专利名称：检测vegf激酶结构域调节剂的方法
背景技术：
1.发明领域本发明涉及检测化合物药理学活性的测定，特别检测是血管内皮生长因子受体(VEGF-R2)激酶结构域调节剂的测定。
2.背景血管形成在包括血管发生、伤口愈合以及维护女性生殖系统的各种过程中起作用。病理性血管形成与疾病状态如癌症、糖尿病性视网膜病、风湿性关节炎、子宫内膜异位和牛皮癣有关。血管内皮生长因子(VEGF)既是正常血管形成又是病理血管形成的介质。VEGF通过它们的同源受体(属于酪氨酸激酶受体(RTK)家族的跨膜受体)传送信号到细胞内。这些受体分成三部分，包括位于细胞外的配基结合区，跨膜区(使受体锚定在细胞膜上)，以及位于细胞内的酪氨酸激酶区。酪氨酸激酶受体的一个亚家族包含结合VEGF的受体Flt1/VEGF-R1和KDR/Flk1/VEGF-R2。VEGF配基与受体结合刺激该受体酪氨酸激酶活性，使生物信号转导到细胞中。KDR/Flk1/VEGF-R2受体介导有丝分裂生物学活性和内皮细胞增殖，而Flt1/VEGF-R1受体介导内皮细胞黏附等功能。已证明抑制KDR/Flk1/VEGF-R2的信号转导可抑制血管形成过程。该受体的抑制剂可用于治疗存在血管形成失去控制的疾病。
美国专利5,283,354中描述了小鼠VEGF-R2序列。美国专利5,861,301中描述了人VEGF-R2序列，然而，在此专利中公开的序列含有几个不同于正确序列之处，包括一个在激酶结构域内的失活点突变(致使该蛋白质无功能)。不同的国际专利申请PCT WO 98/58053描述了功能性的人VEGF-R2序列。大鼠的VEGF受体激酶结构域与人的相应序列类似，1997年3月13日提交到公共域(Genbankaccession numbers U93306和U93307)，随后在J.Biol.Chem.2732090-97(1998)中描述。大鼠的细胞内激酶结构域与人的序列在酪氨酸激酶区的N-末端和C-末端97％相同，在中间的激酶插入结构域(KID)有89％相同。还没有关于大鼠VEGF-R2激酶结构域的可溶形式或将这样的蛋白质用于测试待检化合物激酶抑制活性的方法的描述。
使用闪烁接近技术，已研制出用于多种分子目标的同类测定(Cook，N.D.(1996).Drug Discovery Today 1287-294；Picardo.M.和Hughes，K.T.(1997).In High Throughput Screening [Devlin，J.P.(Ed)]，Dekker，New York，NY，pp.307-316)。简单地说，将感兴趣目标或包被或结合于含有荧光物质的固体支持物上固定。一个放射性分子通过结合固定化目标接近固相，使得荧光物质受激并发射可见光。可见光发射构成配体/目标成功相互作用的检测基础，并通过一个合适的监控装置测定。1986年2月4日授于的美国专利号4,568,649公开了闪烁接近测定的一个实例。美国专利5,770,176描述了用于核受体的测定，其中功能性受体结合固定化核酸。这些类型测定的材料可从DuPont NEN(Boston，Massachusetts)购买获得，商品名为FlashPlateTM。检测激酶功能的闪烁接近测定用于纯化src酪氨酸激酶与肽底物的进展已有描述(Naykayama，G.R.等，J.BiomolecularScreening(1998)343-48；McDonald，O.B.等，(1999).Anal.Biochem.268318-329.)据我们所知，没有描述可溶性VEGF酪氨酸激酶功能的闪烁接近技术或用类似技术测试抑制化合物的报道。
因此本发明提供一种用于检测调节VEGF激酶酶活性的化合物方法和测定，其包括以下步骤A)提供含有受试化合物、大鼠VEGF-R2激酶融合蛋白和含有亲和性部分及大鼠VEGF-R2磷酸化位点的激酶底物的溶液，该溶液适合大鼠VEGF-R2催化活性并含有作为磷酸根源的33P-γ-ATP；B)使所述化合物、激酶融合蛋白和激酶底物接触足够时间以便产生33P磷酸化底物；C)在多孔检测板中通过亲和捕获分离磷酸化激酶底物；D)首先吸出水溶液，然后用第二种溶液洗涤多孔板，从而除去残存的33P-γ-ATP；E)通过监测在存在所述化合物的情况下，激酶对底物的33P转移率或绝对量来检测激酶活性变化。
本文使用的术语“蛋白质超家族”指其进化关系可能没有完全确立或不完全符合公认的系统发育标准，但是具有相似的三维结构或独特的共有重要氨基酸。本文使用的术语“蛋白质家族”指按照推定系统发育标准建立了进化关系的蛋白质。
本文使用的术语“融合蛋白”指一种新型的嵌合蛋白构建物，它是为了将通常两个或多个不同多肽具有的单一多肽链功能和识别特性组合在一起，而将不同蛋白质的两个或多个结构域或连接区段结合一起的结果。最常见的是，克隆编码目的蛋白结构域的核苷酸序列，形成编码目的蛋白的新核苷酸序列，从而获得邻接分子达到上述目的。换句话说，融合蛋白的形成可通过用化学方法将两个蛋白质连接在一起来完成。
本文使用的术语“连接区段”或“连接结构域”或类似于这种描述的术语指用于构建克隆载体或融合蛋白的多核苷酸或多肽节段。连接区段的功能可包括将克隆位点导入核苷酸序列，在两个蛋白结构域之间导入柔性组件或产间隔区(space-creating region)，或对特定分子相互作用产生一个亲和标记。导入融合蛋白的连接区段可以没有特定目的，只是作为在克隆期间所作选择结果的折衷。
本文使用的术语“克隆位点”或“多克隆位点”指克隆载体内包含的核苷酸序列区或工程操作在融合蛋白内的核苷酸序列区，该区域具有一个或多个有效限制性内切核酸酶识别序列。适当操作限制性内切核酸酶位点可以串连克隆两个或多个核苷酸序列，以便使相应的编码蛋白质结构域按特定起始密码子的读框翻译，这样在转录和翻译后生产出目的蛋白质产物。之后可将这些核苷酸序列导入至其它克隆载体中，用于产生新的融合蛋白，或用于导入特异性定点突变。本领域技术人员众所周知，可以在目的位点通过沉默突变、保守突变或导入含有目的限制性内切酶共有序列的连接区对克隆位点进行工程操作。本领域技术人员还知道，只要保持所要克隆的蛋白或其片段的需要功能，克隆位点的准确位置可不同。
本文使用的术语“表达载体”定义为在合适的宿主中转录克隆拷贝基因并翻译它们的信使RNA需要的核酸序列。这样的载体可用于在各种各样的宿主中表达原核生物或真核生物的基因，包括大肠杆菌、蓝绿海藻、植物细胞、昆虫细胞、真菌细胞(包括酵母细胞)、以及动物细胞中。
关于VEGF-R激酶活性怀疑调节剂的本文使用的术语“受试化合物”是指具有破坏该激酶特定酶活性潜力的有机分子。例如(并不限制本发明范围)化合物可以包括有机小分子、合成或天然氨基酸肽、蛋白质、或合成或天然核酸序列、或上述化合物的任何化学衍生物。激动剂化合物增加磷酸根转移到激酶底物的速率或总量。拮抗剂化合物降低磷酸根转移到激酶底物的速率或总量。
术语“化学衍生物”指含有附加化学部分而该部分不是正常基础分子的一部分的分子。这样的附加化学部分可以提高基础分子的溶解性、半衰期、吸收性等。或者该部分可以降低基础分子不良副作用或降低基础分子的毒性。这样部分的实例描述于各种文献中，例如Remington’s Pharmaceutical Sciences.
本发明提供检测包含大鼠VEGF激酶结构域的融合蛋白磷酸化的方法以及检测VEGF激酶调节剂活性的测定。特别是，用于本发明方法中的融合蛋白包含大鼠VEGF-R2跨膜结构域的羧基末端氨基酸和任选包含亲和标记，例如多聚组氨酸标记。一种特别优选的融合蛋白的多聚组氨酸标记位于N-末端并且大鼠VEGF-R2激酶结构域包含大鼠VEGF-R2蛋白的786-1343氨基酸。
因此本发明提供检测调节VEGF激酶酶活性的化合物的方法和测定，其包括下列步骤A)在适合大鼠VEGF-R2催化活性而且含有作为磷酸根源的33P-γ-ATP的溶液中提供受试化合物、大鼠VEGF-R2激酶融合蛋白以及包含亲和部分和大鼠VEGF-R2磷酸化位点的激酶底物的溶液；B)使受试化合物、激酶融合蛋白和激酶底物接触足够的时间以产生33P磷酸化底物；C)在多孔检测板中通过亲和捕获分离磷酸化激酶底物；D)首先吸出水溶液然，然后用第二种溶液洗涤多孔板除去残存的33P-γ-ATP；E)监测在存在受试化合物的情况下激酶使33P转移到底物的比率或绝对量，从而检测激酶活性变化。
通过使本发明融合蛋白和推定底物在合适的缓冲液中温育足够时间，以使大鼠VEGF-R2酶活性使底物磷酸化，从而测定在本发明方法中使用的大鼠VEGF-R2底物。例如通过SDS-PAGE、质谱分析、高效液相色谱或本文描述的测定分离底物，分析确定转移到底物酪氨酸残基上的磷酸根。优选底物是大鼠VEGF-R2的VEGF-R2激酶结构域(经自体磷酸化)的多肽片段、磷脂酶Cγ的多肽片段或多聚谷氨酸/酪氨酸(谷氨酸∶酪氨酸 4∶1)。
本文介绍的测定如下检测酶活性(和对酶活性的调节作用)固定底物肽，例如利用亲和部分-亲和捕获对，例如链霉抗生物素蛋白捕获生物素化底物肽。亲和捕获对在本领域众所周知，包括例如抗生物素蛋白/生物素、底物肽或较大的多肽包含的抗体表位、大肠杆菌malE基因的葡聚糖/麦芽糖结合结构域、谷胱甘肽S-转移酶(GST)以及聚组氨酸/固定化镍。聚组氨酸指含有3-10个连续组氨酸残基的多肽，特别是6个连续组氨酸残基的多肽。
本发明独特亲和捕获测定称为“自体磷酸化测定”和“多肽磷酸化测定”。在自体磷酸化测定中，使包含大鼠VEGF-R2激酶催化结构域和至少一个亲和捕获结构域的融合蛋白在适合于它的酶活性并含有放射性同位素标记ATP的缓冲液中温育。激酶蛋白自体磷酸化(通过一个激酶分子和一个相似的分子相互作用)导致放射性标记磷酸基团转移到融合蛋白。然后融合蛋白通过匹配的亲和捕获对结合到闪烁接近载体表面。通过闪烁接近载体发射的可见光测定磷酸化。在多肽磷酸化测定中，将含有磷酸化结构域和至少一个亲和捕获结构域的大鼠VEGF-R2底物肽或多肽在适合于匹配激酶酶活性并有放射性标记ATP存在的缓冲液中温育。匹配激酶蛋白加到混合物，使底物磷酸化，导致放射性磷酸基团转移到底物上。然后磷酸化底物通过匹配亲和捕获对结合到闪烁接近载体表面。为了避免检测到自体磷酸化，大鼠VEGF-R2激酶蛋白不能包含亲和捕获对结构域。通过闪烁接近载体发射的可见光测定磷酸化。在这两种情况下，亲和结构域可以是现存的多肽或是独特的结构域或是作为融合蛋白组分部分引入的小肽。
检测对底物肽的酶活性的优选方法通过水解33P-γ-ATP使33P转移到底物上。该方法包括以下顺序步骤1)提供适合大鼠VEGF-R2催化活性而且含有作为磷酸根源的33P-γ-ATP的以下组分溶液受试化合物、大鼠VEGF-R2激酶融合蛋白以及包含亲和部分和大鼠VEGF-R2磷酸化位点的激酶底物肽；2)使受试化合物、激酶融合蛋白和激酶底物接触足够时间以产生33P磷酸化底物；3)在多孔检测板中通过亲和捕获分离磷酸化激酶底物；4)首先吸出水溶液，然后用第二种溶液洗涤多孔板除去残存的33P-γ-ATP；5)监测在存在所述受试化合物下激酶使33P转移到底物的比率或绝对量，从而检测激酶活性变化。
检测推定VEGF-R2调节化合物对大鼠VEGF-R2激酶活性的作用的优选自体磷酸化方法包括以下顺序步骤A)提供适合大鼠VEGF-R2催化活性而且含有作为磷酸根源的33P-γ-ATP的以下组分溶液受试化合物、包含N-末端6组氨酸和与其连接的大鼠VEGF-R2蛋白786-1343氨基酸的大鼠VEGF-R2激酶融合蛋白；B)使受试化合物和激酶融合蛋白接触足够时间以产生33P磷酸化底物；C)使用NTA-镍包被的多孔检测板通过亲和捕获分离磷酸化激酶融合蛋白；D)首先吸出水溶液，然后用含有约1mM-100Mm浓度二价阳离子螯合剂的磷酸缓冲盐溶液洗涤板，从而除去残存的33P-γ-ATP；E)监测在存在所述受试化合物下激酶融合蛋白自体磷酸化的33P转移比率或绝对量，从而检测激酶活性变化。
产物量变化可以是随时间变化的(测定终止时间)的总量，或者通过检测随时间变化的酶促反应速率变化而可是动力学性的。动力学测定是从酶和底物开始接触的时间到产生50％最大量观察产物的时间。
用不抑制酶功能的化合物或用具有用于所述受试化合物溶剂的类似性质但没有任何受试化合物的溶剂溶媒，例如DMSO、DMF或异丙醇，同时或分别进行所述检测，从而可测定预期的大鼠VEGF-R2酶作用程度。
用于洗板的溶液没有严格的限制，包括含有或不含去污剂的生理缓冲溶液。这些溶液是本领域众所周知的。尤其优选的溶液包含二价阳离子螯合剂，浓度大约1mM-100mM的EDTA或EGTA最好。螯合剂用来进一步抑制激酶催化活性，并通过增加信噪比来增强测定性能。
下列实施例是说明本发明，而非限制本发明。
实施例1通过PCR从大鼠肝脏cDNA克隆大鼠VEGF受体酪氨酸激酶结构域。设计正向引物(5-ATCCTAGGTACCGTTATGCGGGCCAATGSEQ.ID.NO.1)对应于人VEGF-R2序列，但是导入一个便于亚克隆的KpnI位点和一个对应于大鼠蛋白质的786位氨基酸的人工起始密码子。反向引物(5-TGTGGCGGCCGCCGGGTGGTGGAAAGSEQ.ID.NO.2)对应于小鼠VEGF-R2序列，在大鼠基因的终止密码子后引入一个NotI位点便于亚克隆。将这个核酸片段克隆到pcDNA3.1(+)表达载体(InVitrogen Co.，Carlsbad，CA)。在COS细胞中表达该克隆并发现该克隆在自体磷酸化研究中是有功能的。已知的VEGF受体磷酸化抑制剂测定证明该化合物抑制的大鼠VEGF受体克隆，因而说明大鼠VEGF受体激酶结构域与相似的VEGF-R激酶结构域类似的方式起作用。(
图1)。
制备如下组成的融合蛋白大鼠VEGF-R2的细胞内结构域和加在N-末端的聚组氨酸标记，亚克隆上述KpnI+NotI片段到pFastBac表达载体(Gibco/BRL，Grand Island，NY)中，其符合后接6个组氨酸残基的人工起始密码子的读框。大鼠VEGF-R2可溶性重组激酶结构域融合蛋白在Hi5昆虫细胞中表达，使用杆状病毒表达载体pFastBac(Gibco/BRL)，基本按厂商(Cat.#69670和Cat.#69755-3，Novagen，Madison，WI)介绍用金属螯合物亲和层析法纯化至纯度大于85％(图2)。
实施例2筛选测定用可溶性大鼠VEGF受体酪氨酸激酶结构域磷酸化生物素化肽底物研制出筛选方法，以鉴定抑制VEGF受体活性的化合物。PLC-1肽底物由磷脂酶-Cγ的462-475氨基酸片段组成[(生物素)KHKKLAEGSAYEEV-酰胺SEQ.ID.NO.3]，它是已知的体内VEGF-R2底物，或者为0.6微克随机生物素化的人工底物聚谷氨酸∶酪氨酸(4∶1)(Cat.#P-0275，Sigma，St.Louis，MO)。
制备激酶反应混合物，该混合物包含50mM Tris-HCl pH＝8，10mM MgCl2，0.1mM Na3PO4，1mM DTT，10μM ATP，0.25μM生物素化PLC-1肽底物和每孔0.8微居里的33P-γ-ATP[2000-3000Ci/mmol]。将70μl的激酶反应混合物分配到链霉抗生物素蛋白包被的FlashPlateTM(Cat.#SMP-103，NEN，Boston，MA)孔中。然后将1μl受试化合物的100％DMSO母液加入这些孔，反应物中DMSO的终浓度为1％(100μl的终反应体积包括后来的酶溶液)。之后用50mM Tris-HClpH＝8.0，0.1％BSA将可溶性的大鼠VEGF受体酪氨酸激酶稀释成每微升5ng浓度，并向每孔中加入30μl(每测定孔150ng)开始反应。将该反应物置于30℃温育1小时。在1小时温育结束时， 通过从板中吸出反应混合物来终止反应并用含有100mM EDTA的PBS洗孔两次。生物素化的底物仍然固定在FlashplateTM上，掺入的33P-γ-ATP通过在闪烁计数器上读板进行测定。通过观测掺入固定化底物中的33P-γ-ATP数量减少测定对VEGF-R2活性的抑制作用。如图4所示，掺入固定化底物中的33P-γ-ATP与一种已知抑制剂最大抑制作用相比，具有显著性差异(大约5倍差异)。因此该测定可用作高通量筛选测定，优选5-10倍信噪比(S/N)，因为这样是经济的(在试剂使用方面)、稳健的(在阳性和阴性结果之间界限清楚)、敏感的(检测在有效浓度范围抑制激酶活性的化合物)。信噪比定义为(酶活性/过量抑制剂存在下的酶活性)。
为进一步评价这个测定的稳健性，基本如上所述重复所述条件来求激酶活性与时间的线性度。如图5所示，至少3.5个小时测定是线性的。因此当进行高通量筛选时该测定具有有效灵活性和检测性能可靠性。
该测定用于测定抑制VEGF-R2激酶活性的化合物的IC50，例如抑制剂-A(C13H10N2O，Cat.#CD00870，Maybridge Chemicals，Cornwall，UK)(图3)。以8个浓度双份检测受试化合物[100μM，10μM，1μM，100nM，10nM，1nM，100pM，10pM]。在各板上测定所述检测的最大信号和最小信号。用抑制百分比对受试化合物浓度对数作图，按照公式[最大信号-背景信号/受试化合物信号-背景信号(100)＝％抑制]，根据所述测定最大信号抑制百分比的剂量反应曲线计算IC50(抑制最大信号50％的化合物浓度)。
如图3所示，抑制剂A(针对PLC1底物和聚谷氨酸/酪氨酸(谷氨酸/酪氨酸4∶1)底物进行检测)成功地抑制了大鼠VEGF-R2激酶活性。
实施例3自体磷酸化筛选测定筛选测定制备激酶反应混合物，其包含50mM Tris-HC1 pH＝8，10mMMgCl2，0.1mM Na3PO4，1mM DTT，10μM ATP和每孔0.8μ居里33P-γ-ATP[2000-3000 Ci/mmol]。将70μl的激酶反应混合物分配到NTA-镍包被的FlashPlateTM(Cat.#SMP107，NEN，Boston，MA)的孔中。然后将1μl受试化合物的100％DMSO母液加入孔中，反应物中的DMSO终浓度为1％(100μl的终反应体积包括后来的酶溶液)。之后用50mM Tris-HCl pH＝8.0，0.1％BSA将含有N-末端6XHIS标记的可溶性大鼠酪氨酸激酶稀释成每微升5ng浓度，并向每孔中加入30μl(每测定孔150ng)开始反应。将该反应置于30℃温育1小时。在1小时温育结束时，通过从板中吸出反应混合物并用含有100mMEDTA的PBS洗孔两次，从而终止反应。6XHIS-VEGF受体固定在FlashplateTM上，自体磷酸化掺入的33P-γ-ATP通过在闪烁计数器上读板进行测定。通过观测掺入固定化酶中的33P-γ-ATP数量减少测定对VEGF-R2酶活性的抑制作用。该测定结果示于图4和图5。
序列表序列表<110>Emanuel.StuartJohnson，Dana.<120>检测VEGF激酶结构域调节剂的方法<130>ORT-1260<140><141><160>3<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>1atcctaggta ccgttatgcg ggccaatg 28<210>2<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>2tgtggcggcc gccgggtggt ggaaag 26<210>3<211>14<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成肽底物<400>3Lys His Lys Lys Leu Ala Glu Gly Ser Ala Tyr Glu Glu Val1 5 10
权利要求
1.一种测定推定VEGF-R2调节化合物作用的方法，该方法包括下列顺序步骤A)提供适合大鼠VEGF-R2催化活性而且含有作为磷酸根源的33P-γ-ATP的以下组分溶液受试化合物、大鼠VEGF-R2激酶融合蛋白以及包含亲合部分和大鼠VEGF-R2磷酸化位点的激酶底物；B)使所述受试化合物、激酶融合蛋白和激酶底物接触足够时间，以便产生33P磷酸化底物；C)在多孔检测板中通过亲和捕获分离磷酸化激酶底物；D)首先吸出水溶液，然后用第二种溶液洗涤板，从而除去残存的33P-γ-ATP；E)监测在存在所述受试化合物下所述激酶使33P转移到底物中的比率或绝对量，从而检测激酶活性变化。
2.权利要求1的方法，其中所述底物选自大鼠VEGF-R2激酶蛋白质、大鼠VEGF-R2的多肽片段、磷脂酶Cγ的多肽片段或多聚谷氨酸/酪氨酸(Glu∶Tyr 4∶1)。
3.权利要求2的方法，其中所述底物还包含选自以下的亲和部分生物素、所述底物包含的抗体表位、大肠杆菌malE基因的葡聚糖/麦芽糖结合结构域、谷胱甘肽S-转移酶(GST)以及聚组氨酸。
4.权利要求1的方法，其中所述大鼠VEGF-R2激酶融合蛋白包含大鼠VEGF-R2蛋白质的786-1343氨基酸。
5.权利要求1的方法，其中所述激酶活性变化产生5-10倍范围的信噪比。
6.一种检测推定VEGF-R2调节化合物作用的方法，该方法包括下列顺序步骤A)提供适合大鼠VEGF-R2催化活性而且含有作为磷酸根源的33P-γ-ATP的以下组分溶液受试化合物、包含N-末端6组氨酸和与其连接的大鼠VEGF-R2蛋白786-1343氨基酸的大鼠VEGF-R2激酶融合蛋白；B)使所述受试化合物和激酶融合蛋白接触足够时间，以便产生33P磷酸化底物；C)使用NTA-镍包被的多孔检测板通过亲和捕获分离所述磷酸化激酶融合蛋白；D)首先吸出水溶液，然后用含有约1mM-100Mm浓度二价阳离子螯合剂的磷酸缓冲盐溶液洗涤板，从而除去残存的33P-γ-ATP；E)监测在存在所述受试化合物下所述激酶融合蛋白自体磷酸化的33P转移比率或绝对量，从而检测激酶活性变化。
7.一种检测推定VEGF-R2调节化合物作用的方法，该方法包括下列顺序步骤A)提供适合大鼠VEGF-R2催化活性而且含有作为磷酸根源的33P-γ-ATP的以下组分溶液受试化合物、包含大鼠VEGF-R2蛋白786-1343氨基酸的大鼠VEGF-R2激酶融合蛋白和生物素化大鼠VEGF-R2底物；B)使所述受试化合物、激酶融合蛋白和底物接触足够时间，以便产生33P磷酸化底物；C)使用抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白包被的多孔检测板通过亲和捕获分离所述磷酸化底物；D)首先吸出水溶液，然后用含有约1mM-100Mm浓度二价阳离子螯合剂的磷酸缓冲盐溶液洗涤板，从而除去残存的33P-γ-ATP；E)监测在存在所述受试化合物下33P转移到底物的比率或绝对量，从而检测激酶活性变化。
全文摘要
本发明涉及检测化合物药理活性的测定，尤其是用于检测大鼠血管内皮生长因子受体(大鼠VEGF－R2)激酶结构域调节剂的测定。
文档编号C12N15/09GK1457366SQ01813814
公开日2003年11月19日 申请日期2001年6月6日 优先权日2000年6月7日
发明者D·L·约翰逊, S·L·埃马尼尔 申请人:奥索-麦克尼尔药品公司