示丝氨酸或甘氨酸。在一具体实施方式
中，本发明文库包含的支架包含具有以下共有序列的随机化re 环X-a-X-X-G-X-X-S-N-P-A，其中X表示任何氨基酸，其中(a)表示天冬酰胺、苏氨酸或赖氨酸。在一具体实施方式
中，本发明文库所包含的支架包含含有7个残基的AB环，该环 经随机化而含有以下共有序列K-X-X-X-X-X-a，其中X表示天冬酰胺、天冬氨酸、组氨酸、 酪氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸或丝氨酸，其中(a) 表示丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸或甘氨酸。在一具体实施方式
中，本发明文库所包含的支架包含含有9个残基的AB环，该环 经随机化而含有以下共有序列K-X-X-X-X-X-X-X-a，其中X表示天冬酰胺、天冬氨酸、组 氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸或丝氨酸，其中
(a)表示丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸或甘氨酸。在一具体实施方式
中，本发明文库所包含的支架包含含有7、8或9个残基的CD 环，其中CD环中各残基经随机化，其中X表示天冬酰胺、天冬氨酸、组氨酸、酪氨酸、异亮氨 酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸或丝氨酸。在一具体实施方式
中，本发明文库所包含的支架包含含有8个残基的EF环，该环 经随机化而含有以下共有序列X-b-L-X-P-X-c-X，其中X表示天冬酰胺、天冬氨酸、组氨 酸、酪氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸或丝氨酸，其中
(b)表示天冬酰胺、赖氨酸、丝氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或甘氨酸，和其中(c)表示异 亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸、缬氨酸、丙氨酸或甘氨酸。本发明的进一步实施方式是编码文库的分离核酸分子的集合，所述文库包含本发 明和上述的支架。设计这些Tn3文库的另一实际考虑是鉴定通常用于简并寡核苷酸中以编码任何 氨基酸的“NNK”(N = A，G，T，C;K = G，T)混合密码子方案的替代方案。虽然“ΝΝΚ”混合产生 能编码所有20种氨基酸的32种不同密码子，但它们不是等同编码的(表11)。例如，“ΝΝΚ”方案中3/32密码子编码Leu (CTG，CTT, TTG)，但只有1/32编码Asp (GAT)。此外，“NNK”混合 编码一个终止密码子(TAG)和Cys密码子(TGT)，当产生天然文库时，二者均不需要。考虑替 代方案时，我们注意到以下事实，即有人描述合成的抗体文库编码由小亚组的氨基酸构成 的CDR序列。其中CDR仅由4种氨基酸(Tyr，Ala，ASp，Ser)，或者甚至二元配对(Tyr，Ser) 构成的抗体文库显示能产生针对蛋白质抗原的特定高亲和力mAMFellouse等，Proc Natl Acad Sci，2004，101 12467-72，Fellouse 等· J. Mol. Biol.，2005，348 1153-62) 类似地， 仅包含Tyr和Ser的含随机化环序列的10Fn3支架蛋白的文库也产生针对靶蛋白的特异性 结合物(Koide等· ProcNatl Acad, Sci, 2007,104 :66_32_7)。虽然含有高度局限性氨基酸 组的文库能产生特异性结合蛋白，但从文库获得的结合物的多样性可能有限。因此，我们设 计了替代的“NHT”混合密码子方案以便在Tn3文库中引入多样性(H = A，T，C)。“NHT”混 合物编码20种氨基酸的合理亚组，但规避了 “NNK”混合密码子所述的不足(表12)。该方 案产生编码12/20氨基酸的12种密码子，S卩，各密码子编码独特的氨基酸。此外，其中没有 终止或Cys密码子。因此，在一些实施方式中，本发明支架包含NHT密码子方案编码的密码 子。在其它实施方式中，本发明支架包含NNK混合密码子方案所编码的密码子。在其它实施方式中，可对本发明支架进行亲和力成熟。在该本领域接受的方法中， 对特异性结合蛋白进行选择对特定靶标的亲和力是否增加的方案(参见Wu等.Proc Natl Aca Sci USA. 1998年5月26日；95(11) :6037_42)。得到的本发明支架可显示至少与亲和 力成熟前的支架一样高的结合特征。在其它实施方式中，可对本发明支架进行类似于抗体CDR嫁接的“环嫁接”。在该 本领域接受方法中，抗体的一个或多个CDR被“嫁接”到受者抗体上，或者，在此例中是本发 明支架(参见Ewert等.Methods :2004年10月；34(2) :184_99)。在另一实施方式中，可 将另一支架的至少一个环嫁接到本发明支架上。本发明还提供鉴定能结合靶标从而形成支架靶标复合物的蛋白质支架的氨基 酸序列的方法。在一个实施方式中，该方法包括以下步骤a)提供本发明的多肽展示文库； b)将(a)的多肽展示文库与固定或可分离的靶标接触；c)将支架靶标复合物与游离支架 相分离；d)复制(c)的分离支架从而产生因多样性降低和富集了能结合靶标的所展示支架 而不同于(a)中的新多肽展示文库；e)任选用(d)的新文库重复步骤(b)、(c)和(d)；和 f)测定编码(d)物质的所展示支架的区域的核酸序列，从而推测能结合靶标的肽序列。在另一实施方式中，文库筛选鉴定后，本发明支架可进一步随机化。在一个实施方 式中，本发明方法包括采用本文所述方法使得从文库鉴定的支架的至少一个、至少两个、至 少三个、至少四个、至少五个或至少六个环进一步随机化。在另一实施方式中，对进一步随 机化的支架进行后续方法以鉴定能结合靶标的支架，所述方法包括a)将所述进一步随机 化的支架与固定或可分离的靶标接触；b)将进一步随机化的支架靶标复合物与游离支架 相分离；c)复制(b)的分离支架，任选重复步骤(a)-(c)；和d)测定编码所述进一步随机化 的支架的区域的核酸序列，从而推测能结合靶标的肽序列。在进一步的实施方式中，进一步 随机化的支架包含以前在第一文库中进行随机化的至少一个、至少两个、至少三个、至少四 个、至少五个或至少六个随机化的环。在其它进一步的实施方式中，所述进一步随机化的支 架包含以前未在第一文库中进行随机化的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少 五个或至少六个随机化的环。
在另一实施方式中，文库筛选鉴定后，本发明支架可进一步随机化。在一个实施 方式中，本发明方法包括采用本文所述方法使得从文库鉴定的支架的至少一个、至少两个、 至少三个、至少四个、至少五个、至少六个或至少七个链环进一步随机化。在另一实施方式 中，对进一步随机化的支架进行后续方法以鉴定能结合靶标的支架，所述方法包括a)将所 述进一步随机化的支架与固定或可分离的靶标接触；b)将进一步随机化的支架靶标复合 物与游离支架相分离；c)复制(b)的分离支架，任选重复步骤(a)-(c)；和d)测定编码所述 进一步随机化的支架的区域的核酸序列，从而推测能结合靶标的肽序列。在进一步的实施 方式中，进一步随机化的支架包含以前在第一文库中进行随机化的至少一个、至少两个、至 少三个、至少四个、至少五个、至少六个或至少七个随机化的链。在其它进一步的实施方式 中，所述进一步随机化的支架包含以前未在第一文库中进行随机化的至少一个、至少两个、 至少三个、至少四个、至少五个、至少六个或至少七个随机化的链。在另一实施方式中，文库筛选鉴定后，本发明支架可进一步随机化。在一个实施方 式中，本发明方法包括采用本文所述方法使得从文库鉴定的支架的至少一个、至少两个、至 少三个、至少四个、至少五个或至少六个和至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少 五个、至少六个或至少七个链环进一步随机化。在另一实施方式中，对进一步随机化的支架 进行后续方法以鉴定能结合靶标的支架，所述方法包括a)将所述进一步随机化的支架与 固定或可分离的靶标接触；b)将进一步随机化的支架靶标复合物与游离支架相分离；C) 复制(b)的分离支架，任选重复步骤(a)-(c)；和d)测定编码所述进一步随机化的支架的 区域的核酸序列，从而推测能结合靶标的肽序列。在进一步的实施方式中，进一步随机化的 支架包含以前在第一文库中进行随机化的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少 五个或至少六个随机化的环和至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六 个或至少七个链。在其它进一步的实施方式中，所述进一步随机化的支架包含以前未在第 一文库中进行随机化的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个随 机化的环和至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个或至少七个链。在另一实施方式中，获得本发明支架的一种方法包括选自BC、DE或TO环的第一随 机化环和未在所述文库中作随机化的选自AB、CD或EF环的第二环。在还有另一实施方式 中，获得本发明支架的另一方法包括选自AB、CD或EF环的第一随机化环和未在所述文库中 作随机化的选自BC、DE或re环的第二环。本发明还提供获得结合至少一种或更多种靶标的至少两种支架的方法。该方法 能筛选共同起作用而引发特定反应的试剂。当需要激动活性，而激动活性需要多种支架协 作时(例如但不限于，受体酪氨酸激酶的激动作用)，优选采用这种筛选。该方法能筛选 协作性试剂而无需重新设计文库来形成多聚复合物。在一个实施方式中，本发明方法包括 在允许支架靶配体复合物形成的条件下将靶配体与本发明文库接触，将所述支架与交联 剂(定义为将至少两个相同或不同的支架紧密结合在一起的试剂)结合，其中所述支架的 交联引发可检测的反应，以及从该复合物获得结合靶标的所述支架。在进一步的实施方式 中，所述交联剂是支架特异性抗体，或其片段，表位标签特异性抗体或其片段，二聚体化功 能域，例如Fc区，亮氨酸拉链基序，化学交联剂或本领域已知的另一二聚体化功能域。本发明还提供利用本发明支架检测化合物的方法。依据通过文库筛选所得支架的 结合特异性，可能在试验中利用这种支架检测样品中的特异性靶标，例如用于诊断方法。在一个实施方式中，检测化合物的方法包括在允许化合物支架复合物形成的条件下将样品 中的所述化合物与本发明支架接触并检测所述支架，从而检测样品中的所述化合物。在进 一步的实施方式中，对支架作标记(即，放射性标记、荧光、酶联或比色标记)以促进检测所 述化合物。本发明还提供利用本发明支架捕捉化合物的方法。依据通过文库筛选所得支架的 结合特异性，可能在试验中利用这种支架捕捉样品中的特异性靶标，例如用于纯化方法。在 一个实施方式中，捕捉样品中化合物的方法包括在允许化合物支架复合物形成的条件下 将样品中的所述化合物与本发明支架接触并从样品中除去所述复合物，从而捕捉所述样品 中的所述化合物。在进一步的实施方式中，所述支架固定以促进除去化合物支架复合物。在一些实施方式中，从本发明文库分离的支架包含至少一个、至少两个、至少四 个、至少五个、至少六个或更多个随机化的环区域。在一些实施方式中，分离的支架环序列 可从供者支架交换至受者支架的任何环(例如，供者支架的AB环序列可转移至受者支架中 的任何环区域)。在具体的实施方式中，可将分离的环序列转移至受者支架中的同源环(例 如，供者支架的AB环序列可转移至受者支架中的AB环位置)。在一些实施方式中，分离的 环序列可以与各种受者支架随机“混合和匹配”。在其它实施方式中，可通过环序列鉴定分离的支架序列。例如，利用文库对特定靶 标进行淘选，分离特异性结合物的集合。随机化环序列的特征在于不依赖支架背景的特定 序列(即，结合靶标X的支架，其中所述支架包含SEQ IDNO :x所示的AB环序列)。在支架 显示结合靶标X的两个环序列的其它实施方式中，所述环序列的特征在于没有支架序列存 在下结合靶标X。换言之，考虑到可将从结合特定靶标的文库分离的支架表达为不依赖支架 主链而结合该靶标的可变环序列。该方法类似于抗体可变区中CDR的概念。在一些实施方式中，本发明提供包含特异性结合SYNAGIS 的序列的支架。在这 种实施方式中，特异性结合SYNAGIS 的本发明支架可包含选自SEQID NO 100、102、105、 107或109的BC环序列。在其它实施方式中，特异性结合SYNAGIS 的本发明支架可包含 选自SEQ ID NO :101、103、104、106、108、或110的TO环序列。在进一步的实施方式中，特 异性结合SYNAGIS 的本发明支架可包含选自SEQ ID NO :100、102、105、107、或109的至 少一个BC环序列；还可包含选自SEQ ID NO :101、103、104、106、108、或110的至少一个FG 环序列。在其它实施方式中，本发明还可包含与特异性结合SYNAGIS 的支架竞争结合的 支架，所述SYNAGIS 结合物包含选自SEQ IDNO :100、102、105、107、或 109 的一个BC环序列；还包含选自 SEQ ID N0:101、103、 104、106、108、或110的TO环序列。可如本文在实施例11和/或14中所示，或通过本领域 已知的其它试验进行竞争性试验。在一些实施方式中，本发明提供包含特异性结合溶菌酶的序列的支架。在这种实 施方式中，特异性结合溶菌酶的本发明支架可包含选自SEQ ID N0:lll、114、102、120或 124的至少一个BC环序列。在其它实施方式中，特异性结合溶菌酶的本发明支架可包含选 自 SEQ ID NO :112、113、115、116、117、118、119、121、122、或 125 的至少一个 FG 环序列。在 进一步的实施方式中，特异性结合溶菌酶的本发明支架可包含选自SED ID N0:lll、114、 102、120、或 124 的至少一个 BC 环序列；还可包含选自 SEQ ID NO :112、113、115、116、117、 118、119、121、122、或125的至少一个TO环序列。在其它实施方式中，本发明还可包含与特异性结合溶菌酶的支架竞争结合的支架，所述溶菌酶结合物包含选自SED ID N0:lll、114、 102、120、或 124 的至少一个 BC 环序列；还包含选自 SEQ ID NO :112、113、115、116、117、118、 119、121、122、或125的至少一个!7G环序列。可如本文在实施例11和/或14中所示，或通 过本领域已知的其它试验进行竞争性试验。6. 5多聚支架除了支架单体，可将本文所述的任何支架构建物制备成支架二聚体或多聚体，作 为增加化合价和由此导致的抗原结合亲合力的手段。还可本文所述的任何支架构建物制备 成支架的二聚体或多聚体，从而作为增加抗原结合特异性的手段(例如，可制备结合不同 抗原的支架)。可通过各支架模块之间的共价结合，例如通过包含入氨基酸接头来产生这种 多聚体(多聚支架或者本文也称为多价支架)。在其它方法中，可利用本领域已知的二聚体 化功能域装配多聚支架。在具体实例中，可通过构建编码单体支架的融合基因，或者通过工 程改造密码子将半胱氨酸残基掺入单体序列并在表达产物之间形成二硫键来产生共价结 合的支架。还可通过各种技术产生非共价结合的多聚支架。这些技术包括在单体序列中引入 对应于荷正电和/或负电残基的密码子并使得表达产物中这些残基之间(和由此的单体之 间)相互作用。利用单体亚单位中天然存在的荷电残基可简化该方法。产生非共价结合支 架的另一方法是在单体支架基因中(例如，在氨基或羧基末端)引入已知相互作用的蛋白 质或蛋白质结构域的编码序列。这种蛋白质或蛋白质结构域包括卷曲螺旋基序、亮氨酸拉 链基序和已知指导二聚体或高级多聚体形成的许多蛋白质亚单位(或其片段)中的任一 种。在一些实施方式中，本发明的多聚支架包含融合于抗体的任何结构域(或片段) 的至少一个支架。在一些实施方式中，至少一个支架融合于抗体可变区、CHl结构域、Ck结 构域、C λ结构域、CH2或CH3结构域。在其它实施方式中，至少一个支架融合于抗体Fc的 CH2结构域。在这种实施方式中，表达时，通过抗体Fc片段的CH2和CH3区二聚化而得到的 蛋白质对于特定靶标是二价的。在进一步实施方式中，本发明支架替代与Fc片段相连的抗 体可变区。在其它实施方式中，本发明支架不替代与CHl-Fc片段、Ck结构域或CX结构 域相连的抗体可变区。在进一步的实施方式中，通过将支架融合于抗体的CHl和CK或CX区来构建多 聚支架。在一些实施方式中，本发明支架替代融合于抗体的CHl和Ck或CX区的抗体可 变区。在进一步的实施方式中，本发明支架可融合于抗体轻链或重链的C-末端。在其它实 施方式中，本发明支架可融合于抗体轻链或重链的N-末端。在一些实施方式中，本发明的多聚支架包含对同一表位具有特异性的多个支 架。在其它实施方式中，本发明的多聚支架包含对不同表位具有特异性的多个支架，或称 为表位结合结构域。可如出于所有目的通过引用全文纳入本文的2008年7月30日提交 的美国申请系列号 12/182，975〃 Multispecific epitopebinding proteins and uses thereof (多特异性表位结合蛋白及其应用)"所示装配和使用本发明的多聚支架。可从抗 体、抗体片段、双抗体、scFv.Fab.Fv或结合肽选择这种表位结合结构域。在其它实施方式中，与本发明支架的一样，表位结合结构域对相同靶标具有特异 性。
在另一实施方式中，与本发明支架的一样，表位结合结构域对不同靶标具有特异 性。为连接两个或更多个支架的具体情况选择合适的接头取决于各种参数，包括，例 如单体结构域的性质和/或肽接头对蛋白水解和氧化的稳定性。接头多肽可主要包含选自Gly、Ser、Ala或Thr的氨基酸残基。例如，肽接头含有的 至少75% (根据肽接头中存在的残基总数计算)，例如至少80%，如至少85%或至少90% 的氨基酸残基可选自Gly、Ser、Ala或Thr。肽接头还可仅由Gly、Ser、Ala和/或Thr残基 构成。接头多肽应具有足以连接两个或更多个本发明单体结构域或两个或更多个本发明多 聚支架的长度，如此它们彼此能采取正确的构象，从而保留所需活性。为该目的，合适的长度是至少一个，通常少于约50个氨基酸残基，例如2-25氨基 酸残基、5-20氨基酸残基、5-15氨基酸残基、8-12氨基酸残基或11个残基。类似地，多肽编 码接头大小可以是，例如约2-约15氨基酸、约3-约15、约4-约12、约10、约8或约6氨基 酸。在涉及核酸，例如DNA、RNA或二者的组合的方法和组合物中，含有接头序列的多核苷酸 可以是，例如约6个核苷酸-约45个核苷酸、约9个核苷酸-约45个核苷酸、约12个核苷 酸-约36个核苷酸、约30个核苷酸、约24个核苷酸或约18个核苷酸。类似地，选择包含 入接头多肽的氨基酸残基应显示不明显干扰多肽多聚体的活性或功能的特性。因此，肽接 头整体上应不显示电荷，电荷与多肽多聚体的活性或功能不一致，会干扰内部折叠，或与一 个或多个单体结构域中的氨基酸残基形成键或其它相互作用从而严重阻碍多肽多聚体结 合特异性靶标。还可从文库选择肽接头，其中该肽接头中的氨基酸残基为特定多肽多聚体中特定 组的单体结构域作随机化。可利用柔性接头发现单体结构域的合适组合，然后利用可变接 头的这种随机文库优化以获得具有最佳长度和几何特征的接头。最佳接头可含有参与结合 靶标并在不结合特定靶标时约束单体结构域在多肽多聚体中相对彼此运动的类型正确的
最低数量氨基酸残基。利用天然产生以及人工肽接头将多肽连接入新型连接的融合多肽是参考文献中 熟知的(Hallewell 等· (1989)，J. Biol. Chem. 264,5260-5268 ；Alfthan等.(1995),Protein Eng.8,725-731 ；Robinson 禾口 Sauer(1996) , Biochemistry 35,109-116 ；Khandekar 等· (1997)，J.Biol.Chem. 272,32190-32197 ；Fares 等· (1998)，Endocrinology 139， 2459-2464 ；SmalIshaw 等· (1999)，Protein Eng. 12，623-630 ；美国专利号 5，856，456)。如上所述，通常优选肽接头具有至少一定的柔韧性。因此，在一些实施方式中，肽 接头含有1-25个甘氨酸残基、5-20个甘氨酸残基、5-15个甘氨酸残基或8_12个甘氨酸残 基。肽接头通常含有至少50%甘氨酸残基，例如至少75%甘氨酸残基。在本发明的一些实 施方式中，肽接头只包含甘氨酸残基。在具体的实施方式中，接头序列可包含(G-G-G-G-S)x 所示序列，其中χ是正整数。在另一具体实施方式
中，接头序列可包含(G-A)x所示序列，其 中χ是正整数。在另一具体实施方式
中，接头序列可包含(G-G-G-T-P-T),所示序列，其中χ 是正整数。在一些情况中，优选或需要在肽接头中提供一定的刚性。这可通过在肽接头的氨 基酸序列中包含脯氨酸残基来实现。因此，在本发明的另一实施方式中，肽接头在其氨基 酸序列中可包含至少一个脯氨酸残基。例如，肽接头的氨基酸序列中至少25%，例如至少本发明的一个特定实施方式中，肽接头只 包含脯氨酸残基。在本发明的一些实施方式中，修饰肽接头从而引入包含用于非多肽部分的连接基 团的氨基酸残基。这种氨基酸残基的例子可以是半胱氨酸残基(随后连接非多肽部分)或 者该氨基酸序列可在体内包含N-糖基化位点(从而将糖部分连接(体内)于肽接头)。其 它选择是利用设计的tRNA和tRNA合成酶将非天然氨基酸遗传学掺入(参见，例如美国申 请公布系列号2003/0082575)多肽结构域或接头。例如，插入酮基-酪氨酸能位点特异性 地偶连于表达的单体结构域或多聚体。多肽多聚体中存在的所有肽接头的氨基酸序列有时相同。或者，多肽多聚体中存 在的所有肽接头的氨基酸序列可以不同。6. 6 融合本文所述支架可融合于其它蛋白质结构域。例如，可经N或C-末端融合IgG的恒 定区(Fc)与支架而整合这些支架与人免疫反应。Fc融合分子活化免疫反应的补体组分并 提高蛋白质支架的治疗价值。类似地，支架和补体蛋白，例如Clq之间融合可用于靶向细 胞，支架和毒素之间的融合可用于特异性破坏携带特定抗原的细胞。此外，各种出版物描述了获得生理活性分子的方法，其半衰期通过在该分子中 引入FcRn-结合多肽(W0 97/43316 ；美国专利号5，869，046 ；美国专利号5，747，035 ；W0 96/32478 ；W0 91/14438)或通过融合分子与保留FcRn-结合亲和力但对其它Fc受体的亲 和力极大降低的抗体(W0 99/43713)或与抗体的FcRn结合结构域融合(W0 00/09560 ；美 国专利号4，703，039)而得到修饰。增加生理活性分子半衰期的具体技术和方法还可见 于2006年8月1日授权的美国专利号7，083，784，名为〃 Antibodies with Increased Half-lives (半衰期增加的抗体)"，该篇专利出于所有目的通过引用纳入本文。具体地 说，考虑到本发明支架可融合于IgG的Fc区，其中所述Fc区包含氨基酸残基突变(如Kabat 的 EU 指数编号):M252Y/S254T/T256E 或 H433K/N434F/Y436H。此外，本发明支架可与增加或延长体内或血清半衰期的分子融合。在一些实施方 式中，本发明支架与白蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)、聚乙二醇(PEG)、多糖、免疫球蛋白 分子(IgG)、补体、血红蛋白、结合肽、脂蛋白和其它因子缔合以增加其在血流中的半衰期或 其组织穿透性。可通过标准技术，例如从利用公众可得的基因序列构建的重组融合基因表 达融合蛋白来制备这些融合体。本发明支架还可与增加或延长体内或血清半衰期的分子结合或缔合。在一些实施 方式中，本发明支架与白蛋白、聚乙二醇(PEG)、多糖、免疫球蛋白分子或具有增加血清半衰 期的Fc突变的免疫球蛋白分子、补体、血红蛋白、脂蛋白和其它因子缔合以增加血清半衰 期。可通过标准技术，例如从利用公众可得的基因序列构建的重组融合基因表达融合蛋白 来制备这些融合体。术语“聚乙二醇”或“PEG”表示含或不含偶联剂、偶连或活化部分(例如，含巯 基、三氟甲磺酸根、三氟乙基磺酸根(tresylate)、氮丙啶、环氧乙烷、N-羟基琥珀酰亚 胺或马来酰亚胺部分)的聚乙二醇化合物或其衍生物。术语“PEG”应表示分子量介于 500-150, OOODa之间的聚乙二醇，包括其类似物，其中例如末端0H-基团被甲氧基取代(称 为 mPEG)。
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在一个实施方式中，用聚乙二醇(PEG)衍生支架。PEG是含有两个末端羟基的环 氧乙烷重复单位的线形、水溶性聚合物。PEG根据其分子量分类，其分子量通常为约500 道尔顿到约40，000道尔顿。在目前优选的实施方式中，所用的PEG的分子量是5，000道 尔顿到约20，000道尔顿。偶连于本发明支架的PEG可以是支化或非支化的(参见，例 如 Monfardini，C.等.1995Bioconjugate Chem6 62-69)。PEG 可从耐卡塔公司(Nektar Inc.)、西格玛化学品公司(Sigma ChemicalCo.)和其它公司商品化购得。这种PEG包括但 不限于单甲氧基聚乙二醇(MePEG-OH)、单甲氧基聚乙二醇-琥珀酸酯(MePEG_S)、单甲氧 基聚乙二醇-琥珀酰亚胺琥珀酸酯(MePEG-S-NHS)、单甲氧基聚乙二醇-胺(MePEG_NH2)、 单甲氧基聚乙二酉享-三氟乙基磺酸酉旨(monomethoxypolyethyleneglycol-tresylate) (MePEG-TRES)和单甲氧基聚乙二醇-咪唑基-羰基(MePEG-IM)。简言之，在一个实施方式中，通过无反应活性的基团，例如甲氧基或乙氧基对 所用亲水性聚合物，例如PEG的一端封端。随后，通过与合适的活化剂反应而活化该 聚合物的另一端，所述活化剂是例如三聚氰酰卤(例如，三聚氰酰氯、溴或氟)、二咪唑 (diimadozle)、酐试剂(例如，二卤代琥珀酸酐，如二溴代琥珀酸酐)、酰叠氮、对二唑鐺苄 基SI (p-diazoiumbenzyl ether)、3_ (对坐金翁苯氧基(p_diazoniumphenoxy)) p圣基丙 基醚)等。然后活化的聚合物与本文所述多肽反应产生用聚合物衍生的多肽。或者，可活 化本发明支架中的官能团以便与聚合物反应，或者可采用已知的偶连方法在协调偶连反应 中连接两个基团。不难知道可采用本领域技术人员已知和使用的多种其它反应方案以PEG 衍生本发明多肽。在一些实施方式中，工程改造本发明支架以提供用于偶连的反应活性基团。在这 种支架中，N-末端和/或C-末端还可用于提供用于偶连的反应活性基团。在其它实施方 式中，N-末端可偶连于一个部分(例如但不限于PEG)，而C-末端偶连于另一部分(例如但 不限于生物素)，反之亦然。术语“体内半衰期”以其常规意义使用，即，身体/靶器官中存在多肽的50%生物 学活性的时间，或者多肽活性是其初始值的50%的时间。作为测定功能性体内半衰期的替 代方案，可测定“血清半衰期”，即，清除前50%多肽分子在血浆或血流中循环的时间。测定 血清半衰期常比测定功能半衰期简单，血清半衰期的幅度常是功能性体内半衰期幅度的良 好指示。血清半衰期的其它术语包括血浆半衰期、循环半衰期、循环性半衰期、血清清除率、 血浆清除率和清除半衰期。待保留的功能通常选自促凝血、蛋白水解、辅因子结合、受体结 合活性或特定蛋白质相关的其它类型生物学活性。与功能性体内半衰期或血浆半衰期有关的术语“增加”用于表示与参比分子(例 如，未修饰的多肽)相比，在可比条件下测得多肽的相关半衰期统计学显著地增加。例如， 与未修饰的参比分子相比，相关半衰期可增加至少约25%，例如至少约50%，如至少约 100%、至少约150%、至少约200%、至少约250%或至少约500%。在其它实施方式中，与 未修饰的参比分子相比，半衰期可增加约至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5 倍、至少10倍、至少20倍、或至少50倍。6. 7随机化实施方式在一方面，本发明提供随机化支架。在另一实施方式中，本发明还提供多聚随机化 支架。在另一实施方式中，本发明还提供二硫键工程改造的随机化支架。在还有另一实施方式中，本发明提供包含随机化支架的文库。下文提供了本发明支架和包含所述支架的展 示文库的随机化方案，在本节中统称为“本发明”。在一个实施方式中，本发明支架包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5或至少6 个随机化环。在另一实施方式中，本发明包含至少一个随机化环，其中至少AB、或至少BC、 或至少⑶、或至少DE、或至少EF、或至少TO环随机化。在一个实施方式中，本发明包含一个随机化的环。例如，本发明包含随机化的AB 环。在另一实施方式中，本发明包含随机化的BC环。在另一实施方式中，本发明包含随机 化的CD环。在另一实施方式中，本发明包含随机化的DE环。在另一实施方式中，本发明包 含随机化的EF环。在另一实施方式中，本发明包含随机化的re环。在一个实施方式中，本发明包含两个随机化的环。例如，本发明包含随机化的AB 和BC环。在另一实施方式中，本发明包含随机化的AB和CD环。在另一实施方式中，本发 明包含随机化的AB和DE环。在另一实施方式中，本发明包含随机化的AB和EF环。在另 一实施方式中，本发明包含随机化的AB和re环。在另一实施方式中，本发明包含随机化的 BC和CD环。在另一实施方式中，本发明包含随机化的BC和DE环。在另一实施方式中，本 发明包含随机化的BC和EF环。在另一实施方式中，本发明包含随机化的BC和TO环。在另 一实施方式中，本发明包含随机化的CD和DE环。在另一实施方式中，本发明包含随机化的 CD和EF环。在另一实施方式中，本发明包含随机化的CD和TO环。在另一实施方式中，本 发明包含随机化的DE和EF环。在另一实施方式中，本发明包含随机化的DE和TO环。在 另一实施方式中，本发明包含随机化的EF和re环。在另一实施方式中，本发明包含三个随机化的环。例如，在一个实施方式中，本发 明包含随机化的AB、BC和⑶环。在另一实施方式中，本发明包含随机化的AB、BC和DE环。 在另一实施方式中，本发明包含随机化的AB、BC和EF环。在另一实施方式中，本发明包含 随机化的AB、BC和TO环。在另一实施方式中，本发明包含随机化的AB、CD和DE环。在另 一实施方式中，本发明包含随机化的AB、⑶和EF环。在另一实施方式中，本发明包含随机 化的AB、⑶和TO环。在另一实施方式中，本发明包含随机化的AB、DE和EF环。在另一实 施方式中，本发明包含随机化的AB、DE和TO环。在另一实施方式中，本发明包含随机化的 AB、EF和TO环。在另一实施方式中，本发明包含随机化的BC、⑶和DE环。在另一实施方式 中，本发明包含随机化的BC、⑶和EF环。在另一实施方式中，本发明包含随机化的BC、⑶ 和TO环。在另一实施方式中，本发明包含随机化的BC、DE和EF环。在另一实施方式中，本 发明包含随机化的BC、DE和TO环。在另一实施方式中，本发明包含随机化的BC、EF和TO 环。在另一实施方式中，本发明包含随机化的CD、DE和EF环。在另一实施方式中，本发明 包含随机化的⑶、DE和re环。在另一实施方式中，本发明包含随机化的⑶、EF和re环。 在另一实施方式中，本发明包含随机化的DE、EF和TO环。在另一实施方式中，本发明包含四个随机化的环。在另一实施方式中，本发明包含 随机化的AB、BC、⑶和DE环。在另一实施方式中，本发明包含随机化的AB、BC、⑶和EF环。 在另一实施方式中，本发明包含随机化的AB、BC、CD和TO环。在另一实施方式中，本发明 包含随机化的AB、⑶、DE和EF环。在另一实施方式中，本发明包含随机化的AB、⑶、DE和 re环。在另一实施方式中，本发明包含随机化的AB、CD、EF和re环。在另一实施方式中， 本发明包含随机化的AB、DE、EF和TO环。在另一实施方式中，本发明包含随机化的BC、⑶、DE和EF环。在另一实施方式中，本发明包含随机化的BC、⑶、DE和TO环。在另一实施方 式中，本发明包含随机化的BC、DE、EF和TO环。在另一实施方式中，本发明包含随机化的 CD、DE、EF 禾口 FG 环。在另一实施方式中，本发明包含五个随机化的环。在另一实施方式中，本发明包含 随机化的AB、BC、CD、DE，和EF环。在另一实施方式中，本发明包含随机化的AB、BC、CD、DE， 和re环。在另一实施方式中，本发明包含随机化的AB、⑶、DE、EF和re环。在另一实施方 式中，本发明包含随机化的AB、BC、DE、EF和TO环。在另一实施方式中，本发明包含随机化 的AB、BC、⑶、EF，和TO环。在另一实施方式中，本发明包含随机化的BC、⑶、DE、EF和TO 环。在另一实施方式中，本发明包含六个随机化的环。在一个实施方式中，本发明包含 随机化 AB、BC、CD、DE、EF 禾口 FG 环。在一具体实施方式
中，本发明包含三个随机化的环，其中BC、DE、和TO环均随机 化。在另一实施方式中，本发明包含至少一个随机化的环，其中至少AB、至少⑶、至少EF环 随机化。在一具体实施方式
中，本发明包含三个随机化的环，其中AB、CD、和EF环均随机化。 在另一具体实施方式
中，本发明包含随机化的环，其中AB、BC、CD、DE、EF、和TO环均随机化。在另一实施方式中，本发明包含随机化的环，其中至少一个、或至少两个、或至少 三个、或至少四个、或至少五个、或至少六个环未随机化。在一个实施方式中，本发明包含至少一个随机化的环，其中一个环未随机化。在一 个实施方式中，本发明包含至少一个随机化的环，其中AB环未随机化。在另一实施方式中， 本发明包含至少一个随机化的环，其中BC环未随机化。在另一实施方式中，本发明包含至 少一个随机化的环，其中CD环未随机化。在另一实施方式中，本发明包含至少一个随机化 的环，其中DE环未随机化。在另一实施方式中，本发明包含至少一个随机化的环，其中EF 环未随机化。在另一实施方式中，本发明包含至少一个随机化的环，其中re环未随机化。在另一实施方式中，本发明包含至少一个随机化的环，其中两个环未随机化。在一 个实施方式中，本发明包含至少一个随机化的环，其中至少AB和BC环未随机化。在另一实 施方式中，本发明包含至少一个随机化的环，其中至少AB和CD环未随机化。在另一实施方 式中，本发明包含至少一个随机化的环，其中至少AB和DE环未随机化。在另一实施方式中， 本发明包含至少一个随机化的环，其中至少AB和EF环未随机化。在另一实施方式中，本发 明包含至少一个随机化的环，其中至少AB和re环未随机化。在另一实施方式中，本发明包 含至少一个随机化的环，其中至少BC和⑶环未随机化。在另一实施方式中，本发明包含至 少一个随机化的环，其中至少BC和DE环未随机化。在另一实施方式中，本发明包含至少一 个随机化的环，其中至少BC和EF环未随机化。在另一实施方式中，本发明包含至少一个随 机化的环，其中至少BC和re环未随机化。在另一实施方式中，本发明包含至少一个随机化 的环，其中至少⑶和DE环未随机化。在另一实施方式中，本发明包含至少一个随机化的环， 其中至少⑶和EF环未随机化。在另一实施方式中，本发明包含至少一个随机化的环，其中 至少⑶和re环未随机化。在另一实施方式中，本发明包含至少一个随机化的环，其中至少 DE和EF环未随机化。在另一实施方式中，本发明包含至少一个随机化的环，其中至少DE和 re环未随机化。在另一实施方式中，本发明包含至少一个随机化的环，其中至少EF和re环 未随机化。
在另一实施方式中，本发明包含至少一个随机化的环，其中三个环未随机化。在另 一实施方式中，本发明包含至少一个随机化的环，其中至少AB、BC和⑶环未随机化。在另 一实施方式中，本发明包含至少一个随机化的环，其中至少AB、BC和DE环未随机化。在另 一实施方式中，本发明包含至少一个随机化的环，其中至少AB、BC和EF环未随机化。在另 一实施方式中，本发明包含至少一个随机化的环，其中至少AB、BC和re环未随机化。在另 一实施方式中，本发明包含至少一个随机化的环，其中至少AB、⑶和DE环未随机化。在另 一实施方式中，本发明包含至少一个随机化的环，其中至少AB、⑶和EF环未随机化。在另 一实施方式中，本发明包含至少一个随机化的环，其中至少AB、⑶和re环未随机化。在另 一实施方式中，本发明包含至少一个随机化的环，其中至少AB、DE和EF环未随机化。在另 一实施方式中，本发明包含至少一个随机化的环，其中至少AB、EF和TO环未随机化。在另 一实施方式中，本发明包含至少一个随机化的环，其中至少BC、⑶和DE环未随机化。在另 一实施方式中，本发明包含至少一个随机化的环，其中至少BC、⑶和EF环未随机化。在另 一实施方式中，本发明包含至少一个随机化的环，其中至少BC、⑶和re环未随机化。在另 一实施方式中，本发明包含至少一个随机化的环，其中至少BC、DE和EF环未随机化。另一 实施方式中，本发明包含至少一个随机化的环，其中至少BC、EF和re环未随机化。在另一 实施方式中，本发明包含至少一个随机化的环，其中至少⑶、DE和EF环未随机化。在另一 实施方式中，本发明包含至少一个随机化的环，其中至少⑶、DE和re环未随机化。在另一 实施方式中，本发明包含至少一个随机化的环，其中至少⑶、EF和re环未随机化。在另一 实施方式中，本发明包含至少一个随机化的环，其中至少DE、EF和TO环未随机化。在另一实施方式中，本发明包含至少一个随机化的环，其中四个环未随机化。在另 一实施方式中，本发明包含至少一个随机化的环，其中至少AB、BC、⑶和DE环未随机化。在 另一实施方式中，本发明包含至少一个随机化的环，其中至少AB、BC、⑶和EF环未随机化。 在另一实施方式中，本发明包含至少一个随机化的环，其中至少AB、BC、⑶和re环未随机 化。在另一实施方式中，本发明包含至少一个随机化的环，其中至少AB、⑶、DE和EF环未随 机化。在另一实施方式中，本发明包含至少一个随机化的环，其中至少AB、⑶、DE和TO环未 随机化。在另一实施方式中，本发明包含至少一个随机化的环，其中至少AB、⑶、EF和TO环 未随机化。在另一实施方式中，本发明包含至少一个随机化的环，其中至少AB、DE、EF和TO 环未随机化。在另一实施方式中，本发明包含至少一个随机化的环，其中至少BC、⑶、DE和 EF环未随机化。在另一实施方式中，本发明包含至少一个随机化的环，其中至少BC、⑶、DE 和re环未随机化。在另一实施方式中，本发明包含至少一个随机化的环，其中至少BC、DE、 EF和re环未随机化。在另一实施方式中，本发明包含至少一个随机化的环，其中至少⑶、 DE、EF和TO环未随机化。在另一实施方式中，本发明包含至少一个随机化的环，其中五个环环未随机化。在 另一实施方式中，本发明包含至少一个随机化的环，其中至少AB、BC、⑶、DE和EF环未随机 化。在另一实施方式中，本发明包含至少一个随机化的环，其中至少AB、BC、⑶、DE和TO环 未随机化。在另一实施方式中，本发明包含至少一个随机化的环，其中至少AB、⑶、DE、EF 和re环未随机化。在另一实施方式中，本发明包含至少一个随机化的环，其中至少AB、BC、 DE、EF和TO环未随机化。在另一实施方式中，本发明包含至少一个随机化的环，其中至少 AB、BC、⑶、EF和TO环未随机化。在另一实施方式中，本发明包含至少一个随机化的环，其中至少BC、CD、DE、EF和FG环未随机化。在另一实施方式中，本发明包含至少一个随机化的环，其中六个环未随机化。在另 一实施方式中，本发明包含至少一个随机化的环，其中至少AB、BC、⑶、DE、EF和TO环未随 机化。本发明还提供其中β链区域随机化的支架，其中在相似条件下检测到所述β链 随机化支架显示至少与β链随机化之前的同一支架一样高的稳定性和特异性靶标亲和 力。在一个实施方式中，本发明包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或 至少六个β链随机化。在另一实施方式中，本发明包含至少A链、或至少B链、或至少C链、 或至少D链、或至少E链、或至少F链随机化。在另一实施方式中，本发明包含两个随机化的β链。在另一实施方式中，本发明 包含随机化的A链和B链。在另一实施方式中，本发明包含随机化的A链和C链。在另一 实施方式中，本发明包含随机化的A链和D链。在另一实施方式中，本发明包含随机化的A 链和E链。在另一实施方式中，本发明包含随机化的A链和F链。在另一实施方式中，本发 明包含随机化的A链和G链。在另一实施方式中，本发明包含随机化的B链和C链。在另一 实施方式中，本发明包含随机化的B链和D链。在另一实施方式中，本发明包含随机化的B 链和E链。在另一实施方式中，本发明包含随机化的B链和F链。在另一实施方式中，本发 明包含随机化的B链和G链。在另一实施方式中，本发明包含随机化的C链和D链。在另 一实施方式中，本发明包含随机化的C链和E链。在另一实施方式中，本发明包含随机化的 C链和F链。在另一实施方式中，本发明包含随机化的C链和G链。在另一实施方式中，本 发明包含随机化的D链和E链。在另一实施方式中，本发明包含随机化的D链和F链。在 另一实施方式中，本发明包含随机化的D链和G链。在另一实施方式中，本发明包含随机化 的E链和F链。在另一实施方式中，本发明包含随机化的E链和G链。在另一实施方式中， 本发明包含随机化的F链和G链。在另一实施方式中，本发明包含三个随机化的β链。在一个实施方式中，本发明 包含随机化的Α、Β、和C链。在另一实施方式中，本发明包含随机化的Α、Β、和D链。在另一 实施方式中，本发明包含随机化的Α、B、和E链。在另一实施方式中，本发明包含随机化的 Α、Β、和F链。在另一实施方式中，本发明包含随机化的Α、B、和G链。在另一实施方式中， 本发明包含随机化的Α、C、和D链。在另一实施方式中，本发明包含随机化的Α、C、和E链。 在另一实施方式中，本发明包含随机化的Α、C、和F链。在另一实施方式中，本发明包含随 机化的A、C、和G链。在另一实施方式中，本发明包含随机化的A、D、和E链。在另一实施方 式中，本发明包含随机化的A、D、和F链。在另一实施方式中，本发明包含随机化的A、D、和 G链。在另一实施方式中，本发明包含随机化的B、C、和D链。在另一实施方式中，本发明包 含随机化的B、C、和E链。在另一实施方式中，本发明包含随机化的B、C、和F链。在另一 实施方式中，本发明包含随机化的B、C、和G链。在另一实施方式中，本发明包含随机化的 B、D、和E链。在另一实施方式中，本发明包含随机化的B、D、和F链。在另一实施方式中， 本发明包含随机化的B、D、和G链。在另一实施方式中，本发明包含随机化的C、D、和E链。 在另一实施方式中，本发明包含随机化的C、D、和F链。在另一实施方式中，本发明包含随 机化的C、D、和G链。在另一实施方式中，本发明包含随机化的C、E、和F链。在另一实施方 式中，本发明包含随机化的C、E、和G链。在另一实施方式中，本发明包含随机化的C、F、和G链。在另一实施方式中，本发明包含随机化的D、E、和F链。在另一实施方式中，本发明包 含随机化的D、F、和G链。在另一实施方式中，本发明包含随机化的E、F、和G链。在一个实施方式中，本发明包含四个随机化的β链。在另一实施方式中，本发明 包含随机化的Α、B、C、和D链。在另一实施方式中，本发明包含随机化的Α、B、C、和E链。 在另一实施方式中，本发明包含随机化的Α、B、C、和F链。在另一实施方式中，本发明包含 随机化的Α、B、C、和G链。在另一实施方式中，本发明包含随机化的Α、C、D、和E链。在另 一实施方式中，本发明包含随机化的Α、C、D、和F链。在另一实施方式中，本发明包含随机 化的Α、C、D、和G链。在另一实施方式中，本发明包含随机化的A、D、E、和F链。在另一实 施方式中，本发明包含随机化的A、D、E、和G链。在另一实施方式中，本发明包含随机化的 A、E、F、和G链。在另一实施方式中，本发明包含随机化的B、C、D、和E链。在另一实施方 式中，本发明包含随机化的B、C、D、和F链。在另一实施方式中，本发明包含随机化的B、C、 D、和G链。在另一实施方式中，本发明包含随机化的B、D、E、和F链。在另一实施方式中， 本发明包含随机化的B、D、EjP G链。在另一实施方式中，本发明包含随机化的B、E、F、和 G链。在另一实施方式中，本发明包含随机化的C、D、E和F链。在另一实施方式中，本发明 包含随机化的C、D、EjP G链。在另一实施方式中，本发明包含随机化的D、E、F、和G链。在一个实施方式中，本发明包含五个随机化的β链。在另一实施方式中，本发明 包含随机化的Α、B、C、D、和E链。在另一实施方式中，本发明包含随机化的Α、B、C、D、和F 链。在另一实施方式中，本发明包含随机化的Α、B、C、D、和G链。在另一实施方式中，本发 明包含随机化的A、C、D、E和F链。在另一实施方式中，本发明包含随机化的A、C、D、E和G 链。在另一实施方式中，本发明包含随机化的A、C、D、E和F链。在另一实施方式中，本发 明包含随机化的A、C、D、EjP G链。在另一实施方式中，本发明包含随机化的A、B、C、E和 F链。在另一实施方式中，本发明包含随机化的A、B、C、E和G链。在另一实施方式中，本发 明包含随机化的A、B、C、D和F链。在另一实施方式中，本发明包含随机化的A、B、C、D和G 链。在另一实施方式中，本发明包含随机化的B、C、D、E、和F链。在另一实施方式中，本发 明包含随机化的B、C、D、EjP G链。在另一实施方式中，本发明包含随机化的B、D、E、F和 G链。在另一实施方式中，本发明包含随机化的B、C、E、F和G链。在另一实施方式中，本发 明包含随机化的B、C、D、F和G链。在另一实施方式中，本发明包含随机化的C、D、E、F、和 G链。在一个实施方式中，本发明包含六个随机化的β链。在一个实施方式中，本发明 包含随机化的Α、B、C、D、EJP F链。在另一实施方式中，本发明包含随机化的Α、B、C、D、Ε、 和G链。在另一实施方式中，本发明包含随机化的A、C、D、E、F和G链。在另一实施方式中， 本发明包含随机化的A、B、D、E、F和G链。在另一实施方式中，本发明包含随机化的A、B、 C、E、F和G链。在另一实施方式中，本发明包含随机化的A、B、C、D、F和G链。在另一实施 方式中，本发明包含随机化的A、B、C、D、E和G链。在另一实施方式中，本发明包含随机化 的 B、C、D、E、F 和 G 链。在一个实施方式中，本发明包含六个随机化的β链。在一个实施方式中，本发明 包含随机化的Α、B、C、D、Ε、F和G链。本发明还提供聚环长度多样性的蛋白质支架。在一个实施方式中，本发明包含至 少一个环，其包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、 至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或至少30个 氨基酸残基。在另一实施方式中，本发明可包含至少一个环，其包含1、2、4、5、6、7、8、9、10、
11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30 个氨基酸残基。在 另一实施方式中，本发明可包含至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个相同 长度的环。在另一实施方式中，本发明可包含至少两个环、至少三个、至少四个、至少五个或 至少六个不同长度的环。在另一实施方式中，本发明因天然产生蛋白质序列中相应环序列的至少一个氨基 酸的缺失、取代或添加而不同于天然产生的蛋白质序列。在一个实施方式中，本发明在相应 天然产生的蛋白质序列的至少一个、或至少两个、或至少四个、或至少四个、或至少五个、或 至少六个环序列中包含至少一个氨基酸的缺失、取代或添加。在一个实施方式中，本发明在 相应天然产生的蛋白质序列的至少一个、或至少两个、或至少三个、或至少四个、或至少五 个、或至少六个环序列中包含至少1、或至少2、或至少3、或至少4、或至少5、或至少6、或至 少7、或至少8、或至少9、或至少10、或至少11、或至少12、或至少13、或至少14、或至少15、 或至少16、或至少17、或至少18、或至少19、或至少20、或至少21、或至少22、或至少23、或 至少24、或至少25、或至少26、或至少27、或至少28、或至少29、或至少30个氨基酸的缺失、 取代或添加。在另一实施方式中，本发明在相应天然产生的蛋白质序列的至少一个、或至少 两个、或至少三个、或至少四个、或至少五个、或至少六个环序列中包含至少1、至少2、至少 3、至少4到约至少8、、至少9、或至少10、或至少11、或至少12、或至少13、或至少14、或至 少15、或至少16、或至少17、或至少18、或至少19、或至少20、或至少21、或至少22、或至少 23、或至少24、或至少25、或至少26、或至少27、或至少28、或至少29、或至少30个氨基酸 的缺失、取代或添加。在一个实施方式中，本发明在环AB中包含至少一个氨基酸的缺失、取代或添加。 在另一实施方式中，本发明在环AB中包含至少1、或至少2、或至少3、或至少4、或至少5、 或至少6、或至少7、或至少8、或至少9、或至少10、或至少11、或至少12、或至少13、或至 少14、或至少15、或至少16、或至少17、或至少18、或至少19、或至少20、或至少21、或至少 22、或至少23、或至少24、或至少25、或至少26、或至少27、或至少28、或至少29、或至少30 个氨基酸的缺失、取代或添加。在另一实施方式中，本发明在环AB中包含至少1、至少2、至 少3、至少4到约至少8、至少9、或至少10、或至少11、或至少12、或至少13、或至少14、或 至少15、或至少16、或至少17、或至少18、或至少19、或至少20、或至少21、或至少22、或至 少23、或至少24、或至少25、或至少26、或至少27、或至少28、或至少29、或至少30个氨基 酸的缺失、取代或添加。在一个实施方式中，本发明在环BC中包含至少一个氨基酸的缺失、取代或添加。 在另一实施方式中，本发明在环BC中包含至少1、或至少2、或至少3、或至少4、或至少5、 或至少6、或至少7、或至少8、或至少9、或至少10、或至少11、或至少12、或至少13、或至 少14、或至少15、或至少16、或至少17、或至少18、或至少19、或至少20、或至少21、或至少 22、或至少23、或至少24、或至少25、或至少26、或至少27、或至少28、或至少29、或至少30 个氨基酸的缺失、取代或添加。在另一实施方式中，本发明在环BC中包含至少1、至少2、至 少3、至少4到约至少8、至少9、或至少10、或至少11、或至少12、或至少13、或至少14、或
41至少15、或至少16、或至少17、或至少18、或至少19、或至少20、或至少21、或至少22、或至 少23、或至少24、或至少25、或至少26、或至少27、或至少28、或至少29、或至少30个氨基 酸的缺失、取代或添加。在一个实施方式中，本发明在环CD中包含至少一个氨基酸的缺失、取代或添加。 在另一实施方式中，本发明在环CD中包含至少1、或至少2、或至少3、或至少4、或至少5、 或至少6、或至少7、或至少8、或至少9、或至少10、或至少11、或至少12、或至少13、或至少 14、或至少15、或至少16、或至少17、或至少18、或至少19、或至少20、或至少21、或至少22、 或至少23、或至少24、或至少25、或至少26、或至少27、或至少28、或至少29、或至少30个 氨基酸的缺失、取代或添加。在另一实施方式中，本发明在环⑶中包含至少1、至少2、至少 3、至少4到约至少8、、至少9、或至少10、或至少11、或至少12、或至少13、或至少14、或至 少15、或至少16、或至少17、或至少18、或至少19、或至少20、或至少21、或至少22、或至少 23、或至少24、或至少25、或至少26、或至少27、或至少28、或至少29、或至少30个氨基酸 的缺失、取代或添加。在一个实施方式中，本发明在环DE中包含至少一个氨基酸的缺失、取代或添加。 在另一实施方式中，本发明在环DE中包含至少1、或至少2、或至少3、或至少4、或至少5、 或至少6、或至少7、或至少8、或至少9、或至少10、或至少11、或至少12、或至少13、或至 少14、或至少15、或至少16、或至少17、或至少18、或至少19、或至少20、或至少21、或至少 22、或至少23、或至少24、或至少25、或至少26、或至少27、或至少28、或至少29、或至少30 个氨基酸的缺失、取代或添加。在另一实施方式中，本发明在环DE中包含至少1、至少2、至 少3、至少4到约至少8、至少9、或至少10、或至少11、或至少12、或至少13、或至少14、或 至少15、或至少16、或至少17、或至少18、或至少19、或至少20、或至少21、或至少22、或至 少23、或至少24、或至少25、或至少26、或至少27、或至少28、或至少29、或至少30个氨基 酸的缺失、取代或添加。在一个实施方式中，本发明在环EF中包含至少一个氨基酸的缺失、取代或添加。 在另一实施方式中，本发明在环EF中包含至少1、或至少2、或至少3、或至少4、或至少5、 或至少6、或至少7、或至少8、或至少9、或至少10、或至少11、或至少12、或至少13、或至 少14、或至少15、或至少16、或至少17、或至少18、或至少19、或至少20、或至少21、或至少 22、或至少23、或至少24、或至少25、或至少26、或至少27、或至少28、或至少29、或至少30 个氨基酸的缺失、取代或添加。在另一实施方式中，本发明在环EF中包含至少1、至少2、至 少3、至少4到约至少8、至少9、或至少10、或至少11、或至少12、或至少13、或至少14、或 至少15、或至少16、或至少17、或至少18、或至少19、或至少20、或至少21、或至少22、或至 少23、或至少24、或至少25、或至少26、或至少27、或至少28、或至少29、或至少30个氨基 酸的缺失、取代或添加。在一个实施方式中，本发明在环re中包含至少一个氨基酸的缺失、取代或添加。 在另一实施方式中，本发明在环re中包含至少1、或至少2、或至少3、或至少4、或至少5、 或至少6、或至少7、或至少8、或至少9、或至少10、或至少11、或至少12、或至少13、或至少 14、或至少15、或至少16、或至少17、或至少18、或至少19、或至少20、或至少21、或至少22、 或至少23、或至少24、或至少25、或至少26、或至少27、或至少28、或至少29、或至少30个 氨基酸的缺失、取代或添加。在另一实施方式中，本发明在环re中包含至少1、至少2、至少3、至少4到约至少8、、至少9、或至少10、或至少11、或至少12、或至少13、或至少14、或至 少15、或至少16、或至少17、或至少18、或至少19、或至少20、或至少21、或至少22、或至少 23、或至少24、或至少25、或至少26、或至少27、或至少28、或至少29、或至少30个氨基酸 的缺失、取代或添加。 本发明还提供包含环序列多样性的支架。在一个实施方式中，本发明包含至少1、 至少2、至少3、至少4、至少5或至少6个环，其包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至 少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至 少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少 27、至少28、至少29或至少30个随机化的位置。在另一实施方式中，本发明包含至少1、至 少2、至少3、至少4、至少5或至少6个环，其包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至 少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至 少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少 27、至少28、至少29或至少30个随机化的位置，还包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少 5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少 16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、 至少27、至少28、至少29或至少30个维持恒定的位置。在另一实施方式中，本发明包含至 少1、至少2、至少3、至少4、至少5或至少6个环，其包含至少1、至少2、至少3、至少4、至 少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至 少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少 26、至少27、至少28、至少29或至少30个经历限制性随机化的位置。在另一实施方式中， 本发明包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5或至少6个环，其包含至少1、至少2、至 少3、至少4、至少5或至少6个环，其包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至 少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、 至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至 少28、至少29或至少30个经历限制性随机化的位置，还包含至少1、至少2、至少3、至少4、 至少5或至少6个环，其包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、 至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少 19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29 或至少30个维持恒定的位置。在另一实施方式中，本发明包含至少1、至少2、至少3、至少
4、至少5或至少6个环，其包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5或至少6个环，其包含 至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少 12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、 至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或至少30个经历限制性随机 化的位置，还包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5或至少6个环，其包含至少1、至少 2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、 至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至 少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或至少30个随机化的位置，和至少1、至 少2、至少3、至少4、至少5或至少6个环，其包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至 少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少 27、至少28、至少29或至少30个维持恒定的位置。本发明还提供包含环序列多样性的支架。在一个实施方式中，本发明包含至少一 个环，其含有至少一个随机化的位置。在另一实施方式中，本发明包含至少一个环，其含有 至少一个随机化的位置，还包含至少一个维持恒定的位置。在另一实施方式中，本发明包含 环，其包含至少一个经历限制性随机化的位置。在另一实施方式中，本发明包含至少一个 环，其包含至少一个经历限制性随机化的位置，还包含至少一个维持恒定的位置。在另一实 施方式中，本发明包含至少一个环，其包含至少一个经历限制性随机化的位置，还包含至少 一个随机化的位置和至少一个维持恒定的位置。在一个实施方式中，本发明包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五 个或至少六个序列长度和多样性随机化的环。在一个实施方式中，本发明包含序列长度和 多样性随机化的AB环。在另一实施方式中，本发明包含序列长度和多样性随机化的BC环。 本发明包含序列长度和多样性随机化的CD环。本发明包含序列长度和多样性随机化的DE 环。本发明包含序列长度和多样性随机化的EF环。本发明包含序列长度和多样性随机化 的re环。在另一实施方式中，本发明包含序列长度和多样性随机化的AB和BC环。在另一实 施方式中，本发明包含序列长度和多样性随机化的AB和CD环。在另一实施方式中，本发明 包含序列长度和多样性随机化的AB和DE环。在另一实施方式中，本发明包含序列长度和 多样性随机化的AB和EF环。在另一实施方式中，本发明包含序列长度和多样性随机化的 AB和TO环。在另一实施方式中，本发明包含序列长度和多样性随机化的BC和CD环。在另 一实施方式中，本发明包含序列长度和多样性随机化的BC和DE环。在另一实施方式中，本 发明包含序列长度和多样性随机化的BC和EF环。在另一实施方式中，本发明包含序列长 度和多样性随机化的BC和re环。在另一实施方式中，本发明包含序列长度和多样性随机 化的CD和DE环。在另一实施方式中，本发明包含序列长度和多样性随机化的CD和EF环。 在另一实施方式中，本发明包含序列长度和多样性随机化的CD和re环。在另一实施方式 中，本发明包含序列长度和多样性随机化的DE和EF环。在另一实施方式中，本发明包含序 列长度和多样性随机化的DE和re环。在另一实施方式中，本发明包含序列长度和多样性 随机化的EF和re环。在另一实施方式中，本发明包含序列长度和多样性随机化的AB、BC和CD环。在另 一实施方式中，本发明包含序列长度和多样性随机化的AB、BC和DE环。在另一实施方式 中，本发明包含序列长度和多样性随机化的AB、BC和EF环。在另一实施方式中，本发明包 含序列长度和多样性随机化的AB、BC和re环。在另一实施方式中，本发明包含序列长度和 多样性随机化的AB、CD和DE环。在另一实施方式中，本发明包含序列长度和多样性随机化 的AB、CD和EF环。在另一实施方式中，本发明包含序列长度和多样性随机化的AB、CD和TO 环。在另一实施方式中，本发明包含序列长度和多样性随机化的AB、DE和EF环。在另一实 施方式中，本发明包含序列长度和多样性随机化的AB、DE和TO环。在另一实施方式中，本 发明包含序列长度和多样性随机化的AB、EF和TO环。在另一实施方式中，本发明包含序列 长度和多样性随机化的BC、CD和DE环。在另一实施方式中，本发明包含序列长度和多样性 随机化的BC、CD和EF环在另一实施方式中，本发明包含序列长度和多样性随机化的BC、CD
44和re环。在另一实施方式中，本发明包含序列长度和多样性随机化的BC、DE和EF环。在 另一实施方式中，本发明包含序列长度和多样性随机化的BC、DE和re环。在另一实施方式 中，本发明包含序列长度和多样性随机化的BC、EF和re环。在另一实施方式中，本发明包 含序列长度和多样性随机化的CD、DE和EF环。在另一实施方式中，本发明包含序列长度和 多样性随机化的CD、DE和re环。在另一实施方式中，本发明包含序列长度和多样性随机化 的CD、EF和TO环。在另一实施方式中，本发明包含序列长度和多样性随机化的DE、EF和 FG环。在另一实施方式中，本发明包含序列长度和多样性随机化的AB、BC、CD和DE环。 在另一实施方式中，本发明包含序列长度和多样性随机化的AB、BC、CD和EF环。在另一实 施方式中，本发明包含序列长度和多样性随机化的AB、BC、CD和re环。在另一实施方式中， 本发明包含序列长度和多样性随机化的AB、⑶、DE和EF环。在另一实施方式中，本发明包 含序列长度和多样性随机化的AB、CD、DE和TO环。在另一实施方式中，本发明包含序列长 度和多样性随机化的AB、CD、EF和TO环。在另一实施方式中，本发明包含序列长度和多样 性随机化的AB、DE、EF和TO环。在另一实施方式中，本发明包含序列长度和多样性随机化 的BC、CD、DE和EF环。在另一实施方式中，本发明包含序列长度和多样性随机化的BC、CD、 DE和TO环。在另一实施方式中，本发明包含序列长度和多样性随机化的BC、CD、EF和TO 环。在另一实施方式中，本发明包含序列长度和多样性随机化的BC、DE、EF和TO环。在另 一实施方式中，本发明包含序列长度和多样性随机化的CD、DE、EF和TO环。在另一实施方式中，本发明包序列长度和多样性随机化的含AB、BC、⑶、DEjP EF 环。在另一实施方式中，本发明包含序列长度和多样性随机化的AB、BC、CD、DE、和TO环。 在另一实施方式中，本发明包含序列长度和多样性随机化的AB、CD、DE、EF和TO环。在另 一实施方式中，本发明包含序列长度和多样性随机化的AB、BC、DE、EF和TO环。在另一实 施方式中，本发明包含序列长度和多样性随机化的AB、BC、CD、EF和TO环。在另一实施方 式中，本发明包含序列长度和多样性随机化的AB、BC、CD、EF、和TO环。在另一实施方式中， 本发明包含序列长度和多样性随机化的AB、BC、CD、DEJP EF环。在另一实施方式中，本发 明包含序列长度和多样性随机化的BC、⑶、DE、EF和TO环。6. 8支架偶联物本发明包括利用偶连或融合于一个或多个部分支架，所述部分包括但不限于肽、 多肽、蛋白质、融合蛋白、核酸分子、小分子、模拟试剂、合成药物、无机分子和有机分子。本 发明包括利用重组融合或化学偶连(包括共价和非共价偶连)于异源蛋白质或多肽(或其 片段，至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至 少80个、至少90或至少100个氨基酸的多肽)的支架，从而产生融合蛋白。这种融合无需 直接进行，而可以通过本文所述的接头序列发生。例如，可通过将支架融合或偶连于特定细 胞表面受体的特异性抗体，在体外或体内利用支架将异源靶多肽靶向特定细胞类型。还可 将融合或偶连于异源多肽的支架用于采用本领域已知方法的体外免疫测定和纯化方法中， 参见,例如国际公布号WO 93/21232 ；欧洲专利号EP439, 095 ；Naramura等，1994，Immunol. Lett. 39 91-99 ；美国专利号 5，474，981 ；Gillies 等，1992，PNAS 89 1428-1432 ；和 Fell 等，1991，J. Immunol. 146 :2446_2452，它们通过引用全文纳入本文。可通过基因改组、基序改组、外显子改组和/或密码子改组(统称为“DNA改组”)的技术产生包含本发明支架的其它融合蛋白。可采用DNA改组来改变本发明支 架的活性(例如，具有较高亲和力和较低解离速率的支架)。一般可参见，美国专利号 5，605，793 ；5，811，238 ；5，830，721 ；5，834，252 和 5，837，458 ；Patten 等，1997，Curr. Opinion Biotechnol. 8 724-33 ；Harayama,1998, Trends Biotechnol. 16(2) :76_82 ； Hansson 等，1999， J. Mol. Biol. 287 265-76 ；Lorenzo 禾口 Blasco，1998，BioTechniques 24(2) :308-313(各份专利和出版物通过引用全文纳入本文)。先通过易错PCR、随机核苷 酸插入或其它方法进行随机诱变，再重组来改变支架，或者其编码的支架。可将编码特异性 结合靶标的支架的多核苷酸的一个或多个部分与一种或多种异源分子的一个或多个组分、 基序、区段、部分、结构域、片段等重组(recombine)。此外，可将本发明支架与标记序列，例如肽融合以促进纯化。在某些实施方式中， 标记氨基酸序列是六_组氨酸肽(his-标签)，例如，加利福尼亚州查塔沃斯市恰根公司 (QIAGEN, Inc.，9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif.，91311)的 pQE 载体中提供的标签 等，其中许多标记可商品化购得。如Gentz等(1989，PNAS，86 :821-824)中所述，六-组氨 酸为纯化融合蛋白提供了便利。可用于纯化的其它肽标签包括但不限于对应于衍生自流 感血凝素蛋白某表位的血凝素“HA”标签(Wilson等，Cell, 37 767)和“flag”标签。在其它实施方式中，可将本发明支架、其类似物或衍生物与诊断或可检测试剂偶 连。可利用这种支架作为临床检验方法的一部分来监测或预后疾病的发生或进展，例如测 定具体疗法的效力。可将支架与可检测物质偶联来实现这种诊断和检测，所述可检测物质 包括但不限于各种酶，例如但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、半乳糖苷酶或乙 酰胆碱酯酶；辅基，例如但不限于链霉亲和素/生物素及亲和素/生物素；荧光材料，例如 但不限于伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素(dichlorotriaz inylaminefluorescein)、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料，例如但不限于鲁米诺；生物发 光物质，例如但不限于萤光素酶、萤光素和水母蛋白；放射性物质，例如但不限于碘(1311、 1251、1231、1211)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(115ln、113ln、112ln、mln)、锝(99Tc)、铊(2tllTi)、镓 (6W7Ga)、钯(103Pd)、钼(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y、47Sc、186Re J88ReJ42PiNic15RtK97Riu68Gh57CcK65ZrK85SiN32Pj53GcU169YlK51CiN54MrK75SeJ13SrK 和117Tn ；用于各种正电子发射断层显像的正电子发射金属和非放射性顺磁金属离子，以及 作放射性标记或偶连于特定放射性同位素的分子。本发明还包括利用与治疗性部分偶连的支架。可将支架与治疗性部分，例如 细胞毒素，如抑制细胞或杀细胞药物，治疗性药物或放射性金属离子，如α-(射线)发 射体偶连。细胞毒素或细胞毒性药物可以是对细胞有害的任何药物。治疗性部分包括 但不限于抗代谢剂(如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、 达卡巴嗪)、烷化剂(如双氯乙基甲胺、塞替派(thio印a)、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司 汀(BCNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C和 顺二氯二胺钼(II) (DDP)顺钼)、蒽环霉素类(如道诺比星(以前称为道诺霉素)和多 柔比星)、抗生素(如放线菌素d(以前称为放线菌素)、博来霉素、光神霉素和氨茴霉 素(AMC))、耳他汀分子(如耳他汀PHE、苔藓抑素1和索拉他汀liKsolastatin 10)；参 B Woyke 等，Antimicrob. Agents Chemother. 46 3802-8 (2002), Woyke 等，Antimicrob. AgentsChemother. 45 3580-4 (2001)，Mohammad 等，Anticancer Drugs 12 735-40 (2001)，Wall 等，Biochem. Biophys. Res. Commun. 266 76-80 (1999)，Mohammad 等，Int. J. Oncol. 15 367-72 (1999)，所有通过引用纳入本文)、激素(如糖皮质激素类、孕激素、雄激素和雌激 素)、DNA修复酶抑制剂(如依托泊甙或拓扑替康)、激酶抑制剂(如化合物T1571、甲磺 酸伊马替尼(Kantaijian 等，Clin Cancer Res. 8(7) :2167_76 (2002))、细胞毒剂(如紫 杉醇、松胞菌素B、短杆菌肽D、溴乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊甙、替尼泊甙、长春新碱、 长春碱、秋水仙素、多柔比星、道诺霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线 菌素D、l-去氢睾酮、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素和它们的类似物 或同源物)以及美国专利号 6，245，759,6, 399，633,6, 383，790,6, 335，156,6, 271，242、 6，242，196,6，218，410,6，218，372,6，057，300,6，034，053,5，985，877,5，958，769, 5，925，376,5，922，844,5，911，995,5，872，223,5，863，904,5，840，745,5，728，868, 5，648，239,5, 587，459中公开的化合物)、法呢基转移酶抑制剂(如R115777、BMS-214662 和美国专利号 6，458，935、6，451，812、6，440，974、6，436，960、6，432，959、6，420，387、
6，414，145,6,410，541、6，410，539、6，403，581,6，399，615、6，387，905、6，372，747、6，369，034,6，362，188、6，342，765、6，342，487,6，300，501、6，268，363、6，265，422、6，248，756,6,239，140、6，232，338、6，228，865,6，228，856、6，225，322、6，218，406、6，211，193,6,187，786、6，169，096、6，159，984,6，143，766、6，133，303、6，127，366、6，124，465,6，124，295、6，103，723、6，093，737,6，090，948、6，080，870、6，077，853、
6，071，935,6, 066，738,6, 063，930,6, 054，466,6, 051，582,6, 051，574 和 6，040，305 中公
开的化合物)、拓扑异构酶抑制剂(如喜树碱；伊立替康；SN-38 ；拓扑替康；9-氨基喜树 碱；GG-211(GI 147211) ；DX_8951f ；IST-622 ；卢比替康；卩比唑啉吖啶；XR-5000 ；赛托品 (saintopin) ；UCE6 ；UCE1022 ；TAN-1518A ；TAN-1518B ；KT6006 ；KT6528 ；ED-110 ；NB-506 ； ED-110 ；NB-506 ；和罗贝霉素(rebeccamycin))；布各雷(bulgarein) ；DNA 小沟结合剂如 Hoescht染料33342和Hoechst染料33258 ；两面针碱；花椒宁碱；表小檗碱；甲氧檗因； β-拉帕醌；BC-4-1 ；二膦酸盐(如阿仑膦酸盐、西马膦酸盐(cimadronte)、氯屈膦酸盐、 替鲁膦酸盐、依替膦酸盐、伊班膦酸盐、奈立膦酸盐、奥帕膦酸盐(olpandronate)、利塞膦 酸盐、吡膦酸盐、帕米膦酸盐、坐莱膦酸盐(zolendronate))、HMG-CoA还原酶抑制剂(如 洛伐他汀、辛伐他汀、阿托伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、他汀、西立伐他汀、来适可、鲁匹妥 (Iupitor)、罗苏伐他汀和阿托伐他汀)和其药学上可接受的盐、溶剂化物、包合物和前药 (参见例如 Rothenberg，Μ. L.，Annals of Oncology 8 :837_855 (1997)；禾口 Moreau，P.等， J. Med. Chem. 41 :1631-1640 (1998))，反义寡核苷酸(如美国专利号 6，277，832,5, 998，596、 5，885，834,5, 734，033和5，618，709公开的物质)，免疫调节剂(如抗体和细胞因子)、抗 体和腺苷脱氨酶抑制剂(如磷酸氟达拉滨和2-氯脱氧腺苷)。例子包括紫杉醇、松胞菌 素B、短杆菌肽D、溴乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊甙、替尼泊甙、长春新碱、长春碱、秋水 仙素、多柔比星、道诺霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、l-去氢 睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素和它们的类似物或同 源物。治疗剂包括但不限于抗代谢剂(如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、 5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪)、烷化剂(如双氯乙基甲胺、塞替派(thio印a)、苯丁酸氮芥、美法 仑、卡莫司汀(BCNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉 素C和顺二氯二胺钼(II) (DDP)顺钼)、蒽环霉素类(如道诺比星(以前称为道诺霉素)和多柔比星)、抗生素(如放线菌素d(以前称为放线菌素)、博来霉素、光神霉素和氨茴霉素 (AMC))、耳他汀分子(如耳他汀PHE、苔藓抑素1和索拉他汀10 ；参见Woyke等，Antimicrob. Agents Chemother. 46 3802-8 (2002)， Woyke 等，Antimicrob. Agents Chemother. 45 3580-4(2001)，Mohammad 等，Anticancer Drugs 12 :735_40 (2001)，Wall 等，Biochem. Biophys. Res. Commun. 266 :76_80(1999)，Mohammad 等，Int. J. Oncol. 15 :367_72 (1999)，所 有通过引用纳入本文)、抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春碱)、激素(如糖皮质激素类、 孕激素、雄激素和雌激素)、DNA修复酶抑制剂(如依托泊甙或拓扑替康)、激酶抑制剂(如 化合物 T1571、甲磺酸伊马替尼(Kantaijian 等，Clin Cancer Res. 8(7) :2167_76 (2002)) 以及美国专利号 6，245，759,6, 399，633,6, 383，790,6, 335，156,6, 271，242,6, 242，196、 6，218，410,6，218，372,6，057，300,6，034，053,5，985，877,5，958，769,5，925，376, 5，922，844,5，911，995,5，872，223,5，863，904,5，840，745,5，728，868,5，648，239, 5，587，459中公开的化合物)、法呢基转移酶抑制剂(如R115777、BMS-214662和美国专
利号6，458，935,6, 451，812、6:,440,974,6,436，960,6,432，959,6, 420, 387,6，414:,145、6，410，541,6,410，539、6:,403，581、6，399:’ 615、6，387，905,6，372，747,6，369，034、6，362，188,6,342，765,6;,342，487、6，300:’ 501、6，268，363,6，265，422,6，248，756、6，239，140,6,232，338,6;,228，865、6，228;,856、6，225，322,6，218，406,6，211，193、6，187，786,6,169，096,6,,159，984、6，143;,766、6，133，303,6，127，366,6,124，465、6，124，295,6，103，723,6,,093，737、6，090;,948、6，080，870,6，077，853,6，071，935、
6，066，738,6, 063，930,6, 054，466,6, 051，582,6, 051，574和 6，040，305 中公开的化合物)、
拓扑异构酶抑制剂(如喜树碱；伊立替康；SN-38 ；拓扑替康；9-氨基喜树碱；GG-21KGI 147211) ；DX-8951f ；IST-622 ；卢比替康；吡唑啉吖啶；XR-5000 ；赛托品(saintopin)； UCE6 ；UCE1022 ；TAN-1518A；TAN-1518B；KT6006 ；KT6528 ；ED-110 ；NB-506 ；ED-110 ；NB-506 ； 和罗贝霉素(rebeccamycin))；布各雷(bulgarein) ；DNA小沟结合剂如Hoescht染料33342 和Hoechst染料33258 ；两面针碱；花椒宁碱；表小檗碱；甲氧檗因；β _拉帕醌；BC-4-1 ；和 它们药学上可接受的盐、溶剂化物、包合物和前药(参见例如Rothenberg，M. L.，Annals of Oncology 8:837-855(1997)；和 Moreau，P.等，J. Med. Chem. 41 1631-1640 (1998))，反义寡 核苷酸(如美国专利号 6，277，832,5, 998，596,5, 885，834,5, 734，033 和 5，618，709 公开的 物质)，免疫调节剂(如抗体和细胞因子)、抗体(例如，利妥昔单抗(Rituxan )、刺孢霉素 (Mylotarg 、伊利图莫单抗(ibritumomab)图西坦(tiuxetan) (Zevalin )和托西莫单抗 (Bexxar ))和腺苷脱氨酶抑制剂(如磷酸氟达拉滨和2-氯脱氧腺苷)。
此外，可将支架与能改进给定的生物学反应的治疗性部分或药物部分偶联。治疗 性部分或药物部分不应理解为仅限于典型的化疗药物。例如，药物部分可以是具有所需 生物学活性的蛋白质或多肽。这种蛋白质可包括，例如毒素，如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋 白A、假单胞菌外毒素、霍乱毒素或白喉毒素；蛋白质，如肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干 扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子、组织纤溶酶原激活物、凋亡物质(如TNF-α、 TNF-β ), AIM I (参见国际公布号WO 97/33899)、AIM II (参见国际公布号WO 97/34911)、 Fas 配体(Takahashi 等，1994，J. Immunol.，6 1567-1574)和 VEGI (参见国际公布号 W099/23105)；血栓形成剂或抗血管新生药物，例如血管抑制素、内皮抑制素或凝血途径 (coagulation pathway)的组分(如组织因子)；或生物反应修饰剂，如淋巴因子(如白介素-1( “IL-1”)、白介素-2( “IL-2”)、白介素_6( “IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 (“GM-CSF”)和粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”))、生长因子(如生长激素(“GH”))、或 凝血药物(如钙、维生素K、组织因子，例如但不限于Hageman因子(因子XII)、高分子量激 肽原(HMWK)、前激肽释放酶(PK)、凝血蛋白因子II (凝血酶原)、因子V、XIIa、VIII、XIIIa、 XI、XIa、IX、IXa、X、血纤蛋白原的α和β链的磷脂血纤肽A和B、血纤蛋白单体)。还可将支架偶联于治疗性部分如放射性金属离子，如α _发射体(如213Bi)或用于 将放射性金属离子，包括但不限于131In、131LU、131Y、131Ho、131Sm与多肽偶联的大环螯合剂。在 某些实施方式中，所述大环螯合剂是可经接头分子与支架相连的1，4，7，10_四氮杂环十二 烷-N，N'，N"，N"‘-四乙酸(DOTA)。本领域公知这种接头分子，参见Denardo等，1998， Clin Cancer Res. 4(10) 2483-90 ；Peterson φ, 1999, Bioconjug. Chem. 10 (4) 553-7 ； Zimmerman等，1999，Nucl. Med. Biol. 26(8) :943_50，各篇文献通过引用全文纳入本文。将治疗性部分偶联于抗体的技术是熟知的，参见例如Arnon等，"Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy，，(癌症治疗中用于药 物的免疫靶向的单克隆抗体)，刊于Monoclonal Antibodies AndCancer Therapy (《单 克隆抗体和癌症治疗》)，Reisfeld等编，第243-56页，(奥兰李斯公司(Alan R. Liss, Inc.) 1985) ；Hellstrom 等，“Antibodies For DrugDelivery，，(用于药物递送的抗体)， 刊于Controlled Drug Delivery(《受控药物递送》)，(第二版)，Robinson等编，第 623-53 页，(马赛尔戴克公司(Marcel Dekker, Inc.) 1987) ；Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy :A Review”(癌症治疗中的细胞毒性药物 的抗体运载体综述)，刊于 MonoclonalAntibodies ‘84 biological And Clinical Applications (《单克隆抗体‘84 生物学和临床应用》)，Pinchera等编，第475-506页， (1985) ；"Analysis, Results, AndFuture Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In CancerTherapy”(癌症治疗中放射性标记抗体的治疗性应 用)，干1J于MonoclonalAntibodies For Cancer Detection And Therapy (《用于癌症检测禾口 治疗的单克隆抗体》)，Baldwin等编，第303-16页，(学术出版社(Academic Press) 1985) 禾口 Thorpe 等，1982，Immunol. Rev. 62 :119-58。应选择偶联于支架的治疗性部分或药物，从而在对象中实现对具体疾病的所需预 防或治疗作用。决定将哪种治疗性部分或药物偶联于支架时，医生或其他医务人员应考虑 以下情况疾病的性质、疾病的严重程度和对象的情况。本发明支架也可连接于固体支持物，该固体支持物尤其可用于靶抗原的免疫测得 或纯化。这种固体支持物包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙 烯或聚丙烯。6. 9 制备重组表达本发明支架需要构建含有编码该支架的多核苷酸的表达载体。一旦获得 编码支架的多核苷酸，可采用本领域熟知的技术通过重组DNA技术制备用于产生支架的载 体。因此，本文描述了通过表达含有支架编码核苷酸序列的多核苷酸来制备蛋白的方法。可 采用本领域技术人员熟知的方法构建含有支架多肽编码序列及合适的转录和翻译控制信 号的表达载体。这些方法包括，例如体外重组DNA技术、合成技术和体内基因重组。因此， 本发明提供了包含编码本发明支架的操作性连接于启动子的核苷酸序列的可复制载体。
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通过常规技术将表达载体转入宿主细胞，并通过常规技术培养转染细胞以产生本 发明支架。因此，本发明包括含有编码本发明支架的操作性连接于异源启动子的多核苷酸 的宿主细胞。合适的宿主细胞包括但不限于微生物，例如细菌(如大肠杆菌(E. coli)和枯 草芽胞杆菌(B. subtilis))。可利用各种宿主表达载体系统来表达本发明支架。这种宿主表达系统提供产生 感兴趣编码序列，随后将其纯化的运载体，但也提供了用合适的核苷酸编码序列转化或转 染时能原位表达本发明支架的细胞。这些系统包括但不限于微生物，例如用含有支架编 码序列的重组细菌噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(如大肠杆菌 和枯草芽胞杆菌)；用含有支架编码序列的重组酵母菌表达载体转化的酵母菌(如酵母 (Saccharomyces)，毕赤酵母(Pichia))；用含有支架编码序列的重组病毒表达载体(例如， 杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用含支架编码序列的重组病毒表达载体(例如，花椰菜花 叶病毒，CaMV ；烟草花叶病毒，TMV)感染或用含支架编码序列的重组质粒表达载体(例如， Ti质粒)转化的植物细胞系统；或包含含有源自哺乳动物细胞基因组的启动子(如金属硫 蛋白启动子)或源自哺乳动物病毒的启动子(如腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7. 5K启动 子)的重组表达构建物的哺乳动物细胞系统(如COS、CHO、BHK,293, NSO和3T3细胞)。可通过三种通用方法鉴定含有编码本发明支架的基因插入物的表达载体(a)核 酸杂交，(b) “标记”基因功能的存在或不存在，和(c)所插入序列的表达。在第一方法中， 可分别利用包含的序列与编码肽、多肽、蛋白质或融合蛋白的插入基因同源的探针，通过核 酸杂交检测表达载体中是否存在编码肽、多肽、蛋白质或融合蛋白的基因。在第二方法中， 可根据载体中编码抗体或融合蛋白的核苷酸序列插入所致某些“标记”基因功能(例如，胸 苷激酶活性、对抗生素的耐受性、转化表型、杆状病毒中形成包含体等)是否存在来鉴定和 选择重组载体/宿主系统。例如，如果编码支架的核苷酸序列插入载体的标记基因序列内， 可通过标记基因功能不存在来鉴定含有编码支架的插入基因的重组体。在第三方法中，可 通过检验该重组体表达的基因产物(例如，支架或其多聚体)鉴定重组表达载体。这种使 用可以基于，例如蛋白质在体外试验系统中的物理和功能特性，如该支架的结合、激动或拮 抗特性。在一些实施方式中，至少可部分化学合成本发明支架。在其它实施方式中，可半合 成制备本发明支架。6. 10支架纯化一旦通过重组表达产生了本发明支架，可通过蛋白质纯化领域已知的任何方法来 纯化，例如层析(如，金属螯合层析、离子交换、亲和力和分子大小柱层析)、离心、差别溶解 性或蛋白质纯化的任何其它标准技术。本发明支架的高度稳定性质能允许改变纯化方案。例如，本发明支架所显示的热 稳定性允许加热包含支架的粗制裂解液，从而通过变性除去主要的宿主细胞蛋白。在另一 实施方式中，本发明支架显示的高度蛋白酶耐受性允许在任何纯化步骤之前快速降解粗制 裂解液中的宿主细胞蛋白。本发明支架显示的PH耐受性还允许在任何纯化步骤之前通过 降低或升高PH来选择性沉淀粗制裂解液中的宿主细胞蛋白。在一些实施方式中，通过高温 转变、蛋白酶处理、PH上调或下调或以上任意的组合以图除去粗制裂解液中主要的宿主细 胞蛋白来促进纯化本发明支架。在一些实施方式中，热变性、蛋白酶处理或PH改变后剩余的蛋白质是至少50 %、至少55 %、至少60 %、至少65 %、至少70 %、至少75 %、至少80 %、至 少85 %、至少90 %、或至少95 %的特异性支架蛋白。在一些实施方式中，纯化支架的方法包括将含有所述支架的粗制裂解液的pH降 低至约6. 5、或约6. 0、或约5. 5、或约5. 0、或约4. 5、或约4. 0、或约3. 5、或约3. 0、、或约2. 5、 或约2.0以图沉淀宿主细胞蛋白。在其它实施方式中，纯化方法包括将含有所述支架的粗 制裂解液的PH升高至约8. 0、或约8. 5、或约9. 0、或约9. 5、或约10. 0、或约10. 5、或约11. 0、 或约11. 5、或约12.0、或约12.5以图沉淀宿主细胞蛋白。6. 11支架的放大生产为大量获得，可通过放大工艺(下文称为“本发明的放大工艺”)制备本发明支架。 在一些实施方式中，可通过本发明的放大工艺在研究实验室中产生支架，该工艺可放大从 而在分析级生物反应器中(例如但不限于51^、1(^、151^、3(^或5(^生物反应器)产生本发 明支架。在其它实施方式中，可通过本发明的放大工艺在研究实验室中产生支架，该工艺可 放大从而在生产规模的生物反应器中(例如但不限于75L、100L、150L、300L或500L生物 反应器)产生本发明支架。在一些实施方式中，与在研究实验室中进行的生产工艺相比，本 发明的放大工艺不导致或几乎不导致生产率降低。在一些实施方式中，本发明的放大工艺以约lg/L、约2g/L、约3g/L、约5g/L、约 7. 5g/L、约 10g/L、约 12. 5g/L、约 15. Og/L、约 17. 5g/L、约 20g/L、约 25g/L、约 30g/L 或更高 的生产率产生支架。在其它实施方式中，本发明的放大工艺以约10g/L-约300g/L、约10g/L_约250g/ L、约 10g/L-约 200g/L、约 10g/L-约 175g/L、约 10g/L-约 150g/L、约 10g/L-约 100g/L、约 20g/L-约 300g/L、约 20g/L-约 250g/L、约 20g/L_ 约 200g/L, from 20g/L_ 约 175g/L、约 20g/L-约 150g/L、约 20g/L-约 125g/L、约 20g/L_ 约 100g/L、约 30g/L_ 约 300g/L、约 30g/ L-约 250g/L、约 30g/L-约 200g/L、约 30g/L_ 约 175g/L、约 30g/L_ 约 150g/L、约 30g/L_ 约 125g/L、约 30g/L-约 100g/L、约 50g/L_ 约 300g/L、约 50g/L_ 约 250g/L、约 50g/L_ 约 200g/ L、50g/L-约 175g/L、约 50g/L_ 约 150g/L、约 50g/L_ 约 125g/L 或约 50g/L_ 约 lOOg/L 的生 产率产生支架。在一些实施方式中，本发明的放大工艺以约10mg/L、约20m/L、约30mg/L、约50mg/ L、约 75mg/L、约 100mg/L、约 125mg/L、约 150mg/L、约 175mg/L、约 200mg/L、约 250mg/L、约 300mg/L或更高的生产率产生多聚支架。在其它实施方式中，本发明的放大工艺以至少约10mg/L、至少约20m/L、至少约 30mg/L、至少约50mg/L、至少约75mg/L、至少约100mg/L、至少约125mg/L、至少约150mg/L、 至少约175mg/L、至少约200mg/L、至少约250mg/L、至少约300mg/L或更高的生产率产生多 聚支架。在其它实施方式中，本发明的放大工艺以约10mg/L-约300mg/L、约10mg/L_约 250mg/L、约 10mg/L-约 200mg/L、约 10mg/L-约 175mg/L、约 10mg/L-约 150mg/L、约 IOmg/ L-约 100mg/L、约 20mg/L-约 300mg/L、约 20mg/L_ 约 250mg/L、约 20mg/L_ 约 200mg/L、20mg/ L-约 175mg/L、约 20mg/L_ 约 150mg/L、约 20mg/L_ 约 125mg/L、约 20mg/L_ 约 100mg/L、约 30mg/L-约 300mg/L、约 30mg/L_ 约 250mg/L、约 30mg/L_ 约 200mg/L、约 30mg/L_ 约 175mg/ L、约 30mg/L-约 150mg/L、约 30mg/L_ 约 125mg/L、约 30mg/L_ 约 100mg/L、约 50mg/L_ 约300mg/L、约 50mg/L-约 250mg/L、约 50mg/L-约 200mg/L、50mg/L-约 175mg/L、约 50mg/L_ 约 150mg/L、约50mg/L-约125mg/L或约50mg/L_约100mg/L的生产率产生多聚支架。6. 12产生分泌型支架本发明还提供胞内产生支架或以分泌形式产生支架的方法。在一些实施方式中， 分泌型支架的产生水平如本文所述。在其它实施方式中，分泌型支架适当折叠并完全功能 化。在其它实施方式中，分泌型支架的产生包括利用Ptac启动子。在其它实施方式中，分 泌型支架的产生包括利用oppA信号。在还有其它实施方式中，分泌型支架在原核宿主细胞 中表达。在进一步的实施方式中，支架分泌入原核宿主细胞的周质空间。在还有其它实施 方式中，支架直接分泌入培养基。在还有进一步的实施方式中，可从粗制细胞培养液或周质 提取物筛选支架。本发明还提供利用蛋白质支架分泌串联蛋白质或融合物的方法。在一些实施方式 中，本发明支架可用作将肽和/或蛋白质分泌入细胞培养基或原核细胞周质空间中的运载 体分子。在另一实施方式中，纯化本发明支架的方法包括将包含所述支架的粗制裂解液加 热至70°C，15分钟，随后通过离心除去凝聚的化合物。在其它实施方式中，纯化本发明支 架的方法包括将包含所述支架的粗制裂解液加热至约50°C、约55°C、约60°C、约65°C、约 70°C、约75°C、约80°C、约85°C或约90°C，随后通过离心除去凝聚的化合物。在其它实施方 式中，纯化本发明支架的方法包括将粗制裂解液加热至少约1分钟、约2分钟、约3分钟、约 4分钟、约5分钟、约6分钟、约7分钟、约8分钟、约9分钟、约10分钟、约11分钟、约12分 钟、约13分钟、约14分钟、约15分钟、约20分钟或约30分钟，随后通过离心除去凝聚的化 合物。在另一具体实施方式
中，纯化本发明支架的方法包括将粗制裂解液的pH改变至 3. 0，将包含所述支架的粗制裂解液在70°C加热15分钟，然后通过离心除去凝聚的化合物。6. 13检验支架可通过本领域已知的任何方法检验本发明支架与靶标的特异性结合。可采用的代 表性试验包括但不限于采用例如以下技术的竞争性和非竞争性试验系统蛋白质印迹、放 射性免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹心"免疫测定、免疫沉淀试验、沉淀反应、 凝胶扩散沉淀毒反应、免疫扩散试验、凝集试验、补体结合试验、免疫放射测得、荧光免疫测 定，等等。这些试验是本领域已知的常规试验(参见，例如Ausubel等编，1994，最新分子生 物学方法，第1卷，约翰威利父子公司，纽约)。ELISA包括制备抗原(例如，支架)、用抗原包被96孔微量滴定板的孔、将偶连于 可检测化合物，例如酶底物(如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)的感兴趣表位结合蛋白 (例如，支架特异性抗体)加入孔中、温育一定时期并检测抗原是否存在。在ELISA中，感兴 趣的表位结合蛋白不偶连于可检测化合物，而可向孔中加入偶连于可检测化合物的第二抗 体(识别感兴趣的蛋白质)。此外，可将感兴趣的蛋白质包被孔，而不是用抗原包被孔。在 该情况中，可加入偶联于可检测化合物的第二抗体，然后向包被的孔中加入感兴趣抗原。本 领域技术人员应知道可作出改变以增加所检测信号的参数以及本领域已知的ELISA的其 它改进形式。ELISA的其它讨论参见，例如Ausubel等编，1994，最新分子生物学方法，第1 卷，约翰威利父子公司，纽约，11. 2. 1。
可通过本领域已知的各种体外试验方法测得支架对抗原的结合亲和力和其它结 合特性，包括例如平衡方法(如酶联免疫吸附测定(ELISA;或放射性免疫测定(RIA))、或 动力学方法(如BIACORE 分析)和其它方法，例如间接结合试验、竞争性结合试验、荧 光共振能量转移(FRET)、凝胶电泳和色谱(如凝胶过滤)。这些和其它方法可采用检测一 个或多个组分上的标记和/或采用各种检测方法，例如但不限于生色、荧光、发光或同位素 标记。结合亲和力和动力学的详述见Paul，W. E.编，Fundamental Immunology (基础免疫 学)，第 4 版，L&R 公司(Lippincott-Raven)，费城(1999)。可通过许多不同方法增加本发明支架的稳定性。在一个实施方式中，本发明支架 包含非天然产生的二硫键，如本文所述。在另一实施方式中，本发明支架包含N和/或C末 端区域的延伸段。在另一实施方式中，本发明支架包含至少一个氨基酸残基的添加、缺失或 取代以便调节支架的表面电荷。在另一实施方式中，本发明支架包含改变以增加血清半衰 期，如本文所述。在还有另一实施方式中，本发明支架包含至少一个氨基酸残基的添加、缺 失或取代以便稳定支架的疏水核。可通过许多不同技术评估本发明支架的稳定性。选择本领域已知的技术包括解链 温度、示差扫描量热法(DSC)、圆二色性(⑶)、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、蛋白酶耐受性、 等温量热法(ITC)、核磁共振(NMR)、固有荧光和生物学活性。在一个实施方式中，与工程改 造前的同一支架相比，本发明的工程改造支架显示稳定性增加。6. 14药物组合物在另一方面，本发明通过组合物，例如但不限于含有本发明支架或靶标结合蛋白 中的一种或组合，用药学上可接受的运载体配制在一起的药物组合物。这种组合物可包含 本发明不同支架中的一种或组合，例如但不限于两种或更多种。例如，本发明的药物组合物 可包含结合靶抗原上不同表位或具有互补活性的支架组合。本发明的药物组合物还可在组合治疗中，例如与其它药剂组合给予。例如，组合治 疗可包括本发明支架与至少一种其它治疗相组合，其中所述治疗可以是免疫治疗、化疗、放 疗或药物治疗。本发明的药物组合物可包含一种或多种药学上可接受的盐。此类盐的例子包括酸 加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括那些源自无毒性无机酸，如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴 酸、氢碘酸和亚磷酸等的盐，以及源自无毒性有机酸，如脂族单和二羧酸、苯基取代的链烷 酸、羟基链烷酸、芳香酸、脂族和芳族磺酸等的盐。碱加成盐包括衍生自碱土金属，例如钠、 钾、镁、钙等的盐，以及衍生自无毒有机胺，如N，N' -二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁 卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺和普鲁卡因等的盐。本发明的药物组合物也可包含药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化 剂包括(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫 酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚(BHA)、丁基化羟基 甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四 乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。用于本发明药物组合物中的水性和非水性运载体的例子包括水、乙醇、多元醇 (如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)和它们的合适混合物，植物油如橄榄油，以及可注射的有机 酯，如油酸乙酯。可利用涂覆材料如卵磷脂，在分散体的情况中通过保持所需粒度，和使用
53表面活性剂来维持合适的流动性。这些组合物还可包含辅料，如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。可通过灭菌方法 和加入各种抗细菌和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇和苯酚山梨酸等确保防止 存在微生物。组合物中包含等渗剂，如糖、氯化钠等也是理想的。此外，可通过加入能延缓 吸收的物质，例如单硬脂酸铝和明胶实现可注射药物形式的长期吸收。在制备和储存条件下，药物组合物通常必须无菌和稳定。可将组合物制成适合高 药物浓度的溶液、微乳剂、脂质体或其它有序结构。运载体可以是含有，例如水、乙醇、多元 醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及它们的合适混合物的溶剂或分散介质。可利用 涂覆材料如卵磷脂，在分散体的情况中通过保持所需粒度和使用表面活性剂来维持合适的 流动性。在许多情况中，组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化钠的 合适的。组合物中包含延迟吸收的试剂如单硬脂酸盐和明胶可延长可注射组合物的吸收。可视需要将所需量的活性化合物和上述组分中的一种或组合掺入合适溶剂，随后 灭菌和微过滤来制备无菌注射液。通常将活性活化物掺入含有基础分散介质和上述其它所 需成分的无菌载体中来制备分散剂。在用于无菌注射液制备的无菌粉末情况中，优选的制 备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，从之前无菌过滤的溶液得到活性组分和任何其它 所需组分的粉末。在一个实施方式中，本发明组合物(例如，液体制剂)是基本不含内毒素和/或相 关热原物质的无热原制剂。内毒素包括局限在微生物内并且在微生物破坏或死亡时释放 的毒素。热原也包括来自细菌和其它微生物外膜的诱导发热的热稳定性物质(糖蛋白)。 如果给予人，这些物质均可引起发热、低血压和休克。因为有潜在的有害作用，优选的做法 是从静脉内给予的药物溶液中去除即使含量很低的内毒素。食品药品管理局(“FDA") 规定在静脉内药物应用的一小时期间，上限是5内毒素单位(EU)/剂量/千克体重(The United States PharmacopeialConvention, Pharmacopeial Forum(美国药典大会，药典论 坛)26(1) =223(2000)) 0当以数百或数千毫克每千克体重的剂量给予治疗性蛋白时，最好 去除即使痕量的内毒素。在一个实施方式中，组合物中内毒素和热原水平低于10EU/mg、或 低于5EU/mg、或低于lEU/mg、或低于0. lEU/mg、或低于0. 01EU/mg、或低于0. 001EU/mg。在 另一实施方式中，组合物中内毒素和热原水平低于约10EU/mg、或低于约5EU/mg、或低于约 lEU/mg、或低于约 0. lEU/mg、或低于约 0. 01EU/mg、或低于约 0. 001EU/mg。6. 15剂量/给药为了制备包含本发明支架的药物或无菌组合物，将支架与药学上可接受的运载体 或赋形剂混合。可通过与冻干粉末、浆液、水性溶液、洗剂或悬浮液形式的生理上可接受的 运载体、赋形剂或稳定剂混合制备治疗和诊断物质的制剂(参见例如Hardman等(2001) Goodman and Gilman' s The Pharmacological Basisof Therapeutics (古德曼禾口吉尔曼 治疗药理学基础)，纽约州纽约的MGH公司(McGraw-Hill，New York,N. Y.) ；Gennaro (2000) Remington :The Science andPractice of Pharmacy (雷明顿药物科学禾口 实践)； Lippincott, Williams 和 ffilkins,纽约州纽约；Avis 等(编)(1993)Pharmaceutical Dosage Forms :ParenteralMedications (药物剂型胃肠夕卜药物)；纽约州 MD 公司(Marcel Dekker, NY) ；Lieberman 等(编)(1990) Pharmaceutical Dosage Forms :Tablets(药物 剂型片剂)，纽约州 MD 公司；Lieberman 等(编)(1990) Pharmaceutical Dosage Forms Disperse Systems (药物剂型分散体系)，纽约州 MD 公司；Weiner 和 Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety (赋形剂毒性和安全性)，纽约州纽约的MD公司)。治疗剂给药方案的选择依据多种因素，包括实体的血清或组织周转速率、症状的 水平、实体的免疫原性和生物基质中靶细胞的可接近性。在某些实施方式中，在与可接受的 副作用水平相一致的情况下，给药方案尽可能增大递送给患者的治疗剂用量。因此，生物递 送量部分取决于特定实体和所治疗症状的严重程度。选择抗体、细胞因子和小分子的合适 剂量有指南可用(参见例如Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy (抗体治疗)，英国牛津 郡生物科学出版公司(Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK) ；Kresina (编)(1991) MonoclonalAntibodies, Cytokines and Arthritis (单克隆抗体，细胞因子和关节炎)，纽 约MD公司(Marcel Dekker,New York,N. Y.) ；Bach(H) (1993)Monoclonal Antibodiesand Peptide Therapy in Autoimmune Diseases (自身免疫病中的单克隆抗体和多肽治疗)， 纽约 MD 公司(Marcel Dekker, New York, N. Y.) ；Baert 等(2003) NewEngl. J. Med. 348 601-608 ；Milgrom 等(1999)New Engl. J. Med. 341 :1966_1973 ；Slamon 等(2001)New Engl. J. Med. 344 :783_792 ；Beniaminovitz,等(2000)NewEngl. J. Med. 342 :613_619 ；Ghosh 等 (2003) New Engl. J. Med. 348 :24_32 ；Lipsky 等(2000) New Engl. J. Med. 343 1594-1602)。临床医生使用本领域已知或怀疑会影响治疗或估计会影响治疗的参数或因素来 确定合适的剂量。通常，以稍低于最佳剂量的用量开始，然后少量递增直至相对任何不良副 作用达到所需或最优效果。重要的诊断手段包括检测如炎症症状或炎性细胞因子产生水 平。可改变本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平，从而获得有效实现特定患 者、组成与给药方式的所需治疗应答而对患者无毒的活性成分用量。所选剂量水平取决于 各种药代动力学因素，包括所用的本发明特定组合物或其脂、盐、酰胺的活性，给药途径，给 药时间，所用特定化合物的排出率，治疗持续时间，与所用特定组合物联用的其他药物、化 合物和/或材料，年龄、性别、体重、病症、整体健康状况、所治疗病人的既往医疗史以及医 学领域熟知的类似因素。本发明支架可通过连续输注提供，或以如1天、1周或每周1-7次的间隔提供。可通 过静脉内、皮下、局部、口服、鼻部、直肠、肌肉内、脑内或吸入的方式提供剂量。具体的给药 方案涉及避免显著不良副作用的最大剂量或给药频率。每周总剂量可以是至少0. 05μ g/kg 体重、至少 0. 2μ g/kg、至少 0. 5μ g/kg、至少 1 μ g/kg、至少 10 μ g/kg、至少 100 μ g/kg、至少 0. 2mg/kg、至少 1. 0mg/kg、至少 2. 0mg/kg、至少 10mg/kg、至少 25mg/kg 或至少 50mg/kg (参 见如 Yang等(2003) New Engl. J. Med. 349 427-434 ；Herold等(2002) New Engl. J. Med. 346 1692-1698 ；Liu 等(1999) J. Neurol. Neurosurg. Psych. 67 :451_456 ；Portielji 等(20003) Cancer Immunol. Immunother. 52 133-144)。以摩尔/千克体重计,小分子治疗剂,例如肽 模拟物、蛋白质支架、天然产物或有机化学物质的所需剂量大致与抗体或多肽的相同。以 摩尔/千克体重计，小分子或支架治疗剂的所需血浆浓度大致与抗体相同。该剂量可以是 至少15 μ g、至少20 μ g、至少25 μ g、至少30 μ g、至少35 μ g、至少40 μ g、至少45μ g、至 少50 μ g、至少55 μ g、至少60 μ g、至少65 μ g、至少70 μ g、至少75 μ g、至少80 μ g、至少 85μ g、至少90μ g、至少95 μ g或至少100 μ g。给予对象的剂量可以是至少1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12 或更多次。
对于本发明支架，给予患者的剂量可以是0. 000 lmg/kg-100mg/kg患者体 重。该齐U 量可以是 0. 0001mg/kg-20mg/kg、0. 0001mg/kg-10mg/kg、0. 0001mg/kg_5mg/ kg、0.0001-2mg/kg、0. 0001-lmg/kg、0. 0001mg/kg-0. 75mg/kg、0. 0001mg/kg-0. 5mg/ kg、0. 0001mg/kg-0. 25mg/kg、0. 0001-0. 15mg/kg、0. 0001-0. 10mg/kg、0. 001-0. 5mg/kg、 0. 01-0. 25mg/kg 或 0. 01-0. lOmg/kg 患者体重。可以用以千克(kg)计的患者体重乘以以mg/kg计的待给予剂量来计算本发明 支架的剂量。本发明支架的剂量可以是150μg/kg患者体重或更少、125μg/kg或更少、 100 μ g/kg或更少、95 μ g/kg或更少、90 μ g/kg或更少、85 μ g/kg或更少、80 μ g/kg或更少、 75 μ g/kg或更少、70 μ g/kg或更少、65 μ g/kg或更少、60 μ g/kg或更少、55 μ g/kg或更少、 50 μ g/kg或更少、45 μ g/kg或更少、40 μ g/kg或更少、35 μ g/kg或更少、30 μ g/kg或更少、 25 μ g/kg或更少、20 μ g/kg或更少、15 μ g/kg或更少、10 μ g/kg或更少、5 μ g/kg或更少、 2. 5 μ g/kg或更少、2 μ g/kg或更少、1. 5 μ g/kg或更少、1 μ g/kg或更少、0. 5 μ g/kg或更少 或0. 5 μ g/kg或更少。本发明支架的单位剂量可以是0. lmg-20mg、0. lmg-15mg、0. lmg_12mg、 0. lmg-10mg、0. lmg-8mg、0. lmg-7mg、0. lmg-5mg、0. 1-2. 5mg、0. 25mg-20mg、0. 25_15mg、 0. 25_12mg、0. 25_10mg、0. 25_8mg、0. 25mg_7mg、0· 25mg_5mg、0· 5mg-2. 5mg、lmg_20mg、 Img-15mg、lmg-12mg、Img-IOmg、lmg_8mg、lmg_7mg、lmg_5mg 或 lmg-2. 5mg。本发明支架的剂量在对象中可达到的血清滴度为至少0. 1 μ g/ml、至少0. 5 μ g/ ml、至少 1 μ g/ml、至少 2 μ g/ml、至少 5 μ g/ml、至少 6 μ g/ml、至少 10 μ g/ml、至少 15 μ g/ ml、至少 20 μ g/ml、至少 25 μ g/ml、至少 50 μ g/ml、至少 100 μ g/ml、至少 125 μ g/ml、至 少 150 μ g/ml、至少 175 μ g/ml、至少 200 μ g/ml、至少 225 μ g/ml、至少 250 μ g/ml、至少 275 μ g/ml、至少 300 μ g/ml、至少 325 μ g/ml、至少 350 μ g/ml、至少 375 μ g/ml 或至少 400 μ g/ml0或者，本发明支架的剂量在对象中可达到的血清滴度为至少0. 1 μ g/ml、至少 0. 5 μ g/ml、至少 1 μ g/ml、至少 2 μ g/ml、至少 5 μ g/ml、至少 6 μ g/ml、至少 10 μ g/ml、至少 15 μ g/ml、至少 20 μ g/ml、至少 25 μ g/ml、至少 50 μ g/ml、至少 100 μ g/ml、至少 125 μ g/ ml、至少 150 μ g/ml、至少 175 μ g/ml、至少 200 μ g/ml、至少 225 μ g/ml、至少 250 μ g/ml、至 少 275 μ g/ml、至少 300 μ g/ml、至少 325 μ g/ml、至少 350 μ g/ml、至少 375 μ g/ml 或至少 400 μ g/ml。可重复给予本发明支架的剂量，给药间隔至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、30 天、45天、2个月、75天、3个月或至少6个月。特定病人有效量可以根据诸如所治疗的病症、病人总体健康、给药方法途径和剂 量以及副作用严重性等因素而有所不同(参见如Maynard等(1996)AHandbook of SOPs for Good Clinical Practice (药物临床试验质量管理规范SOP手册)，佛罗里达州伯克莱屯英 特法姆出版社(Interpharm Press, Boca Raton, Fla. ) ；Dent (2001) Good Laboratory and Good Clinical Practice (药物实验室和临床试验质量管理规范)，英国伦敦UP公司(Urch Publ. , London, UK)。给药途径可以通过，例如局部或皮肤应用、静脉内注射或输液、腹膜内、脑内、 肌肉内、眼内、动脉内、脑脊髓内、病损内或缓释系统或植入物(参见例如Sidman等 (1983)Biopolymers 22 547-556 ；Langer 等(1981)J. Biomed. Mater. Res. 15 167-277 ；Langer(1982)Chem. Tech. 12 98-105 ；Epstein 等(1985)Proc.Natl. Acad. Sci. USA 82 3688-3692 ；Hwang ^ (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030-4034;美国专利号 6，350466和6，316，024)。如果需要，组合物也可含有增溶剂和局部麻醉剂，例如利多卡因 来减轻注射部位的疼痛。此外，也可采用肺部给药，例如利用吸入器或喷雾器，和用雾化 剂配制。参见例如美国专利号 6，019，968,5, 985，320,5, 985，309,5, 934，272,5, 874，064、 5，855，913、5，290，540 和 4，880，078 ；以及 PCT
发明者B·查科, H·吴, J·斯维斯, M·巴卡 申请人:米迪缪尼有限公司