专利名称：蛋白质制品的制作方法
蛋白质制品发明领域本发明涉及到对蛋白质以及其他的生物学分子以及超分子系统所进行的稳定，特别是对能够在它们的三维结构中与金属离子进行结合的这样的分子所进行的稳定，其中所述的金属离子例如是钙离子，特别是在水性系统中对这样的蛋白质所进行的稳定，其中所述的水性系统例如是在水溶液中，在水性的凝胶形式中或者在非液态的状态下例如固态状态下，其中存在游离的水或者结合的水，例如，是在冷冻的条件下或者在经过了水的部分除去的情况下，其中所述的冷冻条件或者水的部分除去的情况例如是通过干燥或者冷冻干燥来实现的。
背景技术：
许多生物学分子以及超分子系统是不稳定的并且当它们被储存时容易发生结构的分解以及随之而来的活性的丧失，特别是在水性溶液中时，其中所述的生物学分子以及超分子系统是例如蛋白质，病毒样的粒子或者减弱病毒。在蛋白质的分解过程中所涉及到的所述过程可以被划分为物理性的(即，作用于非共价的相互反应的过程，例如四级结构的丧失，三级结构的丧失或者二级结构的丧失，聚合，表面吸附)以及化学性的(即，涉及到一种共价变化的过程，例如去酰胺化，氧化，二硫键的争夺，等等)。所述的分解过程所具有的速度一般而言与温度成比例。生物学分子以及超分子系统也因此一般而言在较低的温度下更为稳定。金属蛋白质是蛋白质的一种类型，所述的蛋白质在它们的结构中含有一个或者多个金属离子。所述的金属离子可能是一个更为复杂的化学组成部分(例如，血红素)中的一个部分，其中所述的化学组成部分结合于所述的蛋白质结构之中。或者可供选择的，所述的金属离子可能与一个或者多个氨基酸侧链进行了直接的结合，其中所述的氨基酸侧链存在于所述的蛋白质的结构之中，这种直接的结合是经由各种不同的非共价相互反应(配位相互反应，氢键，电荷-电荷间的相互反应，等等)来进行的。然而，在一些情形下，所述的金属对于所述的蛋白质所具有的生物学活性而言是至关重要的，在其他的情形下，它仅仅起到了一种结构上的作用。然而在一些情形下，例如在所述的VIII因子分子中，所述的金属在两个蛋白质亚单元之间形成了一个桥接，在其他的情形下，例如在重组的炭疽保护性抗原中，所述的金属被限制在一个亚单元之内。所述的金属从所述的蛋白质结构上的缺失可能会影响到所述的蛋白质所具有的功能和/或结构。所述的金属的缺失能够导致关键性结构域的物理分离或者在一个结构域内发生构象上的变化，这取决于所述的金属在所述的蛋白质分子中所存在的位置。因此，为了维持所述的蛋白质所具有的天然结构，在一种制品中对所述的蛋白质进行保持是非常重要的，其中在所述的制品中，存在于所述金属与所述的蛋白质的氨基酸结构之间的结合相互反应被得以了最佳程度的维持。发明概述本发明是基于对蛋白质以及其他的生物学分子以及超分子系统制品的几个令人期望的方面的发现而产生的，特别是在这样的分子蛋白质的稳定方面，其中所述的分子蛋白质能够在它们的三维结构中与金属离子进行结合，其中所述的金属离子例如是钙离子。执行这些方面中的部分或者全部能够导致那些分子在储存过程中具备相当程度的稳定性。在一些方面，本发明致力于金属蛋白质的最佳制品。然而，本发明并不局限于金属蛋白质并且可以被用在任何的生物学分子或者超分子系统中。
具体实施例方式存在几种亚类型的金属蛋白质。一种主要的亚类型，是在它们的三级结构中含有钙离子(Ca2+)的蛋白质。这些蛋白质通常具有重要的生物学功能。可商业购买获得的重要的含钙蛋白质包括那些在所述的血液凝固级联中涉及到的血液因子(例如，VIII因子， VIIa因子)，各种不同的葡萄糖苷酶，重组的炭疽保护性抗原(rPA)，某些过氧化物酶，等等。另外一种亚类型的金属蛋白质是含有血红素的蛋白质，例如过氧化氢酶或者过氧化物酶。在这些情形中，所述的金属(离子)被结合在一个更为复杂的结构(血红素)之中，所述的更为复杂的结构继而被结合在所述的蛋白质的三级结构之中。各种不同的其他金属离子可能是所述的蛋白质结构中的一个至关重要的部分，其中所述的金属离子是例如锌，铜或者镁。
存在于所述的金属离子与蛋白质的三级结构之中的氨基酸残基之间的所述相互反应的确切细节可以通过各种不同的来源被非常容易的获得，其中所述的各种不同的来源是所述的公众领域中可以获得的，例如所述的Protein Data Bank(蛋白质数据银行) (http://pdbbeta. rcsb. orR/pdb/home/home, do)。因此，{列如，可以从所述的Protein Data Bank(蛋白质数据银行)网页信息上获得下述与所述的重组炭疽保护性抗原相关的信息
(Petosa et al. Anthrax protective antigen ；code IACC-Petosa 等人炭疽保护性抗原；编码1ACC)每一个重组的炭疽保护性抗原(rPA)分子中含有两个钙离子。所述的钙离子与几个氨基酸侧链进行了结合，其中所述的氨基酸侧链存在于所述的重组的炭疽保护性抗原(rPA)分子所具有的四个结构域中的一个之中。所述的结合相互反应是具有非共价性质的并且包括桥接的氢键，电荷_电荷间的相互反应以及配位相互反应。已经识别出了钙离子与存在于所述的重组的炭疽保护性抗原(rPA)结构域之中的下述氨基酸侧链之间的相互反应Asp (天冬氨酸)177，Asp (天冬氨酸)179，Asn (天冬酰胺)180，Asp (天冬氨酸)181，Asp (天冬氨酸)185，Glu (谷氨酸)188，Ser (丝氨酸)222，Glu (谷氨酸)224， Lys (赖氨酸)225以及Asp (天冬氨酸)235。在它们的侧链上带有羧基基团的那些氨基酸， 即，天冬氨酸(Asp)或者谷氨酸(Glu)，似乎在形成与钙离子之间的结合相互反应的方面是格外有效的，其中所述的结合相互反应是发生在所述的蛋白质结构之中的，这是因为它们的电荷状况以及许多个可以利用的游离的电子对。
一种生物学分子或者超分子系统的典型的制品中(例如，一种治疗性的蛋白质或者一种疫苗)含有缓冲剂(例如磷酸盐或者柠檬酸盐)并且一般而言含有一种或者多种下述的组成成分张力调节剂(一般而言是无机酸或者氨基酸)，表面活性剂(例如聚山梨醇酯80)以及糖类或者多元醇(例如蔗糖)。一些可以商业购买获得的含有钙的蛋白质制品中包括阳离子钙，一般而言是以氯化钙的形式存在的。因此，例如，Kongenate，一种可以商业购买获得的重组的VIII因子产品，其中含有2-3毫摩的氯化钙，以及组氨酸(18-23毫摩)，双甘氨肽(21-25克/升)，蔗糖(0.9-1.3%)以及聚山梨醇酯80 (35微克/毫升)。 这个例子证明了在一种蛋白质的制品中存在所述的金属阳离子的重要性，其中在所述的蛋白质中，已经基本上认识到在其结构中含有所述相同的阳离子。
基本上被认为能够作为一种蛋白质制品中的辅料的每一个化合物都具有某种程度的能力，能够与金属进行结合，从而导致了络合离子的形成。这样的络合离子是由一个存在于所述的中央的金属离子与围绕所述金属离子的一个或者多个其他分子所构成的。围绕着所述的中央金属离子的所述分子被称为配体。可以使用路易斯(Lewis)酸碱理论对在所述的金属离子与配体之间发生的所述络合离子的形成进行最佳的解释。所有的配体均含有至少一对孤对电子并且因此被认为是路易斯碱。所有的金属阳离子在它们的较外层电子层中均含有空的电子轨道并且因此被认为是路易斯酸。通过接受一对或者多对来自于其他分子(配体)中的孤对电子，所述的这些轨道所具有的能量能够被降低，这能够积极的产生更为稳定的系统。如果所述的金属阳离子所具有的全部可以利用的空轨道均被电子进行了填充，那么所述的系统具有最低的能量(并且因此是最为稳定的)，其中所述的电子来自于所述的配体所具有的孤对电子。在一个金属离子与一个配体之间所形成的所述的键被称之为配位键。一些配体中仅仅具有一对孤对电子，所述的孤对电子能够与所述的中央金属离子形成一个键。这样的配体被称之为单齿的。在许多情形中，所述的中央的金属离子被几个单齿配体进行了围绕。然而，一些配体在它们的分子中具有这样的孤对电子的分布，使它们能够与所述的中央金属离子形成两个或者更多个配位键并且被称之为多齿的(双齿的，三齿的，等等)。因此，1，2_ 二氨基乙烷是一种双齿配体的一个例子，血红素是一种四齿配体的一个例子并且乙二胺四乙酸(EDTA)是一种六齿配体的一个例子。包含有多齿配体的所述的络合离子被称之为螯合物。螯合物相比较于包含有单齿配体的络合物而言是更为稳定的，所述的稳定性(即，所述的配体所具有的整体的金属结合强度)随着所述的孤对电子对的数量的增加而增强，其中所述的孤对电子对的数量指的是一个配体分子能够参与到所述的螯合形成反应中的孤对电子对的数量。出于这种原因，与使用一种六齿配体所进行的螯合相比，由六个单齿配体进行围绕的金属所进行的结合的强度发生了显著性的降低。
在一种金属与一种配体之间形成的所述的键遵循动力化学平衡的原理，并且因此能够利用平衡常数来对其进行描述，其中所述的平衡常数有时被称之为“稳定性常数”，如下(M=金属，L=配体) M+L —M-L K = [M-L] / [M] [L] 当不止一个配体分子能够与所述的中央金属离子进行结合时，在那样的情形中， 所述的化学平衡可以通过一系列的平衡常数来进行描述 Kl = [M-L]/[M] [L] K2 = [M-L2] / [M-L] [L] K3 = [M-L3] / [M-L2] [L] 等等。
或者可供选择的，一个整体的稳定性常数可以被用来对所述的多齿配体所具有的结合能力进行量化，如下 K = [M-LJ/[M] [L] 其中[M-LJ代表的是所述的各种不同形式的金属_配体络合物所具有的整体浓度，[M]代表的是所述的游离金属所具有的浓度并且[L]代表的是所述的游离配体所具有的浓度。由于所述的稳定性常数所具有的数值通常是非常高的，通常情况下将它们表示为以10为底的对数(log K)。
可以从一个全面的数据库中获得所述的金属_配体络合物所具有的整体的稳定性常数，其中所述的数据库是由美国标准与技术研究院(the US National Institute of Standards and Technology)(美国标准与技术研究院参考数据库46，参见R. M. Smith以及 A. E. Martell 发表的文章CriticalIy Selected Stability Constants ofMetal Complexes Database《金属络合物数据库中的临界筛选的稳定性常数》)。这个数据库中列出了超过 49000个稳定性常数，涵盖了存在于各种不同的氧化状态下的6173种配体以及216种金属离子。只要存在于所述的系统之中的所述金属的整体(即，结合的+未结合的)浓度是已知的，并且存在于所述的系统之中的所述配体的整体(即，结合的+未结合的)浓度是已知的，本领域技术人员将能够通过所述的稳定性常数计算出所述的游离金属所具有的浓度以及在所述的络合物中发生结合的所述的金属所具有的浓度。
所述的IogK的数值在大约0至大于15的范围之内。对于一种特定的金属而言， 在单齿配体的情形中所述的log K的数值将是最低的，并且所述的数值将伴随着配体可以参与到所述的配位键(双齿的，三齿的，等等)中的孤对电子的数量而增加。然而，所述的 log K的数值同样非常依赖于所述的金属以及在较外层的电子层中所述的空置的电子轨道的数量。因此，例如，在铜与组氨酸之间形成的所述的络合物所具有的log K是10. 16，而在铜与乙二胺四乙酸(EDTA)之间形成的所述的络合物所具有的log K是18. 78，而在钙与乙二胺四乙酸(EDTA)之间形成的所述的络合物所具有的log K是10.81。
具有高的log K的配体将与存在于所述的系统之中的大部分金属离子进行结合， 只要它们所具有的浓度等于或者高于所述的金属所具有的浓度即可。如果具有高的log K 的配体所具有的浓度低于所述的金属所具有的浓度，它们将主要以所述的金属-配体络合物的形式存在并且所述的游离配体所具有的浓度将是最低程度的。然而，重要的是，即使是具有相对低的log K的配体在与所述的金属离子进行结合的方面仍然是非常有效的，其中所述的log K例如是在1和2之间。因此，例如，一种log K等于2的配体，当其所具有的浓度比所述的金属所具有的浓度高两倍时，所述的配体将与大于99%的所述金属发生结合。
在大部分的水性系统中，将有大量的配体进行结合金属的竞争。在平衡状态下，所述的金属离子中的一部分将是游离的(即，未结合的)，同时有一部分将与各种不同的配体进行结合。如果被包含在内的所述的金属所具有的总浓度是已知的，被包含在内的所述的每一种配体所具有的总浓度是已知的并且被包含在内的所述的全部络合物所具有的稳定性常数是已知的，则可以确定全部的种类所具有的平衡浓度。本领域技术人员将能够通过所述的稳定性常数以及存在于所述系统之中的所述的金属所具有的整体浓度以及存在于所述系统之中的所述的全部配体所具有的整体浓度，计算出存在于所述的系统之中的所述的游离金属所具有的浓度以及所述的全部金属络合物所具有的浓度。一般来说，如果两种配体所具有的log K之间的差异大于1，那么所述的金属离子将主要与所述的具有较高的 log K的配体进行络合，并且如果所述的金属浓度超过了所述的较强配体所具有的浓度时， 所述的金属离子与所述的具有较低的log K的配体之间所进行的结合才将变得显著。
在金属-配体络合物、游离的金属离子以及游离的配体之间形成的所述的平衡状态是一种动态的过程。因此，当存在于所述的系统之中的全部种类所具有的浓度在平衡状态下保持恒定时，所述的金属离子将在所述的配体之间进行连续的交换。相类似的，在所述的游离的金属离子同那些与所述的配体发生结合的金属离子之间将存在着一种连续的交换。与在具有非常不同的稳定性常数的配体之间所进行的交换相比，在具有类似的稳定性常数的配体之间所进行的金属离子的交换将发生的更加容易。相类似的，与一种具有高稳定性常数的配体相比，存在于所述的游离的金属同与一种具有低稳定性常数的配体发生结合的金属之间所进行的所述金属的交换将发生的更加容易。
在任意一种生物学分子的结构之中，存在有许多个能够与一种金属离子形成配位键的位点，其中所述的生物学分子例如是一种蛋白质或者是一种病毒。因此，所述的生物学分子将能够与存在于所述的制品之中的金属离子形成各种不同的络合物。这样的络合物可能是有害的，因为它们可以通过在两个分子之间形成一种桥接的方式来促成所述的生物学分子的聚合作用。那些能够与氨基酸的侧链或者与所述的生物学分子中的其他表面组成成分形成非常强劲的配位键的金属离子在促成聚合作用的方面而言是尤其有效的，其中所述的金属离子例如是铜或者锌，而那些能够与所述的氨基酸的侧链形成较弱的络合物的金属将在促成所述的蛋白质的聚合作用方面具有较小的可能性，其中所述的金属例如是钙离子。因此，例如，在室温下，已经发现0. 2毫摩的铜离子或者锌离子的存在能够导致人类生长激素的快速的聚合作用，而钙离子即使是以2毫摩的浓度水平存在仍然会生成一种可以忽略的作用。
除此之外，某些金属，例如铜或者铁，可以在水性制品中对氧化过程进行催化，特别是在有紫外(UV)光存在的条件下，因此能够进一步的促成所述的生物学分子的分解。因此，通常期望从所述的生物学分子制品中除去金属。
然而，各种不同的生物学分子，尤其是那些具有需要依赖于一种特定的金属离子的功能和/或结构的生物学分子，能够因为在所述的制品中存在有这样的金属离子而获得益处。在这样的情形中，在所述的制品中建立一种金属离子的最佳平衡是很重要的，这样一来，所述的至关重要的金属离子是存在的，同时所述的由金属促成的聚合作用被降低到最小程度。本发明就致力于这样的制品。
在生物学分子的传统制品中所使用到的几乎全部的化合物都具有一定程度的能力，能够与金属进行结合从而导致络合离子的形成，特别是在治疗用途中所使用到的生物学分子。这样的过程非常有可能对那些生物学分子的结构所具有的稳定性产生威胁，所述的威胁是通过对存在于所述的生物学分子与所述的金属之间的配位键进行干扰而产生的， 因为这些生物学分子所具有的结构在一定程度上依赖于与一种金属离子之间所进行的适当的结合。
所述的金属_配体键所存在的动力学原理，正如上文中所解释到的，同样可以被应用在金属之上，其中所述的金属被结合在一种蛋白质或者另外一种生物学分子的结构之中。所述的动力学平衡掌管着在存在于所述的制品之中的生物学分子、金属离子以及辅料之间所发生的相互反应，这将在下文中进行解释，使用蛋白质作为生物学分子的一个典型的例子。然而，所述的相同的原理可以被应用在任何其他的生物学分子或者一种超分子系统之上，其中所述的生物学分子或者超分子系统例如是核酸，病毒样粒子或者完整病毒。
只要所述的配体能够接近存在于所述的蛋白质结构之中的所述的金属结合位点， 在所述的蛋白质所具有的结合位点以及存在于所述的制品之中的其他配体之间将存在着一种持续的对金属的竞争。对于某些配体而言，对存在于所述的蛋白质结构之中的所述金属离子的接近作用受到了限制，这归因于所述配体所具有的电荷和/或大小，特别是当所述的金属深深的存在于所述的蛋白质结构之中时。
如果存在于所述的蛋白质结构之中的金属的结合对于其功能和/或结构而言是有益的，那么减少对于金属结合的竞争是重要的，其中所述的金属结合的竞争是由存在于所述的制品之中的配体产生的，其目的在于降低所述的金属离子从所述的蛋白质结构中流失的速率以及随之而产生的变性。在某种程度上，这可以通过向所述的蛋白质制品中添加所述金属离子的来源来实现。上述被添加的金属离子之后能够占据所述的配体并且继而具有较小的可能性去对所述的金属进行干扰，其中所述的金属在所述的蛋白质之中进行了结合。然而，对所述的配体与所述的关键金属离子进行结合的力量进行降低是同等重要的，其中所述的配体围绕着所述的蛋白质。这可以通过下述方式来实现(a)对存在于所述的蛋白质制品(例如，缓冲剂或者张力调节剂)中的具有非常低的稳定性常数(即，log K)的化合物进行筛选并且(b)将它们所具有的浓度保持在最低水平上。尽管大体上已经意识到需要避免在这样的蛋白质制品中存在有非常强劲的络合试剂，但具有相当低的稳定性常数的配体所产生的作用可能被低估了，其中所述的非常强劲的络合试剂即具有相当高的稳定性常数的化合物(例如乙二胺四乙酸)。然而，由于所述的金属结合所存在的动力学原理， 使得存在某种可能性，即使一种具有相对低的稳定性常数的化合物将能够参与金属结合的竞争。在对所述的金属结合所进行的竞争中，尽管具有较低的稳定性常数的所述化合物将不会像强劲的络合试剂那样有效，但它们仍然能够在一段很长的时间段内(例如，在所述蛋白质的储存过程中)构成所述的竞争。
到目前为止，存在于所述的蛋白质制品中的所述金属-配体的平衡状态在动力学方面所具有的重要性以及随之产生的辅料在所述的金属结合的竞争方面所起到的作用可能是被低估的，并且是本发明所致力于的，其中所述的辅料具有相对低的稳定性常数。
重要的是，仅仅是游离形式的所述配体能够参与到金属离子结合的竞争中去，其中所述的游离形式的配体即在所述的特定的时间点处没有与一种金属离子进行结合的所述的配体分子。所述的游离形式的配体所具有的浓度取决于存在于所述的系统之中的所述配体所具有的总浓度以及所述金属离子所具有的总浓度。因此，如果在所述的系统之中不存在金属离子，那么所述的游离形式的配体所具有的浓度等于所述的配体所具有的总浓度。当在所述的系统之中存在有所述的金属离子时，所述的游离形式的配体所具有的浓度将总是低于所述的总配体浓度，因为所述配体中的一部分将与所述的金属进行结合。
在本发明的上下文中，重要的是应当意识到，如果存在于所述的系统之中的所述金属离子所具有的浓度高于一种非常强劲的络合试剂(即，具有非常高的稳定性常数的配体)所具有的浓度，那么所述的游离形式的这种配体所具有的浓度是可以忽略不计的。与之相反的，在这样的系统中，如果所述的配体所具有的稳定性常数相对较低，那么所述的游离形式的配体所具有的浓度将会较高。这将在下述的例子中被得到证实 系统1中包括5毫摩的钙离子以及4毫摩的乙二胺四乙酸(EDTA)(—种强劲的络合试剂，log K = 10. 81)； 系统2中包括5毫摩的钙离子以及4毫摩的组氨酸(一种温和的络合试剂，log K =1.21)； 系统3中包括5毫摩的钙离子，4毫摩的乙二胺四乙酸(EDTA)以及4毫摩的组氨酸。
所述的游离形式的配体所具有的平衡浓度如下 在系统1中，所述的游离的乙二胺四乙酸(EDTA)所具有的浓度为6. 2X10_"毫摩； 在系统2中，所述的游离的组氨酸所具有的浓度为0. 197毫摩； 在系统3中，所述的游离的乙二胺四乙酸(EDTA)所具有的浓度为6. 2X10_"毫摩并且所述的游离的组氨酸所具有的浓度为3. 02毫摩。
上述例子证明了 一种配体在金属结合的竞争方面所具备的能力不仅仅取决于这种配体所具有的log K的数值，同样取决于在所述的系统中是否有其他的组成成分的存在， 其中所述的金属是存在于蛋白质的结构之中的。因此，尽管乙二胺四乙酸(EDTA)是一种非常强劲的络合试剂，在系统1或者系统3中其所具有的在所述的蛋白质的结构之中在金属结合的竞争方面所具备的能力是可以忽略不计的，这归因于它的游离形式所具有的非常低的浓度。在系统2或者系统3中，组氨酸所具有的在所述的蛋白质的结构之中在金属结合的竞争方面所具备的能力可能更高，这归因于它的游离形式所具有的更为有影响意义的浓度。尽管所述的事实是组氨酸是一种相当弱的络合试剂。这些原理在本发明中的某些方面是很重要的。
在传统的蛋白质制品中所使用到的一些化合物能够使各种金属离子发生沉淀。例如，钙离子，能够结合在许多蛋白质所具有的三级结构之中的最为普遍的金属离子中的一种，可以被磷酸阴离子或者碳酸阴离子进行沉淀。这样的过程对于所述的蛋白质而言是有害的，因为(a)它们使得所述的蛋白质失去了至关重要的金属离子并且(b)它们导致了不可溶的粒子的形成，所述的不可溶的粒子的存在在某些蛋白质制品中是不能被接受的，其中所述的蛋白质制品是例如那些用于治疗目的的蛋白质制品。
因此，在一种蛋白质制品中对能够导致所述的金属发生沉淀的任何种类进行避免是至关重要的，其中所述的金属结合在所述的蛋白质结构之中。例如，当一种蛋白质在其三级结构之中结合了钙时，在对所述的蛋白质进行配制时，避免使用所述的磷酸盐缓冲液或者碳酸盐缓冲液是至关重要的。尽管所述的沉淀现象并不能够必然导致所述的蛋白质功能的丧失，但是在许多应用中，即使是非常小的程度的沉淀都是不能够被接受的，其中所述的应用例如是制药学上的应用。
当一种蛋白质并不是金属蛋白质时，在所述蛋白质的制品中同样具有能够引起金属沉淀的可能性，其中所述的金属蛋白质即，不必然需要一种金属的存在来维持它们所具有的天然构象或者它们所具有的功能的蛋白质。这是因为一些金属离子可以被连接在所述的蛋白质结构之上，这种连接是蛋白质的下游加工或者上游加工所产生的结果。因此，在经过所述的加工之后，金属离子能够被结合在所述的蛋白质的表面之上，通过存在于所述的制品之中的辅料(例如，缓冲剂)的作用，这种结合能够导致(a)所述蛋白质的更加快速的聚合以及(b)所述的金属离子的沉淀。本发明致力于这项问题。
重要的是应当意识到，溶解气体的分子同样能够促成对所述的金属结合的竞争。 尽管所述的溶解气体_金属络合物的配位化学还没有像其他配体的金属络合物的配位化学那样被进行全面的研究，但是在对许多种这样的络合物进行定义的所述文献中存在各种不同的报道。在包含了溶解气体配体的络合物中，二氧化碳-金属络合物(对其回顾可参见Gibson D. H.(于 1999 年)在 Coordination Chemistry Reviews《配位化学回顾》185-186， 335-355中发表的文章)可能是被进行了最佳研究的络合物。除了与一种金属进行直接的结合之外，二氧化碳同样能够可以通过产生各种不同的碳酸盐种类来促成间接的金属结合，其中所述的碳酸盐种类是能够与金属发生结合的。这归因于下述的事实在水性溶液中，二氧化碳是以碳酸以及各种不同的碳酸阴离子的平衡状态而存在的 C02+H20 — H2CO3 — H++HCCV — 2H++C032_ 碳酸阴离子并不仅仅能够与金属之间形成络合物，但是在某些情形中同样能够引起它们的沉淀。
氧气是能够作为一种配体来发挥作用的溶解气体中的另外一个例子，从而形成溶解气体_金属络合物。例如，氧气与所述的血红素中的铁之间所进行的配位结合能够促成血红蛋白对氧气的运输。所述的氧气分子中具有四对可以利用的孤对电子，所述的孤对电子中的某些能够参与到所述的金属结合之中。有许多其他的气体同样属于路易斯碱并且能够因此与金属离子一同参与到配位键的形成过程中。
一般而言，所述的溶解气体对所述的金属竞争作用的促成作用可能被低估，这存在几个原因。首先，这些辅料的存在是天然形成的，而不是向所述的制品中特意添加的，这归因于由所述的气态的顶部空间所产生的平衡状态。溶解气体因此在通常情况下不会作为治疗性的蛋白质的水性制品中的辅料被列出。其次，存在于所述的水性溶液之中的所述的溶解气体所具有的浓度是非常低的，这归因于它们所具有的非极性的疏水性质。第三，除了氧气之外，所述的溶解气体在化学性质上而言是非常惰性的，并且因此不能够参与到发生在一种水性制品中的化学变化中去。氧气可能会参与到氧化过程中，但是它对于所述的系统之中的金属_配体的平衡所产生的促成作用到目前为止仍然没有被认知。
所述的气体所具有的溶解性存在相当大的变化，并且同样取决于所述的溶液所具有的其他参数，例如离子强度，温度等等。在一种恒定的温度下，在一种给定类型的液体中， 溶解在所述液体中的一种给定的气体所具有的浓度与所述的气体所具有的分压强是呈直接比例的，其中所述的气体所具有的分压强是与所述的液体达到平衡状态时的分压强。在给定的温度下，可以通过溶解气体所具有的分压强以及亨利常数(Henry’ s constant)来计算存在于一种液体之中的所述的溶解气体所具有的浓度，其中所述的分压强是与所述的液体达到平衡状态时的分压强，所述的亨利常数指的是针对这种液体以及温度下的亨利常数 [G] = p/k 其中[G]代表的是存在于所述的液体之中的所述的溶解气体所具有的浓度，ρ指的是所述的分压强并且k指的是所述的亨利常数。在25°C下，用于表示气体的溶解性的亨利常数的例子是 氧气769. 2 (升标准大气压)/摩尔((L atm) /mol) 二氧化碳29· 4 (升标准大气压)/摩尔((L atm) /mol) 氢气1282. 1 (升标准大气压)/摩尔((L atm) /mol) 氮气1800 (升标准大气压)/摩尔((L atm) /mol) 因此，二氧化碳显然是上述气体中最易溶解的，而氮气是最不易溶解的。例如，在一种利用气相进行平衡的水中，当所述的气相中含有超过二氧化碳60倍(体积/体积)过量的氮气时，将含有大约相等摩尔浓度的溶解的氮气以及二氧化碳。因此，与利用空气进行平衡相比，如果利用氮气的气体环境进行平衡，存在于水中的所述的溶解气体所具有的总浓度将是减小的，继而，与利用富含二氧化碳的气体环境进行平衡相比，如果利用空气进行平衡，存在于水中的所述的溶解气体所具有的总浓度将是较小的 本领域技术人员将能够理解，为了降低溶解在一种液相之中的一种特定气体所具有的浓度，所述的液体必须被压缩在一个顶部空间(headspace)之下，在这种情况下，所述的特定气体所具有的分压强在本质上被减小了。用以降低所述的溶解气体所具有的总浓度的最为有效的方式是利用接近真空的气相对所述的液体进行平衡。
所述的溶解气体分子所具有的疏水性质导致了它们所具有的相对低的平衡浓度， 其中所述的溶解气体分子例如是氧。然而，所述的疏水性质与缺乏电荷以及具有非常小的尺寸共同使得这些辅料非常容易在所述的蛋白质分子所具有的疏水性核内进行移动。因此，与较大的并且带有电荷的辅料相比，与金属离子进行接触对于这类分子而言是相当容易的，其中所述的金属离子存在于一种蛋白质结构之中。由于它们所具有的疏水性质，所述的溶解气体分子已经表现出能够在所述的蛋白质所具有的疏水性核内发生聚集。因此，即使与溶解气体形成络合物的金属所具有的稳定性常数可能相对较低，它们在竞争方面以及对所述的配位键进行破坏的方面所起到的促成作用发生了相当大的增加，其中所述的配位键是存在于所述的蛋白质分子之中的，这归因于它们所具有的能够容易的分散至所述的蛋白质的疏水性核中的能力。因此，为了使所述的蛋白质结构的缺失达到最小程度，将存在于水性金属蛋白质制品中的某些溶解气体所具有的浓度最小化是很重要的。这是本发明所致力于的。
除此之外，所述的分散作用以及所述的溶解金属在所述的蛋白质的疏水性核中所具有的较高的溶解性同样能够破坏各种不同的疏水键，其中所述的疏水键存在于氨基酸的疏水性侧链之间，这些疏水键对于维持所述的天然三维结构而言是至关重要的。因此，即使是那些不需要依靠在它们的结构中进行恰当结合的金属离子的蛋白质也能够从溶解气体的除去中获得益处，其中所述的溶解气体是从它们的水性制品中被除去的。
在本发明中使用到的所述术语“蛋白质”涵盖了由单一的多肽所构成的分子或者分子络合物，包括两个或者更多个多肽的分子或者分子络合物，以及包括一个或者多个多肽以及一个或者多个非多肽半族的分子或者分子络合物，其中所述的非多肽半族是例如酶活动基，辅助因子等等。本发明可以适用于具有任意分子量的多肽。
所述的术语“多肽”意在涵盖这样的多肽，所述的多肽包括共价连接的非氨基酸半族例如糖基化的多肽，脂蛋白等等。
在某些方面，本发明涉及到金属蛋白质，S卩，具有特定的三维结构以及令人感兴趣的生物学活性的蛋白质分子，所述的金属蛋白质所具有的活性和/或结构取决于在所述的蛋白质之中的一个结合位点上的一种特定的金属离子的停留。所述的金属可以与所述的蛋白质所具有的氨基酸侧链进行直接的结合，或者所述的金属可以作为一个更为复杂的化学组成成分中的一部分，其中所述的化学组成成分在所述的蛋白质结构之中进行了结合。
在某些方面，本发明涉及到这样的蛋白质，所述的蛋白质一般而言不会被认为是金属蛋白酶，但是一种特定的金属离子在它们的结构上所进行的结合可能对所述的蛋白质所具有的三级结构和/或长期的稳定性产生影响。可以通过各种不同的来源提取到关于所述的金属离子的存在的信息，包括在所述的相互反应中涉及到的所述的金属-配体键的详细信息，其中所述的金属离子在所述的蛋白质结构中进行了结合，特别是那些具有商业利润的蛋白质，所述的来源是例如所述的蛋白质数据银行(http://pdbbeta. rcsb. orR/pdb/ home/home, do)。
本发明并不局限于蛋白质并且可以适用于很宽范围的生物学分子以及超分子系统，包括核酸，病毒样粒子以及病毒。在本发明中使用到的所述术语“超分子系统”涵盖了由离散的数量的聚集的分子亚单元或者组分所组成的任何系统。
在本发明中使用到的所述术语“配体”涵盖了能够与金属离子进行结合从而导致络合离子的形成的任何的化合物。为了本发明的这一目的，所述的配体被划分为“弱配体”， “中等强度的配体”以及“强配体”。所述的术语“弱配体”、“中等强度的配体”以及“强配体” 是依据它们与钙离子形成的络合物所具有的稳定性常数来定义的，其中钙离子是在所述的金属蛋白质所具有的结构中找到的最为普遍的金属离子中的一种，上述的定义如下一种弱配体所具有的与钙离子形成的络合物的稳定性常数log K小于0. 5 ；一种中等强度的配体所具有的与钙离子形成的络合物的稳定性常数log K存在于0. 5与2之间；一种强配体所具有的与钙离子形成的络合物的稳定性常数log K大于2。在这篇文件中所规定的稳定性常数指的是那些在25°C下测量得到的稳定性常数。
在本发明中使用到的所述术语“取代缓冲液”涵盖了存在于一种具有指定pH的组合物中的、能够进行质子交换的任何的添加剂，并且在对所述的组合物进行储存的指定的温度范围内，所述的添加剂所具有的PKa的数值比所述的组合物所具有的PH高或者低至少一个单位。将取代缓冲液应用在生物学制品中的技术在PCT/BG2007/000082中进行了描述。
在表格1中表示出了在蛋白质制品中可能的辅料的选集所具有的稳定性常数的例子。所述的表格中所列出的仅仅是有限数量的可能的辅料，并且本发明并不能够局限于这些化合物的使用。很宽范围的其他可能的辅料所具有的稳定性常数可以从所述的美国标准与技术研究院参考数据库46 (NIST Standard ReferenceDatabase 46)处获得。
表格1 选取的辅料所具有的稳定性常数。所有的稳定性常数指的是涉及到钙离子(Ca2+) 的稳定性常数
权利要求
1.一种水性组合物，其中包括一种生物学分子以及(i)包括一种或者多种金属离子，所述的金属离子的浓度为0. 01毫摩至20毫摩； ( )包括辅料，其中所述的辅料是弱配体；以及(iii)本质上不含有这样的辅料，其中所述的辅料是中等强度的配体或者是强配体。
2.根据权利要求1中所述的组合物，其中包括一种强配体，所述的强配体所具有的浓度不高于所述的一种或者多种金属离子所具有的总浓度，其中所述的强配体在本质上是不能够以游离的形式被利用的。
3.—种水性组合物，其中包括一种生物学分子以及 (i)包括辅料，其中所述的辅料是弱配体；以及( )本质上不含有这样的辅料，其中所述的辅料是中等强度的配体或者是强配体。
4.根据权利要求3中所述的组合物，其中包括一种强配体，所述的强配体是以一种低的浓度存在的，从而确保能够从所述的制品中除去金属离子，同时保证在所述的组合物中本质上不含有所述的游离形式的强配体。
5.根据权利要求2或4中所述的组合物，其中所述的强配体所具有的浓度为小于1毫摩。
6.根据权利要求5中所述的组合物，其中所述的强配体所具有的浓度为小于0.1毫摩。
7.根据权利要求2、4、5以及6任意一项中所述的组合物，其中所述的强配体是乙二胺四乙酸。
8.根据前述任意一项权利要求中所述的组合物，其中所述的生物学分子是一种蛋白质。
9.根据权利要求1至7中所述的组合物，其中所述的生物学分子是一种核酸。
10.根据前述任意一项权利要求中所述的组合物，其中所述的生物学分子是一种完整病毒。
11.根据权利要求8中所述的组合物，其中所述的蛋白质是一种金属蛋白质。
12.—种水性组合物，其中包括一种蛋白质以及一种缓冲系统，其中所述的缓冲系统是以TRIS或者苯甲酸离子或者水杨酸离子或者是它们的任意的组合为基础的。
13.根据前述任意一项权利要求中所述的组合物，其中进一步的包括一种或者多种金属离子，所述的金属离子是以0. 01毫摩至20毫摩的浓度范围存在的。
14.根据权利要求1、2以及13任意一项中所述的组合物，其中所述的一种或者多种金属离子所具有的浓度是0. 05毫摩至10毫摩。
15.根据权利要求14中所述的组含物，其中所述的一种或者多种金属离子所具有的浓度是0.2毫摩至5毫摩。
16.根据前述任意一项权利要求中所述的组合物，其中进一步的包括一种多元醇或者一种糖。
17.根据权利要求16中所述的组合物，其中包括至少0.5%(重量/重量)的所述的多元醇。
18.根据前述任意一项权利要求中所述的组合物，其中另外还包括一种防腐剂。
19.根据前述任意一项权利要求中所述的组合物，其中另外还包括一种蛋白酶抑制剂。
20.根据前述任意一项权利要求中所述的组合物，其中另外还包括一种表面活性剂。
21.一种水性组合物，所述的组合物具有大约为8的pH，其中包括重组的炭疽保护性抗原以及下述添加剂中的任意一种(i) 一种缓冲系统，其中包括TRIS或者赖氨酸或者是它们的任意组合；( ) 一种钙离子的来源，其中所述的钙离子的来源所具有的浓度为1毫摩至20毫摩。
22.—种水性组合物，所述的组合物具有大约为6. 8的pH，其中包括过氧化氢酶以及下述添加剂中的任意一种(i) 一种缓冲系统，其中包括TRIS或者苯甲酸离子或者水杨酸离子或者是它们的任意组合；( ) 一种钙离子的来源，其中所述的钙离子的来源所具有的浓度为1毫摩至20毫摩；(iii)氯化钠，其所具有的浓度为50毫摩至500毫摩。
23.—种水性组合物，所述的组合物具有大约为7的pH，其中包括辣根过氧化物酶以及下述添加剂中的任意一种(i) 一种缓冲系统，其中包括TRIS或者苯甲酸离子或者水杨酸离子或者是它们的任意组合；( ) 一种钙离子的来源，其中所述的钙离子的来源所具有的浓度为1毫摩至20毫摩；(iii)氯化钠，其所具有的浓度为50毫摩至1摩。
24.—种水性组合物，所述的组合物具有大约为6. 5的pH，其中包括凝血因子VIII以及下述添加剂中的任意一种(i) 一种缓冲系统，其中包括TRIS或者苯甲酸离子或者水杨酸离子或者是它们的任意组合；( ) 一种钙离子的来源，其中所述的钙离子的来源所具有的浓度为1毫摩至20毫摩；(iii)氯化钠，其所具有的浓度为50毫摩至1摩；(iv)聚山梨醇酯80。
25.根据前述任意一项权利要求中所述的组合物，用于治疗或者诊断的用途。
26.一种密闭的容器，所述的容器中含有根据前述任意一项权利要求中所述的组合物。
27.根据权利要求26中所述的容器，其中包括一个顶部空间，用以确保从所述的组合物中部分的去除或者本质上去除溶解气体。
28.根据权利要求27中所述的容器，其中在所述的顶部空间中含有氮气或者一种稀有气体，其中所述的稀有气体例如是氩气。
全文摘要
一种水性组合物，在所述的组合物中包括蛋白质或者其他的生物学分子，并且同样的(i)任选的包括一个或者多个金属离子，其中所述的金属离子是以0.01至20毫摩的浓度存在的；(ii)包括辅料，其中所述的辅料是弱的配体；以及(iii)在本质上不含有某些辅料，其中所述的辅料是中等强度的配体或者是强的配体。
文档编号C12N9/96GK102186975SQ200980120026
公开日2011年9月14日 申请日期2009年5月1日 优先权日2008年5月1日
发明者J·杰泽克 申请人:艾瑞克有限公司