含有血凝素活性膜蛋白的假型逆转录病毒载体的制作方法

专利名称：含有血凝素活性膜蛋白的假型逆转录病毒载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有副粘病毒属HN蛋白的假型病毒载体。
背景技术：
使用逆转录病毒载体可在靶细胞中表达外源基因以用于研究，基因治疗等。可以用相对简单的方法制备逆转录病毒载体，所述载体也具有一些优点，例如能将外源基因导入宿主染色体。一般说来，位于病毒包膜的病毒蛋白质在逆转录病毒载体感染中起着至关重要的作用。研究人员致力于拓宽载体可感染的宿主细胞范围，或通过修饰逆转录病毒载体的包膜蛋白来开发仅感染特定细胞的病毒载体。
例如，已开发出将VSV-G蛋白整合至逆转录病毒载体包膜的系统，该系统能确保对较宽范围宿主细胞的感染性(H.Yu等，1999，Gene Therapy，6，1876-1883)。VSV-G是水泡性口炎病毒包膜表面上表达的蛋白质，它对相当宽的宿主细胞范围有感染性。此外，例如，通过实验已将仙台病毒F蛋白用作包膜蛋白。发现F蛋白-假型逆转录病毒表现出对脱唾液酸糖蛋白受体-阳性细胞的特异性感染性(M.Spiegel等，1998，Hepatology，28，1429-1429；M.Spiegel等，1998，J.Virology，72，5296-5302)。
然而，这些常规的假型逆转录病毒对多种组织和细胞仅有不充足的感染性。例如，包括造血干细胞在内的多种干细胞在基因治疗或类似治疗中可以是重要的靶细胞(Y.Hanazono，Molecular Medicine，Vol.36，No.7，1999)，但大多数干细胞处于不分裂的状态(Abkowitz，J.L等，Nat Med，2(2)，190-7，1996)。一般说来，使用对这种不分裂的细胞表现出低感染性的逆转录病毒载体难以导入基因。另外，使用常规技术的载体系统不能将基因导入胞外基质-丰富的细胞，例如肺气道粘膜上皮细胞。将基因导入这些类型的细胞的方法需要通过物理清洗除去胞外基质，例如粘液。然而，该方法过于复杂，而且会损害组织。

发明内容
本发明的目的是提供含有膜蛋白的假型逆转录病毒载体，所述膜蛋白具有血凝素活性。
本发明人选择具有血凝素活性的蛋白质作为假型逆转录病毒的蛋白质。血凝素(HAin)是导致血凝(HA；红细胞凝集)的蛋白质，已知多种病毒具有此活性。本发明人认为可以在具有包膜的逆转录病毒的基础上，构建能够对多种类型的细胞和组织进行高效基因转移的逆转录病毒载体，其中所述包膜含有具有血凝素活性的膜蛋白。为了构建所述逆转录病毒，本发明人使用了具有宽宿主范围的副粘病毒的包膜蛋白。首先，基于表达仙台病毒(SeV)包膜蛋白的载体，通过SeV F和/或HN蛋白使衍生自小鼠逆转录病毒的病毒载体假型化。具体地说，使用鼠干细胞病毒(MSCV)作为起始物构建逆转录病毒，它除了具有亲嗜性包膜蛋白或兼嗜性包膜蛋白外，还具有SeVF和/或HN蛋白；检测所得载体对人细胞的基因转移效力(实施例1和2)。
当使用对人细胞无感染性的亲嗜性包膜蛋白进行包装时，使用仅被F蛋白或HN蛋白假型化的病毒无法对人细胞进行基因转移。然而，原本对人细胞无感染性的病毒通过共表达F蛋白和HN蛋白而被假型化之后，能将基因导入人细胞(

图1中的Eco)。这一结果表明通过使用仙台病毒的F蛋白和HN蛋白使衍生自非仙台病毒之病毒的载体假型化，可以拓宽病毒载体感染的宿主范围。
已发现当使用对人细胞具有感染性的兼嗜性包膜蛋白进行包装时，通过仅表达HN蛋白或通过共表达F蛋白和HN蛋白使病毒假型化，能显著改善基因转移的效率(图1中的Ampho)。结果表明仅用仙台病毒HN蛋白即可使逆转录病毒载体假型化，通过仅使用仙台病毒HN蛋白进行假型化，或通过使用仙台病毒F蛋白和HN蛋白进行假型化，可以改善逆转录病毒载体的基因转移效率。
本发明人还通过用HN蛋白假型化制备出兼嗜性逆转录病毒载体，并测定了所述载体对包括造血干细胞在内的人骨髓细胞的基因转移效率(实施例3)。使用被HN蛋白假型化的载体感染CD34+人骨髓细胞，使用CD34作为标记，通过流式细胞术分级分离含有导入基因的细胞。结果表明使用HN蛋白假型化能显著改善对CD34+和CD34-细胞的基因转移效率(图3)。据信CD34+细胞级分含有造血干细胞。因此，基于HN蛋白的假型化也可用于对包括造血干细胞在内的血细胞和造血细胞进行基因转移。
然后，本发明人使用与多种其它类型的逆转录病毒相比，有望更适于用作基因治疗载体的慢病毒，构建出被副粘病毒F蛋白和/或HN蛋白假型化的载体。所用慢病毒是猴免疫缺陷病毒(SIV)(实施例5)，与基因治疗常用的人免疫缺陷病毒(HIV)相比，该病毒能提供多个优点，包括较高水平的安全性。通过制备含有由SeV或灭活的仙台病毒重建的包膜的病毒体，并使它们与被VSV-G蛋白假型化的SIV融合，产生含有仙台病毒(SeV)包膜蛋白的SIV病毒颗粒。将病毒颗粒与人细胞保温以评估载体感染的效率(实施例6和7)。结果表明与被VSV-G蛋白假型化的SIV相比，含有与SeV包膜融合所得之包膜的SIV表现出较高的感染性(图8)。感染性的增加可归功于仙台病毒HN蛋白。
为了精确评价SeV包膜蛋白的贡献，本发明人制备了FHN病毒体，F病毒体和HN病毒体，并通过使VSV-G-假型SIV与各种病毒体融合来制备载体。然后，根据感染实验评估所得载体(实施例7)。与单独的SIV相比，与FHN病毒体融合的载体显示出显著较高的基因转移效率(图10)。在与HN病毒体有关的实验中，基因转移的效率也得到改善。然而，与FHN病毒体不同的是，F病毒体融合未导致基因表达水平的任何增加。因此，可以证明HN蛋白对于增加基因转移的效率是至关重要的。
此外，本发明人使用SeV包膜蛋白表达载体制备出慢病毒载体，该慢病毒载体在包装阶段被SeV包膜蛋白假型化(实施例8)。以较高滴度产生除VSV-G蛋白外还被F蛋白和HN蛋白假型化的SIV载体。通过离心可进一步富集该病毒载体。本发明人在体内基因转移试验中检测了该载体。
由于常规的病毒载体几乎不能将基因转移至气管上皮的粘膜细胞，为了实现基因转移，必需进行预处理以除去物理屏障；例如，如果不用二氧化硫等损害细胞，用VSV-G-假型化HIV载体进行基因转移就无法获得足够的高效力(L.G.Johnson等，Gene Therapy，7，568-574，2000)。本发明人检测了被VSV-G蛋白和仙台病毒F和HN蛋白假型化的SIV载体是否能使基因有效转移至气管上皮的粘膜细胞，而不会遭受上述损害(实施例9)。将上述用于表达GFP的假型化SIV载体施于小鼠鼻内，给药3天后观察气管组织切片上的GFP蛋白表达情况；在气管上皮细胞中检测到GFP荧光(图11)。此外，在相同个体的鼻中隔粘膜的粘膜上皮和假复层纤毛上皮中也可检测到GFP表达所致的荧光信号(图12)。由此可证实本发明的病毒载体能将基因导入具有粘液的细胞，例如粘膜上皮细胞，而不会损害细胞或组织。
另外，本发明人构建了经修饰的HN蛋白的表达载体，所述蛋白中胞质结构域已被改变。使用该载体产生出新的假型病毒载体。具体地说，本发明人构建出表达以下三种蛋白质的载体，第一种蛋白质含有与SeVHN蛋白相连接的SIV包膜蛋白胞质结构域；第二种蛋白质中的SIV包膜蛋白胞质结构域被HN蛋白胞质结构域所取代；第三种蛋白质为SeVF蛋白，其中全部或部分胞质结构域已缺失或被SIV包膜蛋白的胞质结构域所取代；然后，本发明人进一步构建出含有这些蛋白质的假型SIV载体(实施例11和12)。已证实这些载体可以将基因转移至人细胞，包括293T细胞和BEAS-2B细胞。由此发现HN假型化载体甚至在缺乏任何其它共存包膜蛋白，如VSV-G时，也能将基因转移至人细胞。还证实了使用这些经修饰HN蛋白的表达质粒构建出的基于MSCV的假型逆转录病毒载体能将基因转移至人细胞(实施例13)。大规模制备含有经修饰HN蛋白的假型SIV载体，富集所述载体，然后用这些载体感染人骨髓细胞。根据此结果，载体能将基因高效转移至CD34+骨髓细胞(实施例14)。
另外，本发明人使用流感病毒血凝素(HA)蛋白的表达载体制备出HA-假型化慢病毒载体。所得病毒可将基因导入人细胞，并能通过离心被高度富集(实施例16)。另外，本发明人还制备出HA/HN-假型化慢病毒载体，其含有流感病毒HA蛋白和仙台病毒经修饰的HN蛋白，并且证实该载体能将基因转移至人细胞(实施例17)。
如上所述，本发明人使用被具有血凝素活性的膜蛋白假型化的逆转录病毒，成功构建出能确保进行高效基因转移的病毒载体。另外，还证明病毒载体在来自体内或体内给药中，能将基因高效转移至包括造血干细胞在内的血细胞和造血细胞，以及具有粘液的细胞，如粘膜上皮细胞。
更具体地，本发明涉及(1)基本上纯的假型逆转录病毒载体，其含有具有血凝素活性的膜蛋白；(2)根据(1)的假型逆转录病毒载体，其中具有血凝素活性的膜蛋白衍生自具有血凝素活性的蛋白质，所述蛋白质包含于单链负链RNA病毒中；
(3)根据(2)的假型逆转录病毒载体，其中具有血凝素活性的膜蛋白衍生自副粘病毒的HN蛋白和/或正粘病毒的HA蛋白；(4)根据(2)的假型逆转录病毒载体，其中具有血凝素活性的膜蛋白是具有血凝素活性的蛋白质的胞质结构域的部分或全部，所述蛋白质包含于单链负链RNA病毒中，其中已通过取代，缺失和/或添加修饰所述部分或全部；(5)根据(1)至(3)中任一项的假型逆转录病毒载体，其进一步含有副粘病毒的F蛋白；(6)根据(5)的假型逆转录病毒载体，其中已通过缺失和/或添加修饰F蛋白的部分或全部胞质结构域；(7)根据(1)至(6)中任一项的假型逆转录病毒载体，其进一步含有得自对人细胞有感染性的病毒的包膜蛋白；(8)根据(7)的假型逆转录病毒载体，其中载体含有得自逆转录病毒的兼嗜性包膜蛋白；(9)根据(7)或(8)的假型逆转录病毒载体，其中载体含有得自水泡性口炎病毒的VSV-G蛋白；(10)根据(1)至(9)中任一项的假型逆转录病毒载体，其中逆转录病毒载体衍生自肿瘤病毒；(11)根据(1)至(9)中任一项的假型逆转录病毒载体，其中逆转录病毒载体衍生自慢病毒；(12)根据(11)的假型逆转录病毒载体，其中慢病毒衍生自猴免疫缺陷病毒；(13)根据(3)或(5)的假型逆转录病毒载体，其中副粘病毒是仙台病毒；(14)根据(1)至(13)中任一项的假型逆转录病毒载体，其中载体以可表达的方式含有外源基因；(15)根据(14)的假型逆转录病毒载体，其中载体被用于将基因转移至具有粘液的细胞；(16)根据(15)的假型逆转录病毒载体，其中具有粘液的细胞是粘膜上皮细胞；(17)根据(16)的假型逆转录病毒载体，其中粘膜上皮细胞是鼻腔或肺支气管的粘膜上皮细胞；
(18)根据(14)的假型逆转录病毒载体，其中载体被用于将基因转移至血细胞或造血细胞；(19)根据(18)的假型逆转录病毒载体，其中血细胞或造血细胞是造血干细胞；(20)用于基因转移的组合物，所述组合物含有根据(14)至(19)中任一项的假型逆转录病毒载体；(21)根据(20)的组合物，其中组合物是药物组合物；(22)将外源基因导入细胞的方法，所述方法包括使细胞与根据(14)至(19)中任一项的假型逆转录病毒载体接触的步骤；(23)用于产生根据(1)至(19)中任一项的假型逆转录病毒载体的包装细胞，所述细胞以可表达的方式含有编码具有血凝素活性的蛋白质的DNA；和(24)产生根据(1)至(19)中任一项的假型逆转录病毒载体的方法，所述方法包括在根据(23)的包装细胞中转录衍生自逆转录病毒的基因转移载体DNA的步骤。
本发明的逆转录病毒载体是被具有血凝素活性的膜蛋白假型化的基本上纯的假型逆转录病毒载体。本文所用术语“病毒载体”指的是能将核酸分子转移至宿主的病毒颗粒。术语“逆转录病毒载体”指的是含有逆转录病毒骨架的载体。术语“具有逆转录病毒骨架”指的是构成载体的病毒颗粒中的核酸分子基于逆转录病毒基因组。例如，其病毒颗粒中的核酸分子含有得自逆转录病毒基因组的包装信号序列的载体是本发明的逆转录病毒载体之一。
术语“被具有血凝素活性的膜蛋白假型化的逆转录病毒载体”指的是含有一种或多种具有血凝素活性的蛋白质的逆转录病毒载体，而在其天然对应物中却不含所述蛋白质。本文所用术语“基本上纯的假型逆转录病毒载体”指的是除了逆转录病毒的血凝素活性外，基本上不含有具有病毒血凝素活性的复制病毒的假型逆转录病毒载体。本发明优选的假型逆转录病毒载体是除了逆转录病毒以外基本上不含复制病毒的载体。术语“复制”指的是病毒在被病毒载体感染的宿主细胞中复制，并产生感染性的病毒颗粒。例如，在被假型逆转录病毒载体感染的细胞中，当与感染早期时相比，代表血凝素活性(红细胞凝集)的HA滴度在载体感染之后未显著升高时，即可评估载体基本上不含有含具有血凝素活性的膜蛋白的复制病毒。
具有血凝素活性的膜蛋白可以是天然蛋白质或人工蛋白质；优选蛋白质具有病毒血凝素活性。据报道多种类型的病毒具有血凝素活性。红细胞类型和检测血凝素活性所用的最适反应温度取决于特定的病毒类型。据报道对风疹病毒而言，反应需要钙离子的存在。对虫媒病毒而言，反应的最适pH落入很窄的范围。病毒血凝素存在于肠道病毒或风疹病毒的毒粒自身，或存在于虫媒病毒，腺病毒等的较小颗粒以及毒粒中。痘病毒血凝素作为含有脂质的非-毒粒颗粒存在。本发明的假型逆转录病毒可含有这种蛋白质。III-型腺病毒使大鼠红细胞部分凝集，导致不完全的凝集；所述蛋白质也可用作具有血凝素活性的膜蛋白。
通过本领域已知的方法(The society of research associates of TheNational Institute of Health，Eds.，General Experimental Virology，2nd Ed，pp.214-225，MARUZEN CO.)，可以检测血凝素活性(红细胞凝集；HA滴度)。红细胞包括例如得自鸡(包括小鸡和成鸡)，鹅，大鼠，豚鼠，恒河猴，绿猴和人的红细胞。反应温度可以是0℃，4℃，室温，37℃等，具体温度取决于蛋白质的类型。各种病毒红细胞凝集反应的条件例举如下
表1

特别优选本发明的假型逆转录病毒中具有血凝素活性的膜蛋白是病毒蛋白质；具体地说，所述蛋白质包括副粘病毒的HN蛋白；正粘病毒和流感病毒的HA蛋白；披膜病毒E1蛋白；痘苗病毒的A27L，H3L和D8L蛋白；黄病毒的M和E蛋白；冠状病毒的E1和E2蛋白；布尼病毒的G1蛋白等。其中本发明的假型逆转录病毒中所含的具有血凝素活性的膜蛋白优选为得自单链负链RNA病毒的蛋白质，特别优选为副粘病毒的HN蛋白。
本文所用术语“单链负链RNA病毒”指的是基因组中含有单链负链(即(-)链)RNA的病毒。所述病毒包括副粘病毒(副粘病毒科；包括副粘病毒属，麻疹病毒属，风疹病毒属，肺病毒属等)，弹状病毒(弹状病毒科，包括水泡病毒属，狂犬病病毒属，Ephemerovirus属等)，线状病毒(线状病毒科)，正粘病毒(正粘病毒科，包括流感病毒A，B和C，Thogoto-样病毒等)，布尼病毒(布尼病毒科，包括布尼病毒属，汉坦病毒属，内罗病毒属，白蛉热病毒属等)，沙粒病毒(沙粒病毒科)等。
本文所用术语“副粘病毒”指的是属于副粘病毒科的病毒。副粘病毒包括例如仙台病毒，新城疫病毒，腮腺炎病毒，麻疹病毒，RS病毒(呼吸道合胞病毒)，牛瘟病毒，犬瘟病毒，猴副流感病毒(SV5)，人副流感病毒1-型，2-型和3-型等。仙台病毒包括野生型毒株，突变毒株，实验室毒株，人工构建的毒株等。诸如DI颗粒等不完整病毒(J.Virol.68，8413-8417(1994))，合成的寡核苷酸等也可用作产生本发明疫苗的材料。HN蛋白是副粘病毒的蛋白质。已知的编码副粘病毒病毒蛋白质的基因包括NP，P，M，F，HN和L基因。属于副粘病毒科的病毒的“NP，P，M，F，HN和L基因”对应于编码核衣壳，磷，基质，融合，血凝素-神经氨酸酶和大蛋白的基因。属于副粘病毒科亚科的病毒的各个基因一般如下所示。NP基因一般也描述为“N基因”。
副粘病毒属 NPP/C/V MF HN -L风疹病毒属 NPP/V MF HN (SH) L麻疹病毒属 NPP/C/V MF H -L归类于副粘病毒科副粘病毒属的仙台病毒基因的核苷酸序列的数据库登录号为NP基因为M29343，M30202，M30203，M30204，M51331，M55565，M69046和X17218，P基因为M30202，M30203，M30204，M55565，M69046，X00583，X17007和X17008，M基因为D11446，K02742，M30202，M30203，M30204，M69046，U31956，X00584和X53056，F基因为D00152，D11446，D17334，D17335，M30202，M30203，M30204，M69046，X00152和X02131，HN基因为D26475，M12397，M30202，M30203，M30204，M69046，X00586，X02808和X56131，和L基因为D00053，M30202，M30203，M30204，M69040，X00587和X58886。
如本文实施例中所述，通过制备灭活的副粘病毒，即具有副粘病毒包膜蛋白的病毒体，并将其与逆转录病毒融合，即可产生被副粘病毒包膜蛋白假型化的逆转录病毒载体。通过在逆转录病毒包装细胞中表达副粘病毒包膜蛋白的表达载体，也可产生载体。
本发明的假型逆转录病毒载体除了含有具有血凝素活性的膜蛋白，如副粘病毒的HN蛋白外，还可含有例如副粘病毒的F蛋白。本发明证实含有HN和F蛋白的假型逆转录病毒载体表现出高效基因转移。含有F和HN蛋白的假型逆转录病毒载体落入本发明的范围内。本发明的假型逆转录病毒载体还可含有副粘病毒的M蛋白。
另外，本发明的假型逆转录病毒载体另外还可含有得自其它病毒的包膜蛋白。例如，优选的包膜蛋白包括得自对人细胞有感染性的病毒的蛋白质。所述蛋白质包括但不限于逆转录病毒的兼嗜性包膜蛋白，水泡性口炎病毒(VSV)的G蛋白等。属于疱疹病毒科的病毒的所述蛋白质包括例如单纯疱疹病毒的gB，gD，gH和gp85蛋白，EB病毒的gp350和gp220蛋白等。属于嗜肝DNA病毒科的病毒的所述蛋白质包括乙肝病毒的S蛋白等。
例如，本发明的载体优选为含有逆转录病毒兼嗜性包膜(兼嗜性env)蛋白和HN蛋白的载体。或者，例如，载体可含有VSV-G蛋白，该蛋白质是水泡性口炎病毒(VSV)的表面糖蛋白。据信VSV-G使用大多数动物细胞中都存在的磷脂作为受体，因此，通过使用含有VSV-G蛋白和HN蛋白的载体，能显著增加可导入基因的细胞种类，也可提高转移效率。实际上，含有VSV-G蛋白和HN蛋白的载体比仅含有VSV-G的载体表现出更高的基因转移效率。因此，含有VSV-G蛋白和HN蛋白的载体是本发明优选的载体。所述载体可进一步含有副粘病毒F蛋白。简单地说，含有逆转录病毒兼嗜性包膜蛋白，F蛋白和HN蛋白的载体，以及含有VSV-G蛋白，F蛋白和HN蛋白的载体都在本发明的范围之内。另外，这些载体可进一步含有副粘病毒的M蛋白。具体地说，含有逆转录病毒兼嗜性包膜蛋白，F蛋白，HN蛋白和M蛋白的载体，以及含有VSV-G蛋白，F蛋白，HN蛋白和M蛋白的载体都在本发明的范围之内。如上所述，含有副粘病毒F和HN蛋白的载体以及含有F，HN和M蛋白的载体也可以将基因高效转移至具有粘液的细胞，含有造血干细胞的细胞级分等，而通过常规技术几乎不能将基因转移至这些细胞。
由于VSV-G蛋白是糖蛋白，并且在膜上形成稳定的同三聚体，载体颗粒在纯化过程中几乎不会裂解；因此通过离心可使颗粒高度浓缩(Yang，Y等，Hum Gene TherSep，6(9)，1203-13.1995)。本发明人证实通过离心可浓缩被VSV-G和被F和HN假型化的SIV载体。
对制备假型载体所用的副粘病毒HN，F和M蛋白的类型没有限制。特别优选包括仙台病毒在内的呼吸道病毒的蛋白质。仙台病毒的HN，F和M蛋白包括例如得自Z毒株的那些蛋白质。逆转录病毒兼嗜性包膜蛋白包括例如得自小鼠白血病病毒(MuLV)4070A毒株的包膜蛋白。也可以使用得自MuMLV10A1的包膜蛋白(例如pCL-10A1(Imgenex)(Naviaux，R.K等，J.Virol.705701-5705(1996))。亲嗜性包膜蛋白包括例如得自Moloney鼠白血病病毒(MoMuLV)的包膜蛋白。水泡性口炎病毒G蛋白(VSV-G)包括例如得自印第安纳血清型毒株的蛋白质(J.Virology 39519-528(1981))。除此之外，蛋白质可得自所需的毒株。
包括HN，F，M，VSV-G和逆转录病毒包膜蛋白的上述包膜蛋白可以是得自野生型病毒的完整蛋白质，或者是自发或人工突变的蛋白质。例如，身为结构蛋白的HN蛋白既具有血凝素活性(为红细胞凝集)也具有神经氨酸酶活性。例如，前一活性的降低可增加病毒在血液中的稳定性。例如，通过修饰后一活性可控制经由HN蛋白的感染效率。或者，通过修饰参与膜融合的F蛋白可以控制融合效率。此外，例如，对F蛋白和HN蛋白的可用作细胞表面抗原分子的抗原呈递表位进行分析，基于分析结果，通过使用抗原呈递能力被削弱的蛋白质，即可制备出本发明的假型逆转录病毒。另外，可以使用致病性副粘病毒减毒毒株的包膜蛋白。
例如，通过使用经修饰的蛋白质使本发明的逆转录病毒载体假型化，即可制备出高效基因转移载体，其中所述蛋白质是具有血凝素活性的病毒包膜蛋白，或是胞质结构域已通过缺失，取代和/或添加而被修饰的其它包膜蛋白。本发明涉及含有蛋白质的假型逆转录病毒载体，其中已通过取代，缺失和/或添加修饰具有血凝素活性的野生型膜蛋白的部分或全部胞质结构域。具体地说，例如，优选使用胞质结构域已被缺失，或在原始蛋白质中替代或添加以另一种膜蛋白(例如包括慢病毒的逆转录病毒的包膜蛋白)的胞质结构域的经修饰的副粘病毒HN蛋白和/或F蛋白来产生高感染性的病毒载体。本发明提供了具有血凝素活性的膜蛋白，其中已通过取代，缺失和/或添加修饰野生型膜蛋白的部分或全部胞质结构域，本发明还提供了编码所述蛋白质的核酸(DNA，RNA等)。特别地，本发明提供了经修饰的病毒血凝素蛋白以及编码所述蛋白质的核酸，其中所述蛋白质的胞质结构域已通过取代，缺失和/或添加而被修饰。例如，优选含有SEQ ID NO40或41的氨基酸序列的经修饰的HN蛋白。所述经修饰的蛋白质和编码该蛋白质的核酸可用于产生本发明的假型病毒。
具体地说，通过使用被经修饰的蛋白质假型化的逆转录病毒，可将外源基因高效导入包括人细胞在内的多种细胞，所述蛋白质为副粘病毒HN蛋白，其胞质结构域已被如SIV的慢病毒或逆转录病毒的包膜蛋白的胞质结构域所取代(例如由根据实施例11的pCAGGS-SIVct/HN编码的蛋白质)；所述蛋白质也可以是另一种经修饰的蛋白质，其中如慢病毒的逆转录病毒的包膜蛋白胞质结构域已被添加至副粘病毒HN蛋白中(例如根据实施例11的pCAGGS-SIVct+HN)。可以缺失HN蛋白胞质结构域的任意部分；可以添加逆转录病毒的包膜蛋白胞质结构域的任意部分；可以缺失，取代和/或添加部分或全部胞质结构域。
所述病毒载体另外还可含有经修饰的副粘病毒F蛋白。例如，可以使用胞质结构域已被缺失的副粘病毒F蛋白，或通过在此截短蛋白质上添加如SIV的慢病毒或逆转录病毒的包膜蛋白的胞质结构域而获得的蛋白质。具体地说，例如，构建质粒以用于表达胞质结构域氨基酸已被缺失的F蛋白。可以缺失该结构域的任何部分；可以缺失部分或全部胞质结构域。含有截短的仙台病毒F蛋白(Fct4)的假型病毒表现出显著高效的基因转移，所述F蛋白通过缺失其余部分仅含有胞质结构域的4个氨基酸。因此，优选使用因人工缺失而不含或仅含胞质结构域的几个氨基酸残基的蛋白质来产生本发明的假型病毒。通过在这些截短的F蛋白上连接另一种病毒的包膜蛋白(例如慢病毒的包膜蛋白)的部分或全部胞质结构域，即可产生F蛋白胞质结构域已被截然不同的肽所取代的蛋白质。例如，所述蛋白质包括连接有SIV包膜蛋白胞质结构域5’末端前11个氨基酸(SIVct11)的蛋白质。因此，本发明提供了副粘病毒F蛋白，其中已通过取代，缺失和/或添加修饰野生型蛋白质的部分或全部胞质结构域，本发明还提供了编码所述蛋白质的核酸。具体地说，本发明提供了F蛋白以及编码该蛋白质的核酸，其中所述F蛋白的胞质结构域已被包括慢病毒的逆转录病毒的包膜蛋白的部分或全部胞质结构域所取代。例如，优选含有SEQ ID NO42，43，44，45，46或47的氨基酸序列的经修饰的F蛋白。可以使用这些经修饰的蛋白质和编码所述蛋白质的核酸产生本发明的假型病毒。
也优选将属于正粘病毒科的病毒的HA蛋白用作具有血凝素活性的病毒包膜蛋白。例如，通过使用流感病毒包膜蛋白的表达质粒产生的假型病毒能感染包括人细胞在内的多种哺乳动物细胞。流感病毒包膜可得自所需的分离的流感病毒毒株。在流感病毒出芽的过程中，神经氨酸酶是造成与唾液酸的联接断裂的原因。因此，通过用神经氨酸酶处理即可制备被HA假型化的感染性病毒颗粒。或者，通过使用也编码具有神经氨酸酶活性的蛋白质的病毒载体，可以自动断开与唾液酸的联接。在这种情况下，特别优选使用具有神经氨酸酶活性的病毒包膜蛋白，例如副粘病毒的HN蛋白。因此，本发明提供了被HA/HN蛋白假型化的逆转录病毒载体。
本发明的逆转录病毒载体还包括衍生自肿瘤病毒的逆转录病毒载体。术语“肿瘤病毒”指的是属于肿瘤病毒亚科的逆转录病毒(肿瘤病毒)。肿瘤病毒包括参与癌症形成的逆转录病毒，例如肉瘤病毒，白血病病毒，乳瘤病毒等。例如，Moloney鼠白血病病毒(MoMLV)是最早开发的逆转录病毒载体之一，现已得到很多改善并被广泛使用。本发明优选使用通过用具有血凝素活性的蛋白质，如副粘病毒HN蛋白使MoMLV假型化而制备的病毒载体。另外，实施例中使用的鼠干细胞病毒(MSCV)是优选的基因转移载体，特别是在将基因转移至血细胞，造血细胞，胚胎干细胞等时更是如此。
本发明的逆转录病毒载体也包括得自慢病毒的那些载体。术语“慢病毒”指的是属于慢病毒亚科的逆转录病毒(慢病毒)。慢病毒包括人免疫缺陷病毒(HIV)(例如HIV1或HIV2)，猴免疫缺陷病毒(SIV)，猫免疫缺陷病毒(FIV)，梅迪-维斯纳病毒，马传染性贫血病毒(EIAV)，山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)等。本发明的逆转录病毒载体可得自所需的毒株或亚型。例如，HIV-1包括每一种主要(M)亚型(包括A-J)，N和异常亚型(O)(Hu，D.J等，JAMA1996；275210-216；Zhu，T等，Nature 1998，5；391(6667)594-7；Simon，F等，Nat.Med.1998，4(9)1032-7)。分离的SIV毒株包括例如SIVagm，SIVcpz，SIVmac，SIVmnd，SIVsnm，SIVsyk等。
慢病毒可感染非分裂的细胞，病毒基因组可整合至宿主细胞染色体。据信由gag和vpr编码的核转位信号负责整合。当使用此特征，基于慢病毒构建本发明的病毒载体时，可将基因导入活组织中不分裂的细胞和几乎不分裂的细胞，例如多种组织中的干细胞，使基因能被长期表达。
在任何其它慢病毒之前，人们使用人免疫缺陷病毒(HIV)构建载体，本发明也优选使用这种载体。已经基于猫免疫缺陷病毒(FIV)(Poeschla，E.M等，Nature Medicine，4(3)，354-7，1998)和山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)(Mselli-Lakhal，L等，Arch.Virol.，143(4)，681-95，1998)开发出载体。可以使用这些载体产生本发明的载体。
猴免疫缺陷病毒(SIV)作为源自猴的HIV-样病毒被发现，它与HIV一起形成灵长类慢病毒组(E.Ido and M.Hayamizu，“Gene，Infection andPathogenicity of Simian Immunodeficiency Virus”，Protein，Nucleic acid andEnzyme，Vol.39，No.8，1994)。该组被进一步粗分为四个亚组(1)包括导致人获得性免疫缺损综合征的病毒HIV-1和分离自黑猩猩的SIVcpz的HIV-1亚组；(2)包括分离自Sooty Mangabey(Cercocebus atys)的SIVsmm，分离自恒河猴(Macaca mulatta)的SIVmac和对人的致病性较低的HIV-2(Jaffar,S等，J.Acquir.Immune Defic.Syndr.Hum.Retrovirol.，16(5)，327-32，1997)的HIV-2亚组；(3)以分离自非洲绿猴(Cercopithecus aethiops)的SIVagm为代表的SIVagm亚组；和(4)以分离自山魈(Papio sphinx)的SIVmnd为代表的SIVmnd亚组。
目前尚无报道表明SIVagm和SIVmnd对天然宿主的致病性(Ohta，Y等，Int.J.Cancer，15，41(1)，115-22，1988；Miura，T等，J.Med.Primatol.，18(3-4)，255-9，1989；M.Hayamizu，Nippon Rinsho，47，1，1989)。先前的报道特别地谈到根据感染实验的结果，身为SIVagm之一并且为本文实施例所用的TYO-1毒株对于食蟹猴(Macaca facicularis)，恒河猴(Macaca mulatta)以及天然宿主没有致病性(Ali，M等，Gene Therapy，1(6)，367-84，1994；Honio，S等，J.Med.Primatol.，19(1)，9-20，1990)。没有报道表明SIVagm能感染人并在人体中发作，因此，据信SIVagm对人没有致病性。一般说来，灵长类动物中的慢病毒具有严格的种族-特异性，有关得自天然宿主的SIVagm的种间交叉感染及其发作的例子的报道较少；如果有的话，一般发作频率低，疾病进程缓慢(Novembre，F.J等，J.Virol.，71(5)，4086-91，1997)。因此，据认为基于SIVagm，尤其是SIVagm TYO-1制备的病毒载体相对于基于HIV-1或其它慢病毒的载体而言更加安全，因此本发明优选使用这些载体。
另外，本发明的逆转录病毒载体包括衍生自泡沫病毒的载体。泡沫病毒包括例如泡沫病毒(DE4318387；WO9607749；Virology(1995)210，1，167-178；J.Virol.(1996)70，1，217-22)。特别地，在基因治疗和施用重组疫苗时，衍生自泡沫病毒的本发明载体可用于将外源基因导入人细胞。
可以修饰本发明的逆转录病毒载体中的LTR(长末端重复序列)。LTR是逆转录病毒-特异性序列，它存在于病毒基因组的两端。5’LTR用作启动子，可增强原病毒的mRNA转录。因此，用另一个具有较强启动子活性的启动子取代基因转移载体中表现出5’LTR启动子活性的部分，可以导致基因转移载体mRNA转录水平的增加，从而改善包装效率，增加载体滴度。另外，例如，对慢病毒而言，已知通过病毒tat蛋白可增强5’LTR的转录活性，因此，用不依赖tat蛋白的启动子取代5’LTR能够从包装载体中除去tat。感染细胞的病毒的胞内RNA进行逆转录，并形成两端LTR之间相互连接而成的闭环结构，然后通过连接位点和病毒整合酶之间的相互作用整合至细胞染色体中。转录自原病毒的mRNA对应于自5’LTR中的转录起始位点至位于下游的3’LTR polyA序列的区域；病毒颗粒中未包装5’LTR启动子部分。因此，即使启动子被另一个序列所取代，整合至靶细胞染色体的部分仍无变化。根据上述事实，5’LTR启动子的取代可提供滴度较高，更加安全的载体。因此，基因转移载体5’末端启动子的取代可增加可包装载体的滴度。
使用通过部分消除3’LTR序列而制备的，能防止全长载体mRNA在其靶细胞中转录的自失活载体(SIN载体)可以改善安全性。整合至靶细胞染色体的慢病毒原病毒具有与其5’末端结合的3’LTR U3部分。因此，在靶细胞的染色体中，基因转移载体在5’末端含有U3，相应地，覆盖整个基因转移载体的RNA的转录从此处开始。如果靶细胞中有慢病毒或相关蛋白质，基因转移载体可能会被重新包装并感染其它细胞。另外一种可能性是由3’LTR启动子表达与病毒基因组的3’末端相邻的宿主基因(Rosenberg，N.，Jolicoeur，P.，Retroviral Pathogenesis.Retroviruses.ColdSpring Harbor Laboratory Press，475-585，1997)。据认为该事件对于逆转录病毒载体而言却很成问题。因此，为了解决此问题，人们开发出SIN载体(Yu，S.F等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83(10)，3194-8，1986)。当基因转移载体的3’LTR中缺失U3部分时，靶细胞中既不存在5’LTR启动子，也不存在3’LTR启动子。在这种情况下，全长病毒RNA和宿主基因都不会被转录，而用内部启动子可获得所需基因的转录；这种载体可以是安全性较高的超表达载体，因此本发明优选该载体。可以根据本领域已知的任何方法或实施例5中描述的方法构建SIN载体。
通过在宿主细胞中转录含有包装信号的基因转移载体DNA，并在gag和pol蛋白以及包膜蛋白的存在下形成病毒颗粒，即可产生逆转录病毒。基因转移载体DNA可以是DNA载体，例如质粒，或是整合至包装细胞染色体的DNA。尽管优选整合由基因转移载体DNA编码的包装信号序列(只要能维持基于序列形成的结构即可)，但需要使载体DNA包装信号与另一个用于提供gag和pol蛋白的包装载体之间同源的序列最小化，以降低因多种载体之间的重组而形成野生型病毒的频率。因此，优选使用尽可能短的序列构建基因转移载体DNA，所述序列含有包装所需的序列，符合包装效率和安全性双重标准。
对包装信号的类型没有限制，只要在导入包装载体的细胞中能够进行包装即可；根据包装载体的类型，可以使用得自逆转录病毒，慢病毒，免疫缺陷病毒等的包装信号。
例如，对实施例中使用的衍生自SIVagm的包装载体而言，用于从中获得信号的病毒类型仅限于SIV，因为HIV载体不能被包装。然而，当使用衍生自HIV的包装载体时，衍生自SIV的基因转移载体也是可包装的。因此，当混合各自衍生自不同类型的慢病毒的基因转移载体和包装载体时，可以降低重组病毒形成的频率。在这种情况下，优选使用灵长类动物慢病毒的组合(例如HIV和SIV)。
在优选的基因转移载体DNA中，已修饰gag蛋白以使其不表达。在活体中，病毒gag蛋白可作为外源物质被检测到，因此它是潜在的抗原。或者，该蛋白质可影响细胞功能。为了防止gag蛋白表达，可通过添加或缺失gag起始密码子下游的核苷酸导入移码突变以进行修饰。也优选缺失gag蛋白的部分编码区。一般说来，已知病毒包装必需gag蛋白编码区的5’部分。因此，在基因转移载体中，优选在C末端缺失gag蛋白的编码区。优选缺失尽可能大的gag编码区部分，只要缺失不会对包装效率产生很大影响即可。另外，优选用除ATG外的密码子取代gag蛋白的起始密码子(ATG)。可以适当选择取代所用的密码子以不对包装效率产生重大影响。通过将构建的含有包装信号的基因转移载体DNA导入适当的包装细胞，即可产生含有基因转移载体DNA的转录产物的病毒载体。可以从包装细胞的培养物上清液等中回收所产生的病毒载体颗粒。
对包装细胞的类型没有限制，只要是病毒生产中一般常用的细胞系即可。当用于对人进行基因治疗时，得自人或猴的细胞是合适的。可用作包装细胞的人细胞系包括例如293细胞，293T细胞，293EBNA细胞，SW480细胞，u87MG细胞，HOS细胞，C8166细胞，MT-4细胞，Molt-4细胞，HeLa细胞，HT1080细胞，TE671细胞等。猴细胞系包括例如COS1细胞，COS7细胞，CV-1细胞，BMT10细胞等。另外，也可以使用先前已建立的包装细胞。所述包装细胞包括例如Bosc23细胞，PE501细胞等。
对于插入载体中的外源基因的类型没有限制，它包括例如不编码任何蛋白质的核酸，例如反义核酸或核酶，还包括编码蛋白质的核酸。
近年来，人们注意到包括造血干细胞的多种干细胞可作为基因治疗的靶(Y.Hanazono，Molecular Medicine，Vol.36，No.7，1999)。如实施例中所示，本发明的假型逆转录病毒载体可以将基因高效转移至得自人骨髓的CD34+细胞；近年来，人们注意到含有CD34+细胞的级分是含有造血干细胞的细胞级分。先前的报道描述道在使用含有甲基纤维素的培养基的集落试验中，CD34+细胞表现出多能性(Kirshenbaum，A.S等，J.Immunol.，148(3)，772-7，1992)，将CD34+细胞移植到复合免疫缺损的NOD/SCID小鼠品系可导致细胞定位于小鼠骨髓并重建造血系统(Larochelle，A等，Nat.Med.，2(12)，1329-37，1996)。因此，可以认为干细胞-样不成熟的细胞至少存在于CD34+细胞级分。CD34+细胞级分中的造血干细胞处于不分裂的状态。一般说来，当使用逆转录病毒载体时，对此细胞的基因转移效率低下(Kiem，H.P等，Curr Opin.Oncol.，7(2)，107-14，1995.)，但通过使用本发明的假型载体可大大改善感染效率。特别是，通过使用慢病毒载体，如HIV或SIV载体有望进一步增加基因转移至不分裂细胞的效率。本发明涉及将基因导入血细胞或造血细胞的方法，其中所述方法包括使假型逆转录病毒载体与血细胞或造血细胞接触的步骤，所述载体含有具有血凝素活性的膜蛋白，本发明还涉及假型逆转录病毒载体将基因导入血细胞或造血细胞的用途，其中所述载体含有具有血凝素活性的膜蛋白。通过使用具有血凝素活性的蛋白质而被假型化的本发明的逆转录病毒载体可将基因高效转移至血细胞和造血细胞，因此可用于以血液细胞为靶的基因治疗，例如腺苷脱氨酶(ADA)缺陷(Blaese，R.M.，Pediatr.Res.，33(1 Suppl)，S49-53，1993)，血友病(Kay，M.A等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96(18)，9973-5，1999)和范可尼贫血症等。可通过例如来自体内的方法进行给药。
通过例如使用抗多种已知表面抗原的抗体进行流式细胞术分析，或通过集落试验，或通过评估造血系统已被破坏的小鼠体内造血系统基于造血细胞移植的重建，即可评价外源基因是否导入血细胞和造血细胞。
靶为可使用本发明载体的那些造血细胞的基因治疗包括例如在抗-癌化疗中使用药物抗性基因MDR1保护干细胞(Licht，T等，Gene Ther.(2000)7，4，348-58)；导入正常FANCC基因以治疗范可尼贫血症(Liu，J.M等，Hum.Gene Ther.(1999)10，14，2337-46)；导入细胞因子组合(血小板生成素，白介素6和11和Flt-3配体)以增强来自体内的干细胞增殖(WO 9907831)；表达嵌合蛋白，如Flt-3激动剂以治疗血球减少症(WO 9846750)；导入人β珠蛋白基因以治疗β地中海贫血症(WO 9741141)；用IL-6拮抗剂和自杀基因表达的联合疗法治疗IL-6-依赖型多发性骨髓瘤(德国专利号DE19704979)；导入如受体激动剂的基因，所述激动剂包括以下物质的组合造血因子[白细胞介素(GM-CSF，G-CSF-Ser17，M-CSF，促红细胞生成素，IL-1，IL-14，IL-2，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13和IL-15)，白血病抑制因子(LIF)，flt3/flk2配体，人生长激素，B细胞生长因子，B细胞分化因子，红细胞分化因子(EDF)或干细胞因子(SCF)](WO 9712985)，用于干细胞培养和造血疾病基因治疗的c-mpl受体激动剂(WO 9712978)，用于增殖人造血祖细胞的IL-6和IL-6可溶性受体融合蛋白(Nat.Biotechnol.(1997)15，2，142-45)，用于增殖造血祖细胞的IL-6超激动剂和超拮抗剂(WO9618648)，用于治疗血液病的因子-X(J.Cell.Bioche.(1995)Suppl.21A，410)，用于增殖人造血祖细胞的干细胞因子，IL-6，和可溶性IL-6受体复合物(Gene Ther.(1995)2，9，694)，靶为RNA病毒的核酶以及可用于防止HIV感染和用于胞内免疫的反义和/或假RNA(WO 9622368)。
本发明的HN蛋白-假型化逆转录病毒载体对含粘液的细胞具有高度感染性，所述细胞如鼻腔粘膜上皮细胞和肺支气管粘膜上皮细胞。本发明的载体可用于将外源基因高效转移至含粘液的细胞，而通过任何常规方法都几乎不能将基因转移至这些细胞。本发明涉及将基因导入含粘液细胞的方法，所述方法包括使假型逆转录病毒载体与含粘液的细胞接触的步骤，所述载体含有具有血凝素活性的膜蛋白，本发明还涉及假型逆转录病毒载体将基因导入含粘液的细胞的用途，其中所述载体含有具有血凝素活性的膜蛋白。所述含粘液的细胞特别包括粘膜上皮细胞，尤其是例如鼻腔或肺支气管的粘膜上皮细胞。
具体的用途实例包括例如通过将基因(IL-2，IFN-γ，TGF-β等)转移至抗原呈递细胞(APC)丰富的皮肤和粘膜以导入免疫反应(WO 9505853)；通过给粘膜以口服基因进行抗轮状病毒的免疫接种(J.Virol.(1998)72，7，5757-61)；粘膜给药以治疗自身免疫病(WO 9746253)；粘膜给药以防止感染(WO9621356)；给女性生殖器粘膜施用基因以防止由性传播疾病或乳头瘤病毒感染所引起的宫颈癌(Infect.Immun.(1998)66，1，322-29)；通过经粘膜给药使给药变得更加简单和安全(Proc.Am.Assoc.Cancer Res.(1995)36，86Meet.，418)。
通过与药物可接受载体或介质适当混合，可将本发明的假型逆转录病毒载体制备成组合物。具体地，例如，可将载体配制成与无菌水，生理盐水，培养基，血清，磷酸缓冲的生理盐水(PBS)等适当混合的组合物。组合物还可含有包括稳定剂，抗微生物制剂等的其它组分。本发明的组合物的剂量形式可以是例如水溶液，胶囊，悬浮液，糖浆等。含有本发明的假型逆转录病毒载体的组合物可用作试剂或药物。例如，本发明的组合物可用作在体外或体内将基因转移至多种细胞的试剂，或用作来自体内或体内基因治疗的药物。一般说来，通过例如本领域技术人员已知的方法可对患者进行给药，所述方法包括动脉内，静脉内，腹膜内，皮下，肠内，口或鼻内给药，或来自体内地给药。特别合适的给药方式是对鼻腔或支气管粘膜给药，和对血细胞和造血细胞进行来自体内的给药。
本发明的病毒载体可用于对多种其它遗传病进行基因治疗。对所治疗的疾病类型没有限制。例如，所治疗的疾病及其单个致病基因包括高歇氏病，β-脑苷脂酶(染色体20)；血友病，血液凝结因子VIII(X染色体)和血液凝结因子IX(X染色体)；腺苷脱氨酶缺陷，腺苷脱氨酶；苯丙酮尿症，苯丙氨酸羟化酶(染色体12)；脊髓病性肌萎缩，肌营养不良蛋白(X染色体)；家族性血胆固醇过多症，LDL受体(染色体19)；膀胱纤维变性，CFTR基因的染色体易位。据认为涉及到多个其它基因的待治疗疾病包括神经变性疾病，如早老性痴呆和帕金森氏病，局部缺血性脑病，痴呆和难以治疗的感染，如AIDS。可以考虑灭活HIV转录因子的疗法，其中在体外将本发明基于SIV的载体导入胞外取自AIDS患者的造血干细胞，以在HIV感染之前增加得自SIV的基因组的转录，再将转染的细胞返还至患者体内。另外，对慢性病而言，可能的应用实例包括抑制VEGF和FGF2基因的表达以治疗局部缺血性心脏病，以及抑制细胞增殖相关基因，如细胞增殖因子(PDGF，TGF-β等)和依赖于细胞周期蛋白的激酶的表达以对动脉硬化进行基因治疗。另外，对糖尿病而言，候选基因可以是BDNF基因。另外，该方法可应用于取代疗法，其中将诸如癌症抑制基因p53(其基因突变导致癌症产生)的基因整合至染色体中，该方法通过在体外将多-药物-抗性基因导入得自骨髓的造血干细胞，然后通过将这些细胞返还至患者血液，而使治疗超越癌症药物疗法的局限性。至于自身免疫病，如多发性硬化，慢性风湿性关节炎，SLE和肾小球性肾炎的基因治疗，也可以通过反义表达T-细胞受体，多种粘附因子(例如ICAM-1，LFA-1，VCAM-1和LFA-4等)，细胞因子和细胞因子受体(例如TNF，IL-8，IL-6和IL-1等)，细胞增殖因子(例如PDGF和TGF-β等)和激活因子(例如MMP等)来抑制表达。至于变应性疾病的基因治疗，可以通过反义表达IL-4，FcεR-I等来抑制表达。至于与器官移植有关的基因治疗，通过将非-人动物供体的组织相容性抗原改变为人-型，可以提高异种移植成功的百分比。另外，也可考虑以下疗法，即将外源基因导入人ES细胞的染色体，从而在胚胎阶段形成缺陷基因以补充全身性循环酶，生长因子等的缺陷。
例如，IL-4促使辅助T淋巴细胞分化成Th2淋巴细胞。Th2淋巴细胞分泌细胞因子，例如IL-4，IL-5，IL-9和IL-13，它们介导气喘炎症。IL-4是导致肺粘膜分泌粘液的分子，它与呼吸障碍有关。IL-4调节VCAM-1的表达，VCAM-1是与嗜伊红性粒细胞表面存在的VLA4分子相互作用的细胞粘附分子。相互作用使得嗜伊红性粒细胞从血液中迁移至肺组织中的炎症位点。由于IL-4能增加B细胞的数目并导致产生负责变应性反应的抗原-特异性IgE，所产生的抗原-特异性IgE导致肥大细胞释放炎性介质，例如组胺，白三烯，从而导致支气管缩小。根据IL-4的此作用，可以使用可溶性白介素4(IL-4)受体等的表达载体来治疗气喘患者。
附图简述图1的照片显示了用被鼠干细胞病毒(MSCV)感染的293T细胞获得的结果，所述病毒被得自仙台病毒的F，HN，或F和HN蛋白假型化。通过使用表达EGFP的基因转移载体(pMSCV EGFP)完成病毒包装。上述实验组中的标记“F”，“HN”和“F/HN”分别对应于使用通过在包装细胞中表达仙台病毒的F，HN，以及F和HN蛋白而产生的病毒感染所获得的结果。在“VSV-G/Null”栏中，最上方的实验组表示被VSV-G假型化的阳性对照；中间和下方的实验组表示未被假型化的阴性对照，它不表达用于假型化的env蛋白，如F，HN和VSV-G。右边的实验组中以“Eco”和“Ampho”表示的标记分别对应于使用通过在包装细胞中表达亲嗜性env和兼嗜性env而制备的病毒所获得的结果。标记“Null”表示未表达逆转录病毒的env。
图2以照片显示了具有兼嗜性env的逆转录病毒的HA试验结果，所述病毒被仙台病毒HN假型化。图中还显示出病毒生产所用的pMSCVEGFP，pCl-Ampho和pCAGGS-HN的量(图中的MSCVAMPHOHN)。尽管用含有兼嗜性env的对照逆转录病毒未检测到红细胞凝集(图中的Ampho-Retro)，但用被仙台病毒HN假型化的逆转录病毒却观察到凝集现象(图中的HN-Ampho-Retro)。
图3是显示试验结果的图，所述试验包括用被仙台病毒HN蛋白假型化的，含有兼嗜性env的MSCV(图中的HN-ampho)感染人骨髓细胞，并使用CD34为标记，通过基于流式细胞术的分级分离测定感染细胞(表达GFP的细胞)的百分比。图中所示的“ampho”指的是未被HN蛋白假型化的对照。每个柱形图显示的是GFP-阳性细胞对CD34阴性(CD34-)细胞或CD34阳性(CD34+)细胞的比例。
图4图解显示了以下结构(a)用作另一个构建体的骨架的SIVagm-基因组质粒，(b)构建的包装载体，(c)基因转移载体，和(d)VSV-G-供给载体。
图5以照片的形式显示了SIVagm载体-介导的将β-半乳糖苷酶基因导入293T细胞的结果。上方的试验组显示的是在载体感染293T细胞48小时之后，使用被载体质粒转染的细胞的上清液进行X-gal染色所获得的结果。在多个细胞中检测到β-半乳糖苷酶的表达。下方的试验组显示的是未被处理的对照细胞的X-gal染色。
图6显示了下述试验获得的照片，所述试验包括将EGFP基因导入G2-M相-停滞的293T细胞和用视黄酸分化的SH-SY5Y细胞，其中基因转移由SIVagm SIN载体介导，然后使用荧光显微镜观察所获得的表达。在荧光显微镜下进一步证实表达。上方的试验组，293T，放大倍数＝x100；下方的试验组，SH-SY5Y，放大倍数＝x200。
图7是显示Western印迹结果的照片，所述印迹使用了以大致相同的颗粒直径排列的FHN病毒体和F病毒体。
图8用照片显示出观察感染细胞(表达GFP的细胞)所得的结果。以MOI＝10在HeLa细胞的培养物上清液中加入与灭活的仙台病毒(SeV)，FHN病毒体和F病毒体融合的SIV(分别对应于图中的SIV-SeV融合物，SIV-FHN病毒体融合物和SIV-F病毒体融合物)。将混合物保温10，30和180分钟以进行感染，然后用新鲜培养基更换培养基。感染48小时后观察细胞。所用SIV已被VSV-G假型化。图中的SIV指的是未与仙台病毒包膜融合的阴性对照。
图9以照片显示了电泳FHN病毒体，F病毒体和HN病毒体样品，接着进行银染所得的结果。泳道1，SeV(完整的)；泳道2，用DTT-处理的SeV；泳道3，用胰蛋白酶-处理的SeV；泳道4，FHN病毒体；泳道5，F病毒体；泳道6，HN病毒体。
图10图示了LacZ相对活性试验的结果。将表达LacZ的SIV载体(被VSV-G假型化)和同样的但进一步与病毒体融合的SIV载体导入293T细胞。星号表示对SIV而言，在t-检验中有显著差异(p＜0.05)。
图11显示了鼻内施用100μl SIV-F/HN/M-EGFP 108T.U.，3天后的气管冷冻切片照片。(b)中的箭头表示气管上皮细胞，其中可检测到EGFP的荧光，而在(c)中显示的未经处理的小鼠样品中仅观察到低水平的背景信号。试验组(a)显示了连续切片的苏木精-伊红(H.E.)染色模式。
图12中的照片(b)显示了与图11中相同的个体的鼻中隔粘膜的观察结果。箭头表示表现出EGFP荧光的假复层纤毛上皮。(a)显示了经H.E.染色的连续切片照片。
图13以照片显示出由小鼠鼻腔切片中的假型逆转录病毒载体发出的EGFP荧光强度的比较。图中显示出被VSV-G假型化的SIV(SIV-VSV-EGFP)，含有兼嗜性env、被F，HN和M假型化的MSCV(MSCV-F/HN/M-EGFP)以及被F，HN和M假型化的VSV-G SIV(SIV-F/HN/M-EGFP)的EGFP荧光图像。在含有F，HN和M蛋白的MSCV-F/HN/M-EGF和SIV-F/HN/M-EGFP中检测到相对较强的信号；SIV-F/HN/M-EGFP中的信号尤其高。
图14显示了在由具有胞质结构域取代的HN表达质粒编码的蛋白质中，SIV胞质结构域和HN蛋白跨膜结构域(标准字体)之间的边界处的氨基酸序列(SEQ ID NO40)。
图15显示了在由添加有SIV胞质结构域的HN表达质粒编码的蛋白质中，胞质结构域(下划线)和HN蛋白跨膜结构域(标准字体)之间的边界处的氨基酸序列(SEQ ID NO41)。
图16显示了在由缺失了胞质结构域的F表达质粒编码的蛋白质中，F蛋白跨膜结构域(斜体)和F蛋白胞质结构域(标准字体)之间的边界处的氨基酸序列(SEQ ID NO42至44)。
图17显示了在由其中的F胞质结构域已被SIV胞质结构域取代的F表达质粒所编码的蛋白质中，F蛋白跨膜结构域(未下划线的斜体)，F蛋白胞质结构域(标准字体)和SIV胞质结构域的11个氨基酸(SIVc11)(下划线)之间的边界处的氨基酸序列(SEQ ID NO45至47)。
图18显示了经由SeVF/HN假型SIV载体将基因转移至293T细胞的照片。
图19显示了经由SeVF/HN假型SIV载体将基因转移至BEAS-2B细胞的照片。
图20显示了经由添加有SIVc11的SeVF/HN假型SIV载体将基因转移至293T细胞的照片。
图21为显示了富集的SeVF/HN假型SIV载体的照片。
图22显示了经由基于MSCV的SeVF/HN假型逆转录病毒载体的基因转移的照片。
图23显示了经由被流感病毒包膜假型化的病毒载体的基因转移的照片。
图24显示了富集的被流感病毒包膜假型化的病毒载体的照片。
图25显示了经由被流感病毒包膜和多种HN蛋白假型化的病毒载体的基因转移的照片。
实施发明的最佳模式以下将使用实施例具体描述本发明；然而，本发明并不局限于此。本文提及的所有出版物都全文列入本文作为参考。
制备被仙台病毒包膜蛋白假型化的逆转录病毒载体通过消化仙台病毒Z毒株pSeV18+b(+)(Hasan，M.K等，1997，J.GeneralVirology 782813-2820)的全长基因组DNA，获得F，HN和M蛋白的基因，将它们插入pCAGGS(Niwa，H等，Gene108，193-9，1991)的XhoI位点，制备出仙台病毒F，HN和M蛋白的表达载体(分别称为pCAGGS F，pCAGGSHN和pCAGGS M)。
在含有10％的灭活胎牛血清的D-MEM(GibcoBRL)中培养可用于产生逆转录病毒的人胚肾细胞系293T细胞(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.90，pp.8392-8396，1993)。在塑料板(Sumitomo Bakelite)上进行培养。根据厂商提供的说明书，使用LIPOFECTAMINE PLUS(GibcoBRL)进行载体转染。以1×106个细胞/孔的细胞密度将293T细胞铺于6-孔塑料板(Sumitomo Bakelite)，于37℃在含10％CO2气体的CO2温箱中保温48小时。在转染前30分钟，用800μl/孔含1％牛血清白蛋白(GibcoBRL)的D-MEM(GibcoBRL)更换培养基，然后继续培养。
所用基因转移载体是含有EGFP基因作为报道基因的基于鼠干细胞病毒的载体(MSCV)(CLONTECH)(R.G.Hawley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9310297-10302(1996)；R.G.Hawley等，Gene Thrapy 1136-138(1994))。转染所用DNA的量如下700ng/孔基因转移载体和300ng/孔包装载体(pCL-Eco，pCL-Ampho(MuMLV4070A)(皆购自IMGENEX)(Naviaux，R.K等，J.Virol.705701-5705(1996))；将这些载体与200ng/孔仙台病毒包膜蛋白表达载体(pCAGGS F和pCAGGS HN)以及200ng/孔仙台病毒M蛋白表达载体(pCAGGS M)联合使用(表2)。将DNA溶解于100μl OptiMEM，然后在其中加入6μl PLUS试剂(GibcoBRL)。搅拌混合物，室温下放置15分钟。用100μl OptiMEM稀释4μl LIPOFECTAMINE，然后加入至DNA和PLUS试剂(GibcoBRL)的混合物中。搅拌所得混合物，室温下放置15分钟。在6-孔板内经保温的293T细胞中滴加通过上述方法制备的，含有DNA和LIPOFECTAMINE的复合物的溶液。缓慢搅拌之后，于37℃在含10％CO2气体的CO2温箱中将混合物保温3小时。培养之后，在培养物中加入1ml/孔含有1％牛血清白蛋白(GibcoBRL)和15μg/ml胰蛋白酶(GibcoBRL)的D-MEM(GibcoBRL)。于37℃在含10％CO2气体的CO2温箱中将混合物保温24小时。然后用直径孔为0.45-μm的滤器(DISMIC-25CS滤器；ADVANTEC)过滤培养物上清液。将所得溶液用作载体溶液。
仙台病毒包膜蛋白对逆转录病毒载体假型化的作用通过上述方法制备被仙台病毒包膜蛋白假型化的逆转录病毒载体，并评估其作用。
以1×106个细胞/孔的细胞密度将用作靶的293T细胞铺于6-孔塑料板(Sumitomo Bakelite)，然后于37℃在含10％CO2气体的CO2温箱中保温48小时。加入终浓度分别为10％和8μg/ml的的灭活胎牛血清和Polybrene(Sigma)，将所得溶液覆盖于含有病毒载体的溶液上，从而将病毒载体导入靶细胞。导入载体48小时之后，室温下使用含有2％甲醛和0.2％戊二醛的PBS(Invitrogen)将靶细胞固定20分钟，然后用PBS(Invitrogen)清洗一次。接着，在荧光倒置显微镜(DMIRB(SLR)，Leica)下观察细胞以检测靶细胞中的EGFP表达。
首先，在缺乏包装载体时，将F蛋白表达质粒(pCAGGS F)和HN蛋白表达质粒(pCAGGS HN)中的任一种或两种(这两种蛋白质皆为仙台病毒包膜蛋白)与基于逆转录病毒的基因转移载体(pMSCV EGFP)共同导入293T细胞。收集培养物上清液，检测EGFP基因或EGFP蛋白是否导入作为靶细胞的293T细胞。图1显示了用通过以多种组合使用表2下半部分自“((1))”起的12种env制备的载体感染293T细胞所获得的结果。如图1中的试验组“Null”所示，在缺乏包装载体时，基因或蛋白质都未被转移，甚至当F蛋白和HN蛋白在人细胞中表达时也是如此。由此发现仅表达F蛋白和HN蛋白不足以产生能转移基因并将EGFP蛋白导入靶细胞的逆转录病毒载体。
如图1中的试验组“Eco”所示，当使用对人细胞不具有感染性的亲嗜性包膜蛋白进行包装时，仅被F蛋白或HN蛋白假型化的载体不能对人细胞进行基因转移。另一方面，被共表达的F蛋白和HN蛋白假型化的载体可将基因转移至人细胞，而原始病毒对这些细胞无感染性。结果表明衍生自除仙台病毒以外的病毒的载体可被仙台病毒F蛋白和HN蛋白假型化，因此，拓宽了除仙台病毒以外的载体所感染的宿主范围。
如图1中的试验组“Ampho”所示，当使用对人细胞具有感染性的兼嗜性包膜蛋白进行包装时，通过仅表达HN蛋白，或者通过共表达F蛋白和HN蛋白而被假型化的载体能改善基因转移的效率。结果表明仅用仙台病毒HN蛋白即可使衍生自除仙台病毒以外的病毒的载体假型化，通过仅用仙台病毒HN蛋白，或使用仙台病毒F蛋白和HN蛋白使载体假型化，可以改善由衍生自除仙台病毒以外的病毒的载体介导的基因转移的效率。
另外，由于典型的仙台病毒对含有粘液的细胞，如肺支气管粘膜上皮细胞具有高感染性，可以使用仅被HN蛋白，或被F蛋白和HN蛋白假型化的其它载体将基因转移至含有粘液的细胞。
产生HN-Ampho假型逆转录病毒载体，并比较假型病毒载体和兼嗜性逆转录病毒载体将基因转移至包括造血干细胞在内的人骨髓细胞的效率1.培养293T细胞根据常规方法，在含有10％FCS和800μg/mlG418的Dulbecco改进型Eagle培养基(DMEM)中培养293T细胞。使用10-cm板，在转染前一天将细胞稀释至8×106个细胞/板，然后在含有10％FCS的DMEM中培养。
2.转染将5.6μg pMSCV EGFP，2.4μg pCl-Ampho(IMGENEX)和1.6μgpCAGGS-HN混合在一起。再将Lipofectamine Plus试剂盒(GIBCOBRL)中的48μl Plus溶液加入混合物中，将所得混合物静置15分钟。在独立的试管中，将800μl OPTIMEM和32μl Lipofectamine溶液混合在一起。混合DNA混合物和Lipofectamine混合物，静置15分钟。除去培养基，将转染混合物全部滴加在处于500μl含1％BSA的DMEM中的293T细胞中。于37℃在5％CO2气氛中保温细胞。使用5.6μg pMSCV EGFP和4.0μg pCl-Ampho进行对照转染实验。转染后3小时，用10ml含有10％FCS的Iscove改进的DMEM(IMDM)替换培养基。第二天，再用含有10％FCS的IMDM替换培养基，继续培养24小时。
3.收集病毒溶液转染后48小时收集细胞培养物上清液。用0.45-μm滤器过滤上清液，然后储存于-80℃。
4.检测血凝素活性按照与上述相同的方法，以不同的pMSCV EGFP，pCl-Ampho和pCAGGS-HN比率制备被HN假型化的，具有兼嗜性env的逆转录病毒。检测病毒的血凝素活性(红细胞凝集活性；HA活性)。作为对照，还检测了具有兼嗜性env的逆转录病毒的血凝素活性。根据常规方法进行HA活性试验。结果表明被HN和兼嗜性env假型化的逆转录病毒具有HA活性，且病毒颗粒含有表现出血凝素活性的蛋白质(图2)。
5.将基因转移至人骨髓CD34+细胞人骨髓CD34+细胞购自BIO WHITTAKER。融化之后，于37℃在5％CO2气氛中，将细胞和第3节中收集的1×105/ml重组病毒一起，在含有50ng/mlIL-6，100ng/ml TPO，100ng/ml干细胞因子(GIBCO BRL)，100ng/ml Flt-3配体(Research Diagnostics，Flanders，NJ)(以上皆为人重组蛋白质)和10％FCS的IMDM中培养过夜。开始培养之后48，51，72和75小时，用新鲜解冻的病毒溶液替换培养基，在细胞中加入50ng/ml IL-6，100ng/ml TPO，100ng/ml干细胞因子和100ng/ml Flt-3配体。在开始培养后120小时收集细胞。
6.通过流式细胞术进行分析用PE标记的抗-人CD34抗体(Becton Dickinson)染色收集的细胞，然后使用两种荧光探针GFP和PE通过流式细胞术(EPICS ELITE，Coulter)进行分析。结果，在被含有野生型包膜的兼嗜性逆转录病毒载体(ampho)感染的CD34-细胞和CD34+细胞中，GFP阳性细胞的比率分别仅为0.3％和3.6％。然而，在被含有假型包膜的HN-兼嗜性逆转录病毒载体(HN-ampho)感染的CD34-细胞和CD34+细胞中，GFP阳性细胞的比率分别为33％和25％，由此发现用HN蛋白假型化能显著增加将基因转移至包括造血干细胞在内的人骨髓细胞的效率(图3)。
制备假型病毒载体的方法使用上述pMSCV EGFP或在得自Moloney鼠肉瘤病毒的LTR的控制之下表达lacZ的pLZRNL(Yee，J.-K等，Methods In Cell Biology，vol.43，pp.99-112(1994)；Xu，L等，Virology 171，331-341(1989))作为基因转移载体，制备被多种包膜蛋白假型化的逆转录病毒载体。
于37℃，10％CO2气氛中，在含有10％的灭活型胎牛血清(BIOWHITTAKER)的Dulbecco改进型Eagle培养基(DMEM)-高葡萄糖(GibcoBRL)中培养293T细胞(人胎肾细胞系)。以5×105个细胞/孔的细胞密度将293T细胞铺于6-孔塑料培养板，然后于37℃，10％CO2气氛中保温48小时。用800μl/孔含有1％牛血清白蛋白的DMEM更换培养基。然后将细胞用于转染。在下表2所示的组合中，在每孔的100μl Opti MEM中溶解700ng基因转移载体(pMSCV EGFP或pLZRNL)，100ng VSV-G表达质粒pVSV-G(衍生自印第安纳血清型毒株)(Clontech)，仙台病毒HN、F和M蛋白表达质粒pCAGGS-HN，pCAGGS-F和pCAGGS-M各200ng，以及小鼠逆转录病毒包被蛋白表达质粒pCL-Eco和pCL-Ampho各300ng(Imgenex)(Naviaux，R.K等，J.Virol.705701-5705(1996))。然后，在孔中加入6μl PLUS试剂(Gibco BRL)。搅拌混合物，然后在室温下静置15分钟。在混合物中加入用100μl Opti MEM稀释4μl LIPOFECTAMINE试剂(GibcoBRL)所获得的溶液。搅拌混合溶液，然后在室温下再静置15分钟。边缓慢搅拌边将所得混合物滴加至上文制备的293T细胞中。然后于37℃，10％CO2气氛中将细胞保温3小时。在每孔中加入1ml含有1％牛血清白蛋白和15μg/ml胰蛋白酶(Gibco BRL)的DMEM。于37℃，10％CO2气氛中将细胞保温48小时，然后收集培养物上清液，用0.45-μm孔径的滤器过滤，将所得溶液用作载体溶液。
表2

(该表中“Env”栏中所示的是得自用于生产病毒的逆转录病毒(Retro)，仙台病毒(SeV)和水泡性口炎病毒(VSV)的包膜蛋白。所用基因转移载体是pMSCV EGFP或pLZRNL，如该表中所示，它们可用于体外和体内基因转移。在图13的实验中使用的是表上方的(9)所示的，使用pMSCVEGFP作为基因转移载体制备的载体。图1实验中使用的是表下方(1)至(12)所示的，使用pLZRNL制备的12种载体。)[实施例5]构建VSV-G假型慢病毒载体使用非洲绿猴免疫缺陷病毒的非致病性克隆SIVagm TYO-1毒株构建载体。在下文中，将病毒RNA的转录起始位点定为+1以对核苷酸进行编号。用于插入SIVagm TYO-1的质粒是pSA212(J.Viol.，vol.64，pp.307-312，1990)。根据所附说明书，使用Ligation High(Toyobo)进行每一个连接反应。合成所用的所有合成寡核苷酸，并用Department of Custom DNA Synthesis，Greiner Japan，在Biochemical Research Division of the Nippon Flour Mills Co.，Ltd.的反相柱或反相HPLC进行纯化。合成的寡核苷酸的序列如下1F(VTRF-BglII)5’-GCAGATCTCAACCAGGAGGCGAGGCTGCATTTTGGG-3’(SEQID NO1)1R(VTRR-EcoRI)5’-GCGAATTCTACTTACTGGTGCTGTAAAGGAGCCAAA-3’(SEQID NO2)2F(RRE6964E)5’-ATCGGAATTCTTTTATTGTAAGATGGATTGGTTTTTAAAT-3’(SEQ ID NO3)2R(RRE-SA+BN)5’-CGGGATCCGCGGCCGCGGATATGGATCTGTGGAGATAGAGGAACATAT-3’(SEQ ID NO4)3F(SDFXhoSpe)5’-TCGAGACTAGTGACTTGGTGAGTAGGCTT-3’(SEQ ID NO5)3R(SDR-Sal)5’-TCGAAAGCCTACTCACCAAGTCACTACTC-3’(SEQ ID NO6)4F5’-AATTTCTCGAGCGGCCGCA-3’(SEQ ID NO7)4R5’-AATTTGCGGCCGCTCGAGA-3’(SEQ ID NO8)5-1F(5LTRU3FKpn)5’-GCGGTACCTGGATGGGATTTATTACTCCGATAGGA-3’(SEQ IDNO9)5-1R(GAGR-2Eco)5’-GCGAATTCGATAGGGCTTGAAACATGGGTACTATTTCTGC-3’(SEQ ID NO10)5-2F(RREF-EcoRI)5’-GCGAATTCCCGTTTGTGCTAGGGTTCTTAGGCTTCT-3’(SEQID NO11)
5-2R(RRESA+Rsac)5’-TCCCCGCGGATATGGATCTGTGGAGATAGAGGAACATATC-3’(SEQ ID NO12)5-3F(3LTRF BS)5’-GCGCGGCCGCGGATCCGTCGACGCACTTTTTAAAAGAAAAGGGA-3’(SEQ ID NO13)5-3R(3LTRR-SacI)5’-GCGAGCTCTAATGCAGGCAAGTTTATTAGCTTTCTA-3’(SEQID NO14)6F(CMVFEcoSac)5’-GGAATTCCCGCGGTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGG-3’(SEQ ID NO15)6R(EGFPRstoNB)5’-CGGGATCCGCGGCCGCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3’(SEQ ID NO16)9-1F(LTRF1 CMVU3F)5’-TATATAAGCAGAGCTCGCTGGCTTGTAACTCAGTCTCTTA-3’(SEQ ID NO17)9-2F(LTRF2 EF1aU3F)5’-TATATAAGTGCAGTACGCTGGCTTGTAACTCAGTCTCTTA-3’(SEQ ID NO18)9-3F(CAGU3F)5’-TATAAAAAGCGAAGCCGCTGGCTTGTAACTCAGTCTCTTA-3’(SEQ ID NO19)9R(GAGR-2Eco)5’-GCGAATTCGATAGGGCTTGAAACATGGGTACTATTTCTGC-3’(SEQ ID NO20)10-1F5’-CGGGGTACCTCAATATTGGCCATTAGCCATATTATTCATT-3’(SEQ ID NO21)10-1R(U3CMVR)5’-AGTTACAAGCCAGCGAGCTCTGCTTATATAGACCTCCCAC-3’(SEQ ID NO22)11F(LTRF LdU3FSalSC)
5’-ATGCGAGCTCGTCGACGCACTTTTTAAAAGAAAAGGGAGGACTGGATGGGATTTATTACTCCGATAGGACGCTGGCTTGTAACTCAGTCTCTTACTAGG-3’(SEQ ID NO23)11R(3LTRR-SacI)5’-GCGAGCTCTAATGCAGGCAAGTTTATTAGCTTTCTA-3’(SEQID NO24)<通过PCR制备DNA片段>
使用PCR Supermix High Fidelity(Gibco BRL)进行所有PCR实验。在90μl含有lμg模板DNA的反应溶液中加入终浓度为1nmol/ml的一对合成寡核苷酸以用作引物，然后用蒸馏水将总体积调节为100μl。在GeneAmpPCR System 9600(Perkin Elmer)中进行反应。所用PCR方案如下94℃预保温1分钟，再于94℃变性30秒，55℃退火30秒和68℃延伸90秒，共进行10个循环，接着于68℃保温5分钟。反应之后，使用Wizard DNA Clean-upSystem(Promega)纯化样品，用适当限制性酶处理PCR产物的两端，在1％低熔点琼脂糖凝胶(SeaPlaque GTG琼脂糖，FMC Biochem；溶解于TAE缓冲液中)分级分离。从凝胶中切下所需的DNA片段，用Wizard PCR PrepsDNA Purification System(Promega)进行纯化。将纯化的DNA用于连接反应。
<构建载体>
构建提供载体骨架结构的质粒(图4)。即这些质粒是提供反式形成载体颗粒所必需的蛋白质的“包装载体”，提供被包装成载体的mRNA和将所需基因传递至和导入靶细胞的“基因转移载体”，和提供参与假型载体颗粒形成的包被蛋白的载体。
构建gag，pol，tat，rev，vif或vpr/x各序列位于启动子下游的表达质粒以提供形成载体颗粒所需的蛋白质。除去包装信号Ψ的绝大部分和env以避免产生野生型的病毒颗粒。将SD序列插入gag上游，将RRE序列插入tat/rev第一个外显子的下游，以在包装载体中表达所有基因。另外，需排除整个nef序列，因为据推测该序列对载体包装而言是不必要的(图4b)。
将基因组两端的LTR序列，SD，Ψ和RRE插入提供被包装成载体的RNA的基因转移载体。另外，用外源启动子取代基因转移载体中的5’LTR启动子区域。另外，制备自失活载体(SIN载体)，其中除去了部分3’LTR序列以防止在靶细胞中转录全长载体mRNA；该载体含有以下插入物作为报道基因的β-半乳糖苷酶基因和用于表达报道基因的CMV启动子(图4c)。
在使逆转录病毒载体和HIV载体假型化时，用于提供VSV-G的载体是经本领域检验的pVSV-G(图4d)(Bums，J.C.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA908033-8037)。
下文提供了更具体的描述。
<构建包装载体>
使用一对引物1F和1R，以pSA212为模板，通过PCR制备对应于含有vif和tat/rev的第一个外显子的区域(5337至5770)的DNA片段。在一个PCR引物中添加了限制性酶EcoRI的位点，因此所制备的DNA片段在其3’末端含有EcoRI位点。用BglII和EcoRI消化PCR片段，使用琼脂糖凝胶电泳和Wizard PCR Preps DNA Purification System(Promega)进行纯化。将按上述制备的DNA片段和另一个编码gag/pol区域的DNA片段(自XhoI位点(356)至BglII位点(5338))连接至pBluescript KS+(Stratagene)的XhoI和EcoRI位点之间。然后，通过PCR扩增Rev效应元件(RRE)和对应于含有tat/rev的第二个外显子(6964至7993)之区域的DNA片段。通过与用于制备上述PCR片段相同的方法，使用一对引物2F和2R，以pSA212为模板，经PCR在3’末端添加NotI位点。用EcoRI和NotI双消化所得PCR片段，接着进行纯化。将片段插入含有gag-tat/rev的pBluescript KS+的EcoRI和NotI位点之间。
在上述含有gag-RRE-tat/rev的pBluescript KS+的XhoI位点插入含有剪接供体(SD)位点序列的DNA片段(3F和3R)，所述片段经合成在5’和3’末端分别具有XhoI位点和SalI位点。用XhoI和NotI消化所得质粒。纯化含有SD-gag-RRE-tat/rev的片段。通过将XhoI/NotI接头(4F和4R)插入pCAGGS(Gene，vol.108，pp.193-200，1991)的EcoRI位点以制备质粒，然后将上述SD-gag-RRE-tat/rev片段插入XhoI-NotI位点。将通过上述方法获得的质粒用作包装载体pCAGGS/SIVagm gag-tat/rev。
<构建基因转移载体>
使用pSA212为模板，使用一对引物5-1F和5-1R进行PCR以扩增得自SIVagm TYO1的5’LTR区域(8547至9053+1至982；在5’和3’末端分别含有KpnI位点和EcoRI位点)；使用一对引物5-3F和5-3R进行PCR以扩增3’LTR区域(8521至9170；5’末端含有NotI和BamHI位点，3’末端含有SacI位点)；使用一对引物5-2F和5-2R进行PCR以扩增RRE序列(7380至7993；在5’和3’末端分别含有EcoRI和SacII位点)。使用一对引物6F和6R扩增得自pEGFPN2(Clontech)的CMV启动子区域(1至600；在5’和3’末端分别含有SacII和NotI位点。在其末端消化DNA片段，纯化之后，通过连接将5’LTR，RRE，CMV启动子和3’LTR按此顺序插入pBluescript KS+的KpnI-SacI位点。将得自pCMV(Clontech)，含有β-半乳糖苷酶基因的NotI片段作为报道基因插入NotI位点。用KpnI和SacI消化所得质粒，获得含有自5’LTR至3’LTR的区域的DNA片段。将片段插入对照载体pGL3的KpnI-SacI位点。将所得质粒用作基因转移载体pGL3C/5′LTR.U3G2/RREc/s/CMVF β-gal/WT3’LTR。
此外，使用一对引物6F和6R，以pEGFPC2为模板，经PCR扩增得自pEGFPC2(Clontech)的CMV启动子区域和编码EGFP的区域(1至1330；在5’末端含有SacII位点，在3’末端含有NotI，BamHI位点以及翻译终止密码子)。分别用限制性酶KpnI和EcoRI，EcoRI和SacII，BamHI和SacI以及SacII和BamHI消化4种类型的PCR片段。纯化之后，通过连接将5’LTR，RRE，CMV启动子EGFP和3’LTR片段按此顺序插入pBluescriptKS+的 KpnI和SacI(pBS/5’LTR.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/WT3’LTR)。用KpnI和SacI消化质粒pBS/5’LTR.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/WT3’LTR以制备含有自5’LTR至3’LTR的区域的DNA片段。将片段插入对照载体pGL3(Promega)的KpnI-SacI位点以构建载体(pGL3C/5’LTR.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/WT3’LTR)。
<修饰5’LTR>
使用引物9-1F，2F，3F和9R，以pSA212为模板，经PCR扩增含有5’LTR的TATA盒下游的gag区域(9039至9170+1至982)的片段。使用一对引物10-1F和10-1R，经PCR扩增巨细胞病毒的CMVL启动子(得自pCI(Promega)；核苷酸1至721)。将含有5’LTR的TATA盒下游区域的片段与含有启动子的片段混合。使用混合物为模板，使用位于启动子5’方向的引物(10-1F)和位于5’LTR3’方向的另一个引物(9R)，经PCR制备含有启动子和5’LTR的嵌合启动子的DNA片段。将所得DNA片段插入基因转移载体(pGL3C/5’LTR.U3G2/RREc/s/CMV β-gal/WT3’LTR)的KpnI-EcoRI位点以制备pGL3C/CMVLU3G2/RREc/s/CMV β-gal/WT3’LTR。类似地，也将通过上述PCR实验获得的DNA片段插入载体pGL3C/5’LTR.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/WT3’LTR 的 KpnI-EcoRI位点以制备pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/WT3’LTR。
<制备3’LTR-修饰的SIN载体(自我失活载体)>
使用一对引物11F和11R，以pSA212为模板，经PCR扩增含有3’LTRU3区域的5’末端27bp，3’末端15bp及其R区域的DNA片段。将该片段插入上一节中制备的含有嵌合启动子的基因转移载体pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVβ-gal/WT3’LTR的SalI-SacI位点，制备出pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVβ-gal/3’LTRΔU3。类似地，将该片段插入pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/WT3’LTR的SalI-SacI位点，制备出pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/3LTRΔU3。
<制备构建的质粒并证实结构>
通过常规方法将质粒转化至DH5α(Toyobo)，并在琼脂平板中保温。使用长出的菌落作为模板，并使用能识别插入DNA片段以及对应于质粒插入位点的部分的DNA序列的引物进行PCR。使用PLATINUM PCRSupermix(Gibco BRL)进行PCR。通过琼脂糖凝胶电泳进一步证实扩增产物的存在和大小，以选择出含有所需插入物的克隆。在10ml LB培养基中培养每个克隆，然后用QIAprep miniprep试剂盒(QIAGEN)纯化质粒。用限制性酶处理质粒以消化插入DNA片段的两端，并在琼脂糖凝胶中电泳以证实DNA片段的大小。在100ml LB培养基中培养经证实其质粒含有预期大小的插入片段的克隆。用QIAGEN Plasmid Maxi试剂盒(QIAGEN)纯化质粒。从3个或更多个克隆中纯化其中已插入PCR扩增片段的质粒，对其进行测序，将测定的序列与pSA212的序列进行比较以选择出不含突变的克隆。
<收集载体>
以5×105个细胞/孔的细胞密度将293T细胞铺于6-孔塑料培养板，于37℃在10％CO2气氛中保温48小时。转染前，用800μl/孔Opti MEM更换培养基。将300ng上述基因转移载体，600ng上述包装载体和100ng VSV-G表达质粒pVSV-G(Clontech)溶解于每孔中的100μl Opti MEM之后，在其中加入6μl PLUS试剂(Gibco BRL)。搅拌混合物，室温静置15分钟。在混合物中加入100μl含有4μl LIPOFECTAMINE试剂(Gibco BRL)的OptiMEM。搅拌所得混合物，室温静置15分钟。将混合物滴加至上述293T细胞。缓慢搅拌经处理的细胞，于37℃在10％CO2气氛中保温3小时。在每孔中加入1ml含有20％灭活的牛血清的D-MEM，于37℃在10％CO2气氛中将培养板保温12小时。用2ml/孔含有10％灭活的牛血清的D-MEM更换培养基之后，将培养板保温24小时。然后收集培养物上清液，用孔径为0.45-μm的滤器进行过滤。将经过滤的上清液用于随后的实验中。
<SIVagm载体-介导的基因转移>
以5×105个细胞/孔的细胞密度将293T细胞铺于6-孔塑料培养板，于37℃在10％CO2气氛中保温48小时。除去培养基，在细胞上覆盖1ml含有载体溶液的溶液，所述载体溶液中已加入终浓度为8μg/ml的polybrane(Sigma)。于37℃在10％CO2气氛中将细胞保温3小时已完成载体转染。3小时后，在细胞中加入1ml培养基，第二天，更换培养基。一天后，当所用载体是β-Gal表达载体时，用β-Gal染色试剂盒(Invitrogen)使用X-gal作为底物进行染色，并在光学显微镜下观察靶细胞中β-半乳糖苷酶的表达。然而，当所用载体是EGFP表达载体时，需在荧光显微镜下分析表达。
<载体滴定>
通过计算使用1ml载体溶液产生的含导入基因的细胞数目来进行载体滴定。以1×106个细胞/板的细胞密度将293T细胞铺于6-孔塑料培养板，保温48小时。通过与上述相同的方法，用1ml载体溶液对细胞进行感染。感染48小时后，进行X-gal染色。在放大倍数为200的光学显微镜下，从3个不同的视野测定一个视野中含有转移基因的细胞数目的平均值，再乘以根据视野面积和培养板面积测定的系数854.865，从而测出滴度。滴度的单位被定义为转导单位(T.U.)/ml。另外，使用SIV核心抗原EIA试剂盒(Coulter)定量载体溶液中的p27蛋白。
<评价载体>
据推测基因转移载体中5’启动子活性的增强可导致RNA转录水平的增加，并可改善包装效率，从而增加载体滴度。因此，基于基因转移至293T细胞的效率来评价5’启动子已被取代的载体。通过与上述相同的方法进行基因转移，通过X-gal染色，接着在光学显微镜下进行观察，用肉眼观察β-半乳糖苷酶的表达。
基于3’LTR启动子已缺失的SIN基因转移载体制备SIN SIV载体。基于含有原始野生型3’LTR的基因转移载体制备SIV载体。比较这两种载体转移至293T细胞的效率。测定p27蛋白的量以比较参照蛋白质的量而标准化的转移效率。另外，通过在荧光显微镜下观察进一步证实EGFP基因是否转移至经照射后细胞周期停滞的293T细胞，以及被视黄酸终止分化的SH-SY5Y细胞。
<基因转移至293T细胞所获得的结果>
使用SIVagm载体将β-半乳糖苷酶基因导入人胎肾293T细胞。使用X-gal作为底物染色含有转移基因的细胞。如图5所示，检测到被染成蓝色的细胞，这表明细胞中表达了β-半乳糖苷酶基因。根据实验结果，用1ml载体溶液获得的基因转移效率为0.5至1×106T.U.。载体溶液中p27的量为0.5至1μg/ml，每100ngp27的转移效率为105T.U.。
<评价SIN载体的性能>
将SIN载体的转移效率与在相同条件下制备的含有野生型3’LTR的常规载体的转移效率进行比较。常规载体的滴度是2.4至2.8 T.U./ml，SIN载体的滴度是2.5至2.9T.U./ml；因此，如果将常规载体的转移效率当成100％，SIN载体的转移效率就是105％。另外，通过测定对293T细胞的转移效率并通过EIA检测p27的量，可以测定转移效率和p27的量之间的关系；SIN载体的效率是7×105T.U./100ngp27。
通过SIN载体将EGFP基因转移至细胞周期停滞的293T细胞和终止分化的SH-SY5Y细胞。于37℃在10％CO2气氛中，在含有10％FCS的DMEM中培养293T细胞。通过加入终浓度为20μg/ml的蚜肠霉素(Calbiochem-Novabiochem Intemational，Inc.)将细胞周期停滞在G1-S期(Huberman，J.A等，CellVol.23，647-648.1981；Byrnes，J.J.，Mol.Cell.Biochem.Apr，62(1)，13-24.1984)。通过用4000拉德X-射线照射2×107个细胞使细胞周期停滞在G2-M期(Kastan，M.B等，CellNov 13，71(4)587-97.1992)。在细胞停滞处理24小时之后，以1×106/孔的细胞密度将细胞铺于包被有I型胶原的6-孔培养板(SUMILON)。24小时之后进行基因转移。或者，于37℃在5％CO2气氛中，在含有10％的灭活胎牛血清的RPMI1640中培养人成神经细胞系SH-SY5Y(Koshizawa，S.H等，Cancer Lett.Jan 1，111(1-2)，117-25.1997)，在培养基中加入终浓度为5μM的全反视黄酸(SIGMA)。将细胞保温7天，然后进行基因转移(Odelstad，L等，Brain Res.Nov 9，224(1)，69-82.1981)。
图6上方的试验组显示了用荧光显微镜观察到的293T细胞中的EGFP表达模式。可证实高效基因表达。图6下方的试验组显示了SH-SY5Y中的EGFP表达。在具有似乎已分化成神经元的轴突的细胞中发现EGFP表达。
经证实本实施例中制备的SIVagm载体可介导基因高效转移至培养细胞。假定共转染3种独立的质粒之后，在载体包装过程中重建野生型病毒颗粒的可能性很低。另外，在天然和实验感染中已证实用作载体基础的SIVagm TYO-1自身不表现出致病性(Ohta，Y等，Int.J.Cancer41，115-22，1988；Miura，T等，J.Med.Primatol.18(3-4)，255-9.1989；Honjo，S等，J.Med.Primatol.19(1)，9-20，1990)。另外，载体是非常安全的，因为一般说来，慢病毒具有很高的物种-特异性，它对除其原始靶物种以外的动物物种仅具有微弱的致病性(Novembre，F.J等，J.Virol.71(5)，4086-91.1997)。
在本实施例中，已从包装载体构建体中除去包装信号序列，因此未将编码病毒蛋白质的RNA包装成颗粒。Rev蛋白与RRE的结合导致RNA转移至胞质并抑制剪接，从而导致病毒蛋白质表达，并将全长RNA包装成病毒颗粒。因此，包装载体和基因转移载体中插入的RRE可调节包装载体的mRNA剪接，从而使所有基因都能表达。然后，可将基因转移载体的mRNA转移至胞质，并包装成载体颗粒。当从HIV-1载体中除去vif，vpr/x时有一些例子(Dull，T等，J.Virol.Nov，72(11)，8463-71.1998)，这表明蛋白质有可能不是包装载体颗粒和使其发挥作用所必需的。据信vpr是负责对非分裂细胞的感染性的因子(Heinzinger，N.K等，Proc.Natl.Acad.Sci.USAJul 19，91(15)，7311-5，1994)；有报道描述道HIV-1载体可将基因转移至其中的细胞类型根据vpr的存在与否而有所不同(Kim，V.N等，J.Virol.Jan，72(1)，811-6.1998)。另据报道根据对猴的感染实验所获得的证据，在本文所述的实施例中从包装载体中完全去除的nef可能是SIV-介导的免疫缺损的病原蛋白质(von Gegerfelt，A.S等，J.Virol.73，6159-65，1999；Kestler，H.W.3d.，Naidu，Y.N.，Kodama，T.，King，N.W.，Daniel，M.D.，Li，Y.，Desrosiers，R.C.Use of infectious molecular clones of simian immunodeficiency virus forpathogenesis studies.，J.Med.Primatol.18(3-4)305-9，1989)。已从本实施例构建的SIVagm载体中完全去除相应的序列；因此，即使形成含有得自包装载体的病毒基因的重建病毒颗粒，也可进一步降低所述颗粒的致病性风险。
基于慢病毒的载体可将基因转移至细胞周期停滞的培养细胞和神经元，因为原始的慢病毒对非分裂细胞具有感染性(Naldini，L等，Science272263-267，1996；Sutton，R.E等，J.Virol.，73(5)，3649-60，1999)。当这种载体与原始SIV不同，已被VSV-G假型化时，载体的感染性不局限于感染CD4-和趋化因子受体-阳性细胞。已知VSV-G的受体是磷脂酰丝氨酸，它是磷脂的一种，其分子存在于多种细胞的表面(Schlegel，R等，Cell，32(2)，639-46，1983)。因此，被VSV-G假型化的SIVagm载体具有相当宽的感染范围。据推测当基于此载体制备被具有血凝素活性的膜蛋白假型化的病毒时，它们能将基因高效转移至几乎所有类型的动物细胞。
制备病毒体将野生型SeV(Z毒株)的毒种接种于受精卵(10-天的卵)，将卵置于35.3℃培养3天。然后，从卵中收集绒毛尿囊液。以4,000rpm离心15分钟，以10,000rpm将上清液离心1小时以沉淀病毒颗粒。将沉淀物重新悬浮于BSS，覆盖在含有蔗糖密度梯度(30％/50％)的溶液的上层，随后以25,000rpm离心1小时。收集以30％和50％蔗糖为边界的病毒颗粒带，然后用大量BSS进行稀释。然后，以9,000rpm离心样品1小时以沉淀病毒颗粒。将所得病毒颗粒重新悬浮于BSS中，储存于-80℃待用。
由根据参考文献(Bagai等，1993，Biochem.Biophys.Acta 1152，15-25)所述方法获得的仙台病毒制备F-HN病毒体和F病毒体。具体地，用去污剂溶解仙台病毒，然后通过离心除去不溶性的RNP。通过从已溶解F和HN蛋白和脂质(包膜脂质)的溶液中除去去污剂以重建颗粒，从而制备出F-HN病毒体。在与实施例7中所用条件相同的条件下进行制备，不同的是离心前Triton X-100的浓度是1％(v/v)。用DTT(二硫苏糖醇)预处理仙台病毒以还原HN蛋白，通过与上述相同的方法用去污剂溶解仙台病毒。通过离心除去所得的不溶性HN蛋白以及RNP。按照与上述相同的方法从溶液中除去去污剂以重建颗粒，制备出F病毒体。
所得病毒体表现出不均一的颗粒直径。因此，通过以12,000rpm离心10分钟将病毒体分成两个含有不同大小的颗粒的级分(小病毒体平均颗粒直径＝140nm；大病毒体平均颗粒直径＝1.4μm)。通过SDS-PAGE评价已分级分离的病毒体。在F-HN病毒体中检测到F蛋白和HN蛋白；在F病毒体中检测到F蛋白。由此证实已获得大致符合要求的病毒体(图7)。
在37℃的条件下，以下表所述的组合，将按上述制备的病毒体或通过UV照射灭活的仙台病毒与表达EGFP的SIV病毒融合2小时，所述SIV病毒是通过实施例7(3)所述方法制备和富集的。据报道在弱酸性pH下，VSVG和脂质体之间的融合效率较高(Yamada，S等，1986，Biochemistry,25，3703-3708)。因此，在pH5.5或中性pH下进行融合。
表3SIV SeV条件滴度 缓冲液体积 病毒缓冲液体积(TU/ml)(μl) (μl)1 1×108BSS 50 UV灭活的SeV 1×109pfu/ml BSS 502 1×108pH5.5 50 UV灭活的SeV 1×109pfu/ml pH5.5 50柠檬酸 柠檬酸3 1×108BSS 50 FHN病毒体(小) BSS 504 1×108BSS 50 FHN病毒体(大) BSS 505 1×108BSS 50 F病毒体(小) BSS 506 1×108BSS 50 F病毒体(大) BSS 50以MOI＝10将按上述制备的混合物加入HeLa细胞的培养物上清液。进行对照实验，其中SIV仅与仙台病毒一起共感染。在此实验中，首先，在培养基中加入SIV，5分钟之后，以10倍于SIV的量加入仙台病毒。在培养基中加入病毒之后，将混合物保温10，30，或180分钟以进行感染。然后，用新鲜培养基更换培养基。开始感染48小时之后，进行观察以检测GFP荧光(图8)。
根据所得结果，当仅用SIV感染HeLa细胞，且接触时间为30分钟或更短时，感染效率很低。已发现与仅用SIV相比，SIV和UV-照射的仙台病毒的融合混合物倾向于更快地进行感染。与pH5.5时相比，中性pH下的感染效率较高。这可能是中性pH对SIV的影响降低的缘故。
与F-HN病毒体的融合也可增加感染，从而显著改善感染效率。F病毒体也能有效改善感染，但与F-HN病毒体相比，改善的水平较低。当SIV仅与仙台病毒一起共感染时，感染效率仅与只使用SIV时差不多。
这些结果表明SIV与仙台病毒或F-HN病毒体的融合可增强SIV的感染性。另外，还说明仙台病毒的HN蛋白对于增强感染效率起到很大作用。
制备和评价SIV-SeV融合载体(1)制备野生型SeV将野生型SeV(Z毒株)的毒种接种于受精卵(10-天的卵)，将卵置于35.3℃培养3天。然后，从卵中收集绒毛尿囊液。以4,000rpm离心15分钟之后，以10,000rpm将上清液离心1小时以沉淀病毒颗粒。将沉淀物重新悬浮于BSS，覆盖在含有蔗糖密度梯度(30％/50％)的溶液的上层，随后以25,000rpm离心1小时。收集以30％和50％蔗糖为边界的病毒颗粒带，然后用大量BSS进行稀释。然后，以9,000rpm离心样品1小时以沉淀病毒颗粒。将所得病毒颗粒重新悬浮于BSS中，储存于-80℃待用。
(2)由SeV跨膜蛋白重建病毒体1.FHN病毒体将0.2ml 20％(V/V)Triton X-100/BSS加入1.8ml SeV(OD540＝5，BSS)，将混合物置于室温下静置1小时以溶解SeV。在实施例6中，病毒体表现出不均一的颗粒直径。因此，在离心前将Triton X-100的浓度调节为2％(v/v)。通过离心(100,000x g，4℃，1小时)沉淀不溶性的RNP，然后收集已溶解F和HN蛋白的上清液。分三步在上清液中加入Bio-bead SM-2(BIORAD)(0.5g两次，室温1小时；1g一次，4℃15小时，再加上室温下保温1小时)，以通过吸附除去去污剂，接着除去珠。因此，得到约1.5ml FHN病毒体。
2.F病毒体将0.2ml 30mM二硫苏糖醇/BSS加入2ml SeV(OD540＝5，BSS)中，于37℃将混合物保温2小时以不可逆地还原HN蛋白。用BSS稀释之后，通过离心分离病毒颗粒，并重新悬浮于1.8ml BSS。将0.2ml 20％(V/V)TritonX-100/BSS加入病毒悬浮液中，室温下静置混合物1小时以溶解SeV。然后，通过与上述相同的方法除去不溶性的RNP和还原的HN蛋白。收集已溶解F蛋白的上清液。通过与制备FHN病毒体所用相同的方法获得约1.5ml F病毒体。
3.HN病毒体将2ml 150单位/ml胰蛋白酶(Sigma)/BSS加入2ml SeV(OD540＝5，BSS)中，于37℃保温混合物2小时以消化F蛋白。然后，将1mg/ml胰蛋白酶-胰凝乳蛋白酶抑制剂(Sigma)/BSS加入反应混合物中以终止反应。用BSS稀释之后，通过离心分离病毒颗粒，并重新悬浮于1.8ml BSS。通过与制备FHN病毒体所用相同的方法获得约1.5ml F蛋白功能已经失活的HN病毒体。
下表显示了三种病毒体的特征。代表F和HN蛋白的功能的HA活性，溶血活性和电泳模式的数据显示出病毒体是必需的(图9)。
表4FHN病毒体 F病毒体 HN病毒体HA + - +溶血活性 + - -OD5400.480 0.491 0.470蛋白浓度(mg/mL) 0.960.570.78平均粒径(nm) 143.5 168.9 133.0(3)制备SIV-LacZ使用下列三种质粒制备含有LacZ基因的SIV(SIV-LacZ)。
·包装载体pCAGGS/SIVagm gag-tat/rev·基因转移载体pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/3LTRΔU3或pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVβ-gal/3LTRΔU3·VSV-G质粒pVSV-G将150μg包装载体，300μg基因转移载体和50μg VSV-G质粒溶解于75ml DMEM中。在溶液中加入2ml Plus试剂(Life Technologies Oriental，Inc.)，将所得混合物置于室温下放15分钟。在混合物中加入通过混合3mlLipofectAMINE试剂(Life Technologies Oriental，Inc.)和75ml DMEM而制备的悬浮液，将所得混合物置于室温下放15分钟以形成DNA复合物。在293T细胞(在转染前2天，在50个含有10％FCS/DMEM的平皿中，以2.5×106个细胞/150-mm平皿的细胞密度制备的)中滴加3ml DNA复合物溶液。于37℃，在10％CO2气氛中转染3小时。在细胞中加入10ml 10％FCS/DMEM，然后继续保温。48小时之后，收集培养物上清液并用孔径为0.45-μm的滤膜进行过滤。以42,500xg离心滤液1.5小时以沉淀病毒颗粒。将沉淀物集中起来，重新悬浮于15ml逆转录溶液(100μM dNTPs，3mM Spermine，0.3mMSpermidine，10mM MgCl2/TBS)。于37℃逆转录2小时。然后离心病毒(42，500xg，2小时)，将颗粒重新悬浮于500μL PBS(含有5％FCS和2μg/mLpolybrene)，获得SIV-LacZ-富集溶液。SIV-LacZ的滴度约为5×108T.U./mL(293T细胞)。
(4)制备融合载体用BSS将SIV-LacZ稀释至1×108T.U./mL。在此溶液中加入等体积的病毒体/BSS溶液。将混合物置于4℃放置30分钟以进行吸附。然后，于37℃融合2小时，用冰冷的PBS将反应溶液稀释10倍(使最终的SIV浓度为5×106T.U./mL)。立即将该SIV用于感染实验。
(5)感染实验以1×105个细胞/孔的细胞密度将1ml处于10％FCS/DMEM(下文称之为培养基)的293T细胞加入12-孔培养板的每个孔中，于37℃，10％CO2气氛中将细胞培养48小时。在转染前一刻，将培养基减至0.5ml。以5×106T.U./ml(100μl/孔)的浓度在每孔中加入由SIV和病毒体组成的融合载体，于37℃，10％CO2气氛中将混合物保温10分钟以进行感染。用培养基将孔洗涤2次，在每孔中加入2ml培养基。然后继续保温培养板。48小时之后，用PBS将细胞洗涤2次，用0.25ml细胞裂解缓冲液(PicaGene LC-β；Toyo Ink)裂解细胞。以12,000rpm将细胞裂解液离心3分钟，适当稀释上清液。使用Galacto-Light PlusTM(TROPIX，Inc.)测定LacZ基因的表达水平。数据被表示为每1μg得自细胞的蛋白质的相对LacZ活性(RLU/μg蛋白质)，从一式三份的实验测定结果中获得以平均值±标准误差形式表示的数据。
与仅用SIV相比，用FHN-病毒体融合物所获得的LacZ表达水平显著更高(p＜0.05)。与FHN-病毒体不同，F-病毒体不会导致基因表达水平提高。HN-病毒体也倾向于提高表达水平，但与FHN相比，提高的水平降低(图10)。
在上述载体中，SIV VSV-G蛋白和病毒体F蛋白负责融合。使用VSV-G蛋白融合的最适pH落入弱酸性pH的范围。另一方面，据报道F蛋白甚至在中性pH下也参与融合。在此实施例中，在中性pH下获得融合，因此，可假定SeV的F蛋白在融合中起主要作用。据报道只要F蛋白具有功能活性，SeV和脂质体之间的融合是可以获得的。因此，当假设基于FHN病毒体的融合效率与基于F病毒体的融合效率相当时，仅通过FHN病毒体即可获得的增加的基因表达水平可归功于额外的HN的实质性贡献。HN病毒体在某个水平上也表现出作用；这表明在某种程度上发生了基于VSV-G的融合，这可导致HN蛋白整合至SIV中。
另一方面，简单地共感染SIV和病毒体所发挥的作用与仅使用SIV差不多(图10)。这些发现表明通过在37℃保温含有这两者的混合物即可建立融合，因此，得自SeV的膜蛋白整合至SIV包膜；HN蛋白为改善感染率作出主要贡献。
HN假型慢病毒载体的制备及性能分析1.细胞培养于37℃，10％CO2气氛中，在含有10％的灭活型胎牛血清(BIOWHITTAKER)的Dulbecco改进型Eagle培养基(DMEM)-高葡萄糖(GibcoBRL)中培养293T细胞(人胎肾细胞系)。
2.制备载体以5×105个细胞/孔的细胞密度将293T细胞铺于6-孔塑料培养板，然后于37℃，10％CO2气氛中保温48小时。用800μl/孔含有1％牛血清白蛋白的DMEM更换培养基。然后将细胞用于转染。在下表5所示的组合中，在每孔的100μl Opti MEM中溶解1200ng基因转移载体(pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/3LTRΔU3或pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVβ-gal/3LTRΔU3)，360ng包装载体(pCAGGS/SIVagmgag-tat/rev)，120ng VSV-G表达质粒pVSV-G(Clontech)，各为240ng的仙台病毒HN，F和M蛋白表达质粒pCAGGS-HN，pCAGGS-F和pCAGGS-M。然后，在孔中加入6μl PLUS试剂(Gibco BRL)。搅拌混合物，然后在室温下静置15分钟。在混合物中加入用100μl Opti MEM稀释4μlLIPOFECTAMINE试剂(Gibco BRL)所获得的溶液。搅拌混合溶液，然后在室温下再静置15分钟。边缓慢搅拌边将所得混合物滴加至上文制备的293T细胞中。然后于37℃，10％CO2气氛中将细胞保温3小时。在每孔中加入1ml含有1％牛血清白蛋白和15μg/ml胰蛋白酶(Gibco BRL)的DMEM。于37℃，10％CO2气氛中培养48小时之后，收集培养物上清液，用0.45-μm孔径的滤器过滤，将所得溶液用作载体溶液。
表5 (在此表中，黑色表示添加的质粒。“PV”表示包装载体pCAGGS/SIVagm gag-tat/rev；“GTV”，基因转移载体pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/3LTRΔU3或pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVβ-gal/3LTRΔU3；“VSV-G”，VSV-G表达质粒pVSV-G；“HN”，“F”和“M”分别表示仙台病毒HN蛋白-，F蛋白-和M蛋白-表达质粒pCAGGS-HN，pCAGGS-F和pCAGGS-M。)3.大规模制备和富集载体以5×106个细胞/皿的细胞密度将293T细胞铺于15-cm塑料平皿，然后于37℃，10％CO2气氛中培养48小时。用10ml/皿含有1％牛血清白蛋白的DMEM更换培养基。然后将细胞用于转染。在上表5所示的组合中，在每皿的1.5ml Opti MEM中溶解8μg基因转移载体，2.4μg包装载体，0.8μgVSV-G表达质粒pVSV-G(Clontech)，各为1.6μg的仙台病毒HN，F和M蛋白表达质粒pCAGGS-HN，pCAGGS-F和pCAGGS-M。然后，在每皿中加入40μl PLUS试剂(Gibco BRL)。搅拌混合物，然后在室温下静置15分钟。在混合物中加入用1.5ml Opti MEM稀释60μl LIPOFECTAMINE试剂(Gibco BRL)所获得的溶液。搅拌混合溶液，然后在室温下再静置15分钟。边缓慢搅拌边将混合物滴加至上文制备的293T细胞中。然后于37℃，10％CO2气氛中将细胞保温3小时。在每皿中加入10ml含有1％牛血清白蛋白和15μg/ml胰蛋白酶(Gibco BRL)的DMEM。于37℃，10％CO2气氛中培养48小时之后，收集培养物上清液，用0.45-μm孔径的滤器过滤，接着于4℃，以42，490xg(TOMY SRX-201，TA21BH)离心90分钟。将所得沉淀物溶解于1/100体积的逆转录溶液(TBS，10mM MgCl2，3mM SPERMINE，0.3nMSUPERMIDINE，100mM dNTPs)，于37℃将溶液保温2小时。逆转录反应之后，于4℃，以42，490xg(TOMY SRX-201，TA21BH)离心反应物2小时，将所得沉淀物溶解于PBS(5％FCS，2μg/ml polybrene)中。将溶液储存于-80℃待用。
当将三种质粒，即包装载体，基因转移载体和包被蛋白表达载体共转染至细胞时，mRNA转录自基因转移载体；包装载体提供的病毒蛋白质对Ψ序列的识别使得RNA被包装成载体颗粒。然后，经由包被蛋白载体提供的包膜蛋白的假型化，最终形成载体颗粒。检测所制备的假型病毒载体将基因转移至细胞的能力。
<载体滴定并检测含有转移基因的细胞>
通过上述方法在载体介导下将基因转移至293T细胞。使用1ml载体溶液，基于已导入基因的细胞数目测定滴度。当将编码EGFP的基因转移载体用作报道基因时，室温下使用含有2％甲醛和0.2％戊二醛的PBS(Invitrogen)将靶细胞固定20分钟，然后用PBS清洗一次；基于在荧光倒置显微镜(DMIRB(SLR)，Leica)下的观察结果评价EGFP表达。
按照表5(2)至(5)中的组合，将三种质粒，即包装载体(pCAGGS/SIVagmgag-tat/rev)，基因转移载体(pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/3LTRΔU3)，和得自仙台病毒的包被蛋白载体(pCAGGS-F，pCAGGS-HN，和pCAGGS-M)共转染至细胞中。在任一组合中，基因未转移至293T细胞。然而，通过与VSV-G共表达可成功完成基因转移。这些发现表明当仅用F和HN蛋白制备时，假型SIVagm载体无法介导足够高效的基因转移，但通过借助于同时存在的对人细胞具有感染性的病毒包膜蛋白，如VSV-G，即可产生表现出较高感染性的假型病毒载体。
使用假型SIVagm载体将EGFP基因导入293T细胞，并测定载体滴度；所制备的病毒载体的滴度是每1ml载体溶液0.5至1×105T.U.。通过离心富集的病毒载体的滴度高达1.0×107T.U./ml。这表明通过离心可富集被仙台病毒F和HN蛋白假型化的SIVagm载体。
体内施用假型病毒载体导入时，应当预先处理用常规病毒载体难以导入基因的气管上皮粘膜细胞，以除去物理屏障。因此，当想通过使用VSV-G假型HIV载体的方法将基因导入这种细胞时，仅在用二氧化硫等损害细胞之后即可确保产生足够明显的效果(L.G.Johnson等，Gene Therapy7，568-574.2000)。因此，检测被仙台病毒F和HN蛋白假型化的SIVagm载体是否可将基因高效转移至气管上皮粘膜细胞而不会损害细胞。
通过吸入seboflurene麻醉6-周龄C57BL/6小鼠(雄性)，给这些小鼠鼻内施用通过上述方法产生的，表达EGFP的FHN假型SIV载体(表5(11)中的EGFP表达载体)(称之为SIV-F/HN/M-EGFP)。将组织包埋于OCT化合物中，切成冷冻切片；在荧光显微镜(Zeiss)下观察切片。
鼻内施用100μl SIV-F/HN/M-EGFP(108T.U.)，3天后观察气管。在气管上皮细胞中检测到EGFP荧光(图11)。另外还证实了相同个体的粘膜上皮也表达基因，发现荧光位于鼻中隔粘膜假复层纤毛上皮中(图12)。
由体内施用假型病毒载体而介导的外源基因持续表达通过与上述相同的方法，使用表达EGFP的基因转移载体产生含有F和HN蛋白的假型逆转录病毒。具体地说，产生对应于表2(9)的假型MSCV(MSCV-F/HN/M-EGFP)和对应于表5(11)的假型SIV(SIV-F/HN/M-EGFP)。将对应于表5(1)的VSV-G假型SIV(SIV-VSV-EGFP)用作对照。给小鼠鼻内施用表达EGFP的病毒载体，给药90天后，制备鼻粘膜组织切片以观察EGFP表达。
根据所得结果，所用的每一个载体都能导致EGFP表达；当施用含有F和HN蛋白的MSCV-F/HN/M-EGFP和SIV-F/HN/M-EGFP时，检测到EGFP的强荧光信号。特别地，与其它载体的观察结果相比，施用SIV-F/HN/M-EGFP载体能给出更强的荧光信号。因此，可以证实载体具有高效转移基因的能力(图13)。
构建新的仙台病毒包膜蛋白表达质粒[1]构建胞质结构域已被取代的HN蛋白的表达质粒构建HN表达质粒，其中HN蛋白的胞质结构域被SIV包膜蛋白的胞质结构域所取代(图14)。退火三对合成的寡核苷酸(Xho+Xma/Xma-Xho，Xma+131/135-Xma，132+Bam/Bam-136)，然后将每一对插入pBluescriptKS+(Stratagene)的XhoI-BamHI位点。将通过用XhoI和DraIII消化上述重组质粒而获得的含有合成寡核苷酸的纯化片段，或者通过用DraIII和Bsu36I消化HN蛋白表达质粒pCAGGS-HN而获得的含有HN蛋白3’部分的纯化片段插入pCAGGS(Gene，vol.108，pp.193-200，1991)的XhoI-Bsu36I位点。将通过上述方法获得的质粒用作SIV胞质结构域已被取代的HN蛋白的表达质粒pCAGGS-SIVct/HN。
构建添加有SIV胞质结构域的HN蛋白的表达质粒构建HN表达质粒，其中将SIV包膜蛋白的胞质结构域添加至HN蛋白中(图15)。使用引物FSIVhn和RhnSIV，并使用上述的胞质结构域-被取代的HN蛋白的表达质粒作为模板，经PCR扩增含有SIV包膜蛋白的胞质结构域和部分HN蛋白的区域。用XhoI和AccI消化扩增的片断之后，将三对上文[1]中制备的合成寡核苷酸插入pBluescript KS+(Stratagene)的XhoI-AccI位点，以用含有SIV包膜胞质结构域的片断进行取代。
将通过用XhoI和DraIII消化重组质粒而获得的含有合成寡核苷酸的纯化片段，或者通过用DraIII和Bsu36I消化HN蛋白表达质粒pCAGGS-HN而获得的含有HN蛋白3’部分的片段插入pCAGGS(Gene，vol.108，pp.193-200，1991)的XhoI-Bsu36I位点。将通过上述方法获得的质粒用作添加有SIV胞质结构域的HN蛋白的表达质粒pCAGGS-SIVct+HN。
构建缺失胞质结构域的F蛋白表达质粒构建F蛋白表达质粒，它们各自含有F蛋白的胞质结构域氨基酸5’末端的前27，14或4个残基，因此分别缺失了15，28或38个残基。使用引物对XhFF和NotF1650，NotF1611和NotF1581，使用将F蛋白整个区域插入pBluescript KS+(Stratagene)的SmaI位点所获得的质粒pBluescriptKS+/SmaI/F作为模板，经PCR扩增分别缺失15，28和38个氨基酸的每个片断。用XhoI和NotI消化扩增的片断，然后各自插入通过将XhoI/NotI接头插入pCAGGS(Gene，vol.108，pp.193-200，1991)的EcoRI位点而构建出的质粒的XhoI-NotI位点，以构建出质粒(15个氨基酸缺失pCAGGS-Fct27；28个氨基酸缺失pCAGGS-Fct14；38个氨基酸缺失pCAGGS-Fct4)。
构建含有SIV胞质结构域的胞质结构域-缺失型F蛋白表达质粒通过将SIV胞质结构域5’末端的前11个氨基酸(SIVct11)添加至胞质结构域-缺失的F蛋白表达质粒以构建质粒(图17)(F蛋白胞质结构域中氨基酸的数目与[3]中制备的质粒中的相应数目相同)。使用引物对XhFF和SA-F1650以及SA-F1611和SA-F1581，并使用将F蛋白整个区域插入pBluescriptKS+(Stratagene)的SmaI位点所获得的质粒pBluescript KS+/SmaI/F作为模板，经PCR扩增对应于上述三种缺失了氨基酸但含有添加的SIV胞质结构域的片断。用XhoI和NotI消化扩增的片断，然后各自插入通过将XhoI/NotI接头插入pCAGGS(Gene，vol.108，pp.193-200，1991)的EcoRI位点而构建出的质粒的XhoI-NotI位点，以构建出质粒(SIVct11添加+15个氨基酸缺失pCAGGS-Fct27/SIVct11；SIVct11添加+28个氨基酸缺失pCAGGS-Fct14/SIVct11；和SIVct11添加+38个氨基酸缺失pCAGGS-Fct4/SIVct11)。
仙台病毒包膜-假型化慢病毒载体的制备和性能分析<细胞培养>
于37℃，10％CO2气氛中，在含有10％的灭活胎牛血清(BIOWHITTAKER)的Dulbecco改进型Eagle培养基(DMEM)-高葡萄糖(GibcoBRL)中培养293T细胞(人胎肾细胞系)。
于37℃，5％CO2气氛中，在极限必需培养基(MEM)(Gibco BRL)和含有10％的灭活胎牛血清(BIO WHITTAKER)的RPMI1640(1∶1)的混合物中培养BEAS-2B细胞(得自气管的人上皮细胞系)。
<制备载体>
以5×105个细胞/孔的细胞密度将293T细胞铺于6-孔塑料培养板，然后于37℃，10％CO2气氛中保温48小时。用800μl/孔含有1％牛血清白蛋白的DMEM更换培养基。然后将细胞用于转染。在下表6所示的组合中，在每孔的100μl Opti MEM中溶解1200ng基因转移载体(pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVF EGFP/3LTRΔU3)，360ng包装载体(pCAGGS/SIVagmgag-tat/rev)，仙台病毒HN，F蛋白表达质粒pCAGGS-SIVct/HN，pCAGGS-SIVct+HN，pCAGGS-Fct4，pCAGGS-Fct14，pCAGGS-Fct27，pCAGGS-Fct4/SIVct11，pCAGGS-Fct14/SIVct11和pCAGGS-Fct27/SIVct11。然后，在孔中加入6μl PLUS试剂(Gibco BRL)。搅拌混合物，然后在室温下静置15分钟。在混合物中加入用100μl Opti MEM稀释4μl LIPOFECTAMINE试剂(Gibco BRL)所获得的溶液。搅拌混合溶液，然后在室温下再静置15分钟。边缓慢搅拌边将所得混合物滴加至上文制备的293T细胞中。然后于37℃，10％CO2气氛中将细胞保温3小时。在每孔中加入1ml含有1％牛血清白蛋白和15μg/ml胰蛋白酶(Gibco BRL)的DMEM。于37℃，10％CO2气氛中培养16至24小时之后，用2ml含有1％牛血清白蛋白和7.5μg/ml胰蛋白酶(Gibco BRL)的DMEM更换每个孔中的培养基。随后再培养24小时，收集培养物上清液。然后用0.45-μm孔径的滤器过滤上清液，将所得溶液用作载体溶液。
表6 <SIVagm载体-介导的基因转移>
以1×106个细胞/孔的细胞密度将用作靶细胞的293T细胞和BEAS-2B细胞铺于6-孔塑料培养板，于37℃，10％CO2气氛中保温；将293T细胞保温48小时，BEAS-2B细胞保温24小时。然后从培养板中除去培养基，在细胞上覆盖1ml通过在载体溶液中加入终浓度为8μg/ml的polybrene(Sigma)所获得的混合物。于37℃保温培养板3小时以将载体转染至细胞；在10％CO2气氛中保温293T细胞，在5％CO2气氛中保温BEAS-2B细胞。3小时之后，在细胞中加入1ml含有20％的灭活胎牛血清(BIO WHITTAKER)的培养基，于37℃保温培养板48小时；在10％CO2气氛中保温293T细胞，在5％CO2气氛中保温BEAS-2B细胞。
<载体滴定>
使用1ml载体溶液，基于已导入基因的细胞数目测定滴度。根据上述方法，用1ml载体溶液进行感染。感染48小时之后，室温下使用含有2％甲醛和0.2％戊二醛的PBS(Invitrogen)将细胞固定20分钟，用PBS清洗一次。在放大倍数为200的荧光倒置显微镜(DMIRB(SLR)，Leica)下，从3个不同的视野测定单个视野中含有转移基因的细胞数目的平均值，再乘以根据视野面积和培养板面积来确定的系数854.865，从而测出滴度。滴度的单位被定义为转导单位(T.U.)/ml。
<大规模制备和富集载体>
以5×106个细胞/皿的细胞密度将293T细胞铺于15-cm塑料平皿，然后于37℃，10％CO2气氛中培养48小时。用10ml/皿含有1％牛血清白蛋白的DMEM更换培养基。然后将细胞用于转染。在每皿的1.5ml Opti MEM中溶解8μg基因转移载体(pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFLacZ/3LTRΔU3)，2.4μg包装载体(pCAGGS/SIVagm gag-tat/rev)，各为1.6μg的仙台病毒HN蛋白表达质粒pCAGGS-SIVct+HN，和F蛋白表达质粒pCAGGS-Fct4。然后，在每皿中加入40μl PLUS试剂(Gibco BRL)。搅拌混合物，然后在室温下静置15分钟。在混合物中加入用1.5ml Opti MEM稀释60μl LIPOFECTAMINE试剂(Gibco BRL)所获得的溶液。搅拌混合溶液，然后在室温下再静置15分钟。边缓慢搅拌边将混合物滴加至上文制备的293T细胞中。然后于37℃，10％CO2气氛中将细胞保温3小时。在每皿中加入10ml含有1％牛血清白蛋白和15μg/ml胰蛋白酶(Gibco BRL)的DMEM。于37℃，10％CO2气氛中培养16至24小时之后，用20ml含有1％牛血清白蛋白和7.5μg/ml胰蛋白酶(Gibco BRL)的DMEM更换每皿中的培养基。随后再培养24小时，收集培养物上清液。然后用0.45-μm孔径的滤器过滤上清液。然后，于4℃，以16,000xg(Beckman J-25I，JA-18)离心滤液1小时。将所得沉淀物溶解于PBS(含5％FCS和2μg/ml polybrene)中。将所得溶液储存于-80℃。
<结果>
以多种组合将基因转移载体(pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/3LTRΔU3)，包装载体(pCAGGS/SIVagm gag-tat/rev)，仙台病毒HN蛋白表达质粒(pCAGGS-SIVct/HN或pCAGGS-SIVct+HN)，和F蛋白表达质粒(pCAGGS-Fct4，pCAGGS-Fct14，pCAGGS-Fct27，pCAGGS-Fct4/SIVct11，pCAGGS-Fct14/SIVct11，pCAGGS-Fct27/SIVct11)共转染至细胞。然后，将基因成功导入293T细胞和BEAS-2B细胞(图18，19和20)。仅用经修饰的HN和F蛋白表达质粒而无需共表达VSV-G，即可获得基因转移。由此阐明可以提供被仙台病毒F和HN蛋白修饰的基于SIVagm的假型慢病毒载体。假型载体对293T细胞的滴度约为3.6×104T.U./ml。当联合使用F蛋白表达质粒pCAGGS-Fct4和Fct4/SIVct11时滴度最高；在两种F蛋白表达质粒与三种HN蛋白表达质粒的组合中，联合使用HN蛋白表达质粒pCAGGS-SIVct+HN时获得最高滴度。
检测通过离心是否能富集表现出最高滴度的载体，所述载体是通过共转染F蛋白表达质粒pCAGGS-Fct4和HN蛋白表达质粒pCAGGS-SIVct+HN而制备的。结果证实通过离心可以高水平富集F-HN假型载体(图21)。
<检测的寡核苷酸>
经由Department of Custom DNA Synthesis，Greiner Japan，在Biochemical Research Division of the Nippon Flour Mills Co.，Ltd.内合成所用的除SA-F1611和SA-F1581外的合成寡核苷酸，并用反相柱或PAGE进行纯化。在Sawady Technology Co.合成SA-F1611和SA-F1581，经HPLC纯化之后再使用。
Xho+Xma5’-TCGAGATGTGGTCTGAGTTAAAAATCAGGAGCAACGACGGAGGTGAAGGACCAGACGCCAACGACCC-3’(SEQ ID NO25)Xma-Xho5’-CCGGGGGTCGTTGGCGTCTGGTCCTTCACCTCCGTCGTTGCTCCTGATTTTTAACTCAGACCACATC-3’(SEQ ID NO26)Xma+1315’-CCGGGGAAAGGGGGTGCAACACATCCATATCCAGCCATCTCTACCTGTTTATGGACAGA-3’(SEQ ID NO27)135-Xma5’-ACCCTCTGTCCATAAACAGGTAGAGATGGCTGGATATGGATGTGTTGCACCCCCTTTCC-3’(SEQ ID NO28)132+Bam5’-GGGTTAGGTGGTTGCTGATTCTCTCATTCACCCAGTGGG-3’(SEQ ID NO29)Bam-1365′-GATCCCCACTGGGTGAATGAGAGAATCAGCAACCACCTA-3’(SEQ ID NO30)FSIVhn5’-GAGACTCGAGATGTGGTCTGAGTTAAAAATCAGG-3’(SEQ IDNO31)RhnSIV5’-AGAGGTAGACCAGTACGAGTCACGTTTGCCCCTATCACCATCCCTAACCCTCTGTCCATAAAC-3’(SEQ ID NO32)
XhFF5’-CCGCTCGAGCATGACAGCATATATCCAGAGA-3’(SEQID NO33)NotF16505’-AIAGTTTAGCGGCCGCTCATCTGATCTTCGGCTCTAATGT-3’(SEQ ID NO34)NotF16115’-ATAGTTTAGCGGCCGCTCAACGGTCATCTGGATTACCCAT-3’(SEQ ID NO35)NotF15815′-ATAGTTTAGCGGCCGCTCACCTTCTGAGTCTAIAAAGCAC-3’(SEQ ID NO36)SA-F16505’-ATAGTTTAGCGGCCGCCTATGGAGATAGAGGAACATATCCCTGCCTAACCCTTCTGATCTTCGGCTCTAATGT-3’(SEQ ID NO37)SA-F16115’-ATAGTTTAGCGGCCGCCTGGAGAGATAGAGGAACATATCCCTGCCTAACCCTACGGTCATCTGGATTACCCAT-3’(SEQ ID NO38)SA-F15815’-ATAGTTTAGCGGCCGCCTATGGAGATAGAGGAACATATCCCTGCCTAACCCTCCTTCTGAGTCTATAAAGCAC-3’(SEQ ID NO39)[实施例13]仙台病毒包膜-假型化逆转录病毒载体的制备和性能分析<细胞培养>
于37℃，10％CO2气氛中，在含有10％的灭活胎牛血清(BIOWHITTAKER)的Dulbecco改进型Eagle培养基(DMEM)-高葡萄糖(GibcoBRL)中培养293T细胞(人胎肾细胞系)。
<制备载体>
以5×105个细胞/孔的细胞密度将293T细胞铺于6-孔塑料培养板，然后于37℃，10％CO2气氛中保温48小时。用800μl/孔含有1％牛血清白蛋白的DMEM更换培养基。然后将细胞用于转染。在下表7所示的组合中，在每孔的100μl Opti MEM(Gibco BRL)中溶解700ng基因转移载体pMSCVEGFP，300ng亲嗜性包膜和gag-pol表达质粒(IMGENEX)，200ng仙台病毒F蛋白表达质粒pCAGGS-Fct4，各为200ng的HN蛋白表达质粒pCAGGS-HN，pCAGGS-SIVct/HN和pCAGGS-SIVct+HN。然后，在孔中加入6μl PLUS试剂(Gibco BRL)。搅拌混合物，然后在室温下静置15分钟。在混合物中加入用100μlOpti MEM稀释4μl LIPOFECTAMINE试剂(Gibco BRL)所获得的溶液。搅拌混合溶液，然后在室温下再静置15分钟。边缓慢搅拌边将所得混合物滴加至上文制备的293T细胞中。然后于37℃，10％CO2气氛中将细胞保温3小时。在每孔中加入1ml含有1％牛血清白蛋白和15μg/ml胰蛋白酶(Gibco BRL)的DMEM。于37℃，10％CO2气氛中培养16至24小时之后，用2ml含有1％牛血清白蛋白和7.5μg/ml胰蛋白酶(Gibco BRL)的DMEM更换每个孔中的培养基。随后再培养24小时，收集培养物上清液。然后用0.45-μm孔径的滤器过滤上清液，将所得溶液用作载体溶液。
表7 <SIVagm载体-介导的基因转移>
以1×105个细胞/孔的细胞密度将用作靶细胞的293T细胞铺于6-孔塑料培养板，于37℃，10％CO2气氛中保温48小时。然后从培养板中除去培养基，在细胞上覆盖1ml通过在载体溶液中加入终浓度为8μg/ml的polybrene(Sigma)所获得的混合物。于37℃，10％CO2气氛中保温培养板3小时以将载体转染至细胞。3小时之后，在细胞中加入1ml含有20％的灭活胎牛血清(BIO WHITTAKER)的培养基，于37℃，10％CO2气氛中保温培养板48小时。
<载体滴定>
使用1ml载体溶液，基于已导入基因的细胞数目测定滴度。根据上述方法，用1ml载体溶液进行感染。感染48小时之后，室温下使用含有2％甲醛和0.2％戊二醛的PBS(Invitrogen)将细胞固定20分钟，用PBS清洗一次。在放大倍数为200的荧光倒置显微镜(DMIRB(SLR)，Leica)下，从3个不同的视野测定单个视野中含有转移基因的细胞数目的平均值，再乘以根据视野面积和培养板面积而确定的系数854.865，从而测出滴度。滴度的单位被定义为转导单位(T.U.)/ml。
<结果>
将基因转移载体pMSCV EGFP，亲嗜性包膜和gag-pol表达质粒，仙台病毒F蛋白表达质粒pCAGGS-Fct4，HN蛋白表达质粒pCAGGS-HN，pCAGGS-SIVct/HN和pCAGGS-SIVct+HN联合共转染至细胞。成功获得对293T细胞的基因转移(图22)。当使用经修饰的HN和F蛋白表达质粒时，可将基因成功导入含亲嗜性包膜的病毒所不能感染的人293T细胞。由此阐明可以提供被仙台病毒F和HN蛋白修饰的基于MSCV的假型逆转录病毒载体。另外，联合使用F蛋白表达质粒pCAGGS-Fct4和三种HN蛋白表达质粒；当联合使用HN蛋白表达质粒pCAGGS-SIVct+HN时，假型逆转录病毒载体的滴度最高(1.1×105T.U./ml)。
产生VSV-G/HN假型慢病毒载体并与VSV-G假型慢病毒载体比较对包括造血干细胞的人骨髓细胞的基因转移效率<细胞培养>
于37℃，10％CO2气氛中，在含有10％的灭活胎牛血清(BIOWHITTAKER)的Dulbecco改进型Eagle培养基(DMEM)-高葡萄糖(GibcoBRL)中培养293T细胞(人胎肾细胞系)。
<载体滴定>
使用1ml载体溶液，基于已导入基因的细胞数目测定滴度。根据上述方法，用1ml载体溶液进行感染。感染48小时之后，室温下使用含有2％甲醛和0.2％戊二醛的PBS(Invitrogen)将细胞固定20分钟，用PBS清洗一次。在放大倍数为200的荧光倒置显微镜(DMIRB(SLR)，Leica)下，从3个不同的视野测定单个视野中含有转移基因的细胞数目的平均值，再乘以根据视野面积和培养板面积确定的系数854.865，从而测出滴度。滴度的单位被定义为转导单位(T.U.)/ml。
<大规模制备和富集载体>
以5×106个细胞/皿的细胞密度将293T细胞铺于15-cm塑料平皿，然后于37℃，10％CO2气氛中培养48小时。用10ml/皿DMEM更换培养基。将细胞用于转染。按照下表8所示的组合，在每皿1.5ml的Opti MEM(GibcoBRL)中溶解8μg基因转移载体(pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/3LTRΔU3)，2.4μg包装载体(pCAGGS/SIVagm gag-tat/rev)，各为1.6μg的VSV-G表达质粒pVSV-G以及仙台病毒HN蛋白表达质粒pCAGGS-HN，pCAGGS-SIVct/HN和pCAGGS-SIVct+HN。然后，在每皿中加入40μl PLUS试剂(Gibco BRL)。搅拌混合物，然后在室温下静置15分钟。在混合物中加入用1.5ml Opti MEM稀释60μl LIPOFECTAMINE试剂(Gibco BRL)所获得的溶液。搅拌混合溶液，然后在室温下再静置15分钟。边缓慢搅拌边将混合物滴加至上文制备的293T细胞中。然后于37℃，10％CO2气氛中将细胞保温3小时。在每皿中加入20ml含有20％的灭活胎牛血清(BIOWHITTAKER)的DMEM。于37℃，10％CO2气氛中培养16至24小时之后，用20ml含有的灭活胎牛血清(BIO WHITTAKER)的DMEM更换每皿中的培养基。随后再培养24小时，收集培养物上清液。然后用0.45-□m孔径的滤器过滤上清液。然后，于4℃，以42,390xg(TOMY SRX-201，TA21BH)离心滤液90分钟。将所得沉淀物溶解于1/100体积的逆转录反应溶液(TBS，10mM MgCl2，3mM SPERMINE，0.3nM SUPERMIDINE，100mM dNTPs)。于37℃将溶液保温2小时。逆转录之后，于4℃，以42,490xg(TOMY SRX-201，TA21BH)离心反应物2小时，将所得沉淀物溶解于PBS(含有5％FCS和2μg/ml polybrene)中。将所得溶液储存于-80℃待用。
表8 <将基因转移至人骨髓CD34+细胞>
人骨髓CD34+细胞购自BIO WHITTAKER。解冻之后，于37℃，5％CO2气氛中，在含有50ng/ml IL-6，100ng/ml TPO，100ng/ml干细胞因子(GIBCOBRL)，100ng/ml Flt-3配体(Research Diagnostics，Flanders，NJ)(皆为人重组体)和10％FCS的Iscove改进的DMEM(IMDM)中将细胞培养48小时。保温之后，除去培养基，将2×106或107T.U./ml的病毒溶液加入2×105个细胞。然后在细胞中加入50ng/ml IL-6，100ng/ml TPO，100ng/ml干细胞因子(GIBCO BRL)和100ng/ml Flt-3配体。保温96小时之后收集细胞。
<流式细胞术分析>
用经PE标记的抗-人CD34抗体(Becton Dickinson)染色收集的细胞，然后使用两种对应于GFP和PE的荧光信号，通过流式细胞术(EPICS ELITE，Coulter)进行分析。
<结果>
当以m.o.i.＝10使用VSV-G假型载体时，CD34+细胞中GFP阳性细胞的比率为9.7％；使用假型载体VSV-G和HN，SIVct/HN以及SIVct+HN时，CD34+细胞中GFP阳性细胞的比率分别为43.9，25.2和19.7％(表9)。另一方面，以m.o.i.＝50使用VSV-G假型载体时，CD34+细胞中GFP阳性细胞的比率为51.4％；使用VSV-G和HN，SIVct/HN以及SIVct+HN假型载体时，CD34+细胞中GFP阳性细胞的比率分别为43.0，70.8和68.4％(表10)。
基于上述发现，进一步证实了通过共表达VSV-G蛋白和HN蛋白而制备的假型载体能确保增加对包括造血干细胞在内的人骨髓细胞的基因转移效率。
表9m.o.i.＝10时的GFP阳性细胞群体(％) 表10m.o.i.＝50时的GFP阳性细胞群体(％) [实施例15]构建流感病毒包膜蛋白表达质粒构建编码得自流感病毒(H1N1)的血凝素蛋白(HA)的表达质粒。使用引物HAFNot和HARNot，以质粒pDREF HisD(Microbiol.Immunol.，44(8)，677-685，2000)为模板，经PCR扩增片断。扩增的片断用NotI消化，然后插入通过在pCAGGS(Gene，vol.108，pp.193-200，1991)中添加XhoI-NotI位点而制备的载体的NotI位点。将通过上述方法获得的质粒用作HA蛋白表达质粒pCAGGS-HA。
经由Department of Custom DNA Synthesis，Greiner Japan，在Biochemical Research Division of the Nippon Flour Mills Co.，Ltd.内合成所用的合成寡核苷酸，并用反相柱或PAGE进行纯化。
HAFNot5’-GAGAGCGGCCGCCCAAAATGAAGGCAAAACTACTG-3’(SEQ ID NO48)HARNot5’-GATGCGGCCGCTCAGATGCATATTCTGCAC-3’(SEQID NO49)[实施例16]流感病毒包膜假型慢病毒载体的制备和性能分析<细胞培养>
于37℃，10％CO2气氛中，在含有10％的灭活胎牛血清(BIOWHITTAKER)的Dulbecco改进型Eagle培养基(DMEM)-高葡萄糖(GibcoBRL)中培养293T细胞(人胎肾细胞系)。
<制备载体>
以5×105个细胞/孔的细胞密度将293T细胞铺于6-孔塑料培养板，然后于37℃，10％CO2气氛中保温48小时。用800μl/孔含有1％牛血清白蛋白的DMEM更换培养基。然后将细胞用于转染。在每孔的100μl OptiMEM(Gibco BRL)中溶解1200ng基因转移载体(pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVF EGFP/3LTRΔU3)，360ng包装载体(pCAGGS/SIVagm gag-tat/rev)和240ng HA蛋白表达质粒pCAGGS-HA。然后，在孔中加入6μl PLUS试剂(Gibco BRL)。搅拌混合物，然后在室温下静置15分钟。在混合物中加入用100μl Opti MEM稀释4μl LIPOFECTAMINE试剂(Gibco BRL)所获得的溶液。搅拌混合溶液，然后在室温下再静置15分钟。边缓慢搅拌边将所得混合物滴加至上文制备的293T细胞中。然后于37℃，10％CO2气氛中将细胞保温3小时。在每孔中加入1ml含有1％牛血清白蛋白和10μg/ml胰蛋白酶(Gibco BRL)的DMEM。于37℃，10％CO2气氛中培养16至24小时之后，用2ml含有1％牛血清白蛋白，5μg/ml胰蛋白酶(Gibco BRL)和50单位神经氨酸酶(Roche)的DMEM更换每个孔中的培养基。随后再培养24小时，收集培养物上清液。然后用0.45-μm孔径的滤器过滤上清液，将所得溶液用作载体溶液。
<SIVagm载体-介导的基因转移>
以1×106个细胞/孔的细胞密度将用作靶细胞的293T细胞铺于6-孔塑料培养板，于37℃，10％CO2气氛中保温48小时。然后从培养板中除去培养基，在细胞上覆盖1ml通过在载体溶液中加入终浓度为8μg/ml的polybrene(Sigma)所获得的混合物。于37℃，10％CO2气氛中保温培养板3小时以将载体转染至细胞。3小时之后，在细胞中加入1ml含有20％的灭活胎牛血清(BIO WHITTAKER)的培养基，于37℃，10％CO2气氛中保温细胞48小时。
<载体滴定>
使用1ml载体溶液，基于已导入基因的细胞数目测定滴度。根据上述方法，用1ml载体溶液进行感染。感染48小时之后，室温下使用含有2％甲醛和0.2％戊二醛的PBS(Invitrogen)将细胞固定20分钟，用PBS清洗一次。在放大倍数为200的荧光倒置显微镜(DMIRB(SLR)，Leica)下，从3个不同的视野测定单个视野中含有转移基因的细胞数目的平均值，再乘以根据视野面积和培养板面积确定的系数854.865，从而测出滴度。滴度的单位被定义为转导单位(T.U.)/ml。
<大规模制备和富集载体>
以5×106个细胞/皿的细胞密度将293T细胞铺于15-cm塑料平皿，然后于37℃，10％CO2气氛中培养48小时。用10ml/皿含有1％牛血清白蛋白的DMEM更换培养基。将细胞用于转染。在每皿1.5ml的Opti MEM(Gibco BRL)中溶解8μg基因转移载体(pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFLacZ/3LTRΔU3)，2.4μg包装载体(pCAGGS/SITVagm gag-tat/rev)和1.6μg HA蛋白表达质粒pCAGGS-HA。然后，在每皿中加入40μl PLUS试剂(GibcoBRL)。搅拌混合物，然后在室温下静置15分钟。在混合物中加入用1.5ml OptiMEM稀释60μl LIPOFECTAMINE试剂(Gibco BRL)所获得的溶液。搅拌混合溶液，然后在室温下再静置15分钟。边缓慢搅拌边将混合物滴加至上文制备的293T细胞中。然后于37℃，10％CO2气氛中将细胞保温3小时。在每皿中加入10ml含有1％牛血清白蛋白和10μg/ml胰蛋白酶(Gibco BRL)的DMEM。于37℃，10％CO2气氛中培养16至24小时之后，用20ml含有1％牛血清白蛋白，5μg/ml胰蛋白酶(Gibco BRL)和500单位神经氨酸酶(Roche)的DMEM更换每皿中的培养基。随后再培养24小时，收集培养物上清液。然后用0.45-μm孔径的滤器过滤上清液。然后，于4℃，以16,000xg(Beckman J-25I，JA-18)离心滤液90分钟。将沉淀物溶解于PBS(含有5％FCS和2μg/ml polybrene)中。将所得溶液储存于-80℃待用。
<结果>
以多种组合将基因转移载体(pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/3LTRΔU3)，包装载体(pCAGGS/SIVagm gag-tat/rev)和HA蛋白表达质粒(pCAGGS-HA)共转染至细胞。然后，将基因成功导入293T细胞(图23)。无需共表达VSV-G即可获得基因转移。由此阐明可以使用流感病毒HA蛋白提供基于SIVagm的假型慢病毒载体。假型载体对293T细胞的滴度为1.3×104T.U./ml。另外，还检测了通过离心是否能富集通过上述方法制备的载体。结果证实通过离心可以高水平富集HA假型载体(图24)。
被流感病毒和仙台病毒包膜假型化的慢病毒载体的制备和性能分析<细胞培养>
于37℃，10％CO2气氛中，在含有10％的灭活胎牛血清(BIOWHITTAKER)的Dulbecco改进型Eagle培养基(DMEM)-高葡萄糖(GibcoBRL)中培养293T细胞(人胎肾细胞系)。
<制备载体>
以5×105个细胞/孔的细胞密度将293T细胞铺于6-孔塑料培养板，然后于37℃，10％CO2气氛中保温48小时。用800μl/孔含有1％牛血清白蛋白的DMEM更换培养基。然后将细胞用于转染。按照下表11所示的组合，在每孔的100μlOpti MEM(Gibco BRL)中溶解1200ng基因转移载体(pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVF EGFP/3LTRΔU3)，360ng包装载体(pCAGGS/SIVagm gag-tat/rev)和各为240ng的仙台病毒HN蛋白表达质粒pCAGGS-HN，pCAGGS-SIVct/HN，pCAGGS-SIVct+HN和HA蛋白表达质粒。然后，在孔中加入6μl PLUS试剂(Gibco BRL)。搅拌混合物，然后在室温下静置15分钟。在混合物中加入用100μl Opti MEM稀释4μlLIPOFECTAMINE试剂(Gibco BRL)所获得的溶液。搅拌混合溶液，然后在室温下再静置15分钟。边缓慢搅拌边将所得混合物滴加至上文制备的293T细胞中。然后于37℃，10％CO2气氛中将细胞保温3小时。在每孔中加入1ml含有1％牛血清白蛋白和10μg/ml胰蛋白酶(Gibco BRL)的DMEM。于37℃，10％CO2气氛中培养16至24小时之后，用2ml含有1％牛血清白蛋白，5μg/ml胰蛋白酶(Gibco BRL)和50单位神经氨酸酶(Roche)的DMEM更换每个孔中的培养基。随后再培养24小时，收集培养物上清液。然后用0.45-μm孔径的滤器过滤上清液；将所得溶液用作载体溶液。
表11 <结果>
以多种组合将基因转移载体(pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/3LTRΔU3)，包装载体(pCAGGS/SIVagm gag-tat/rev)，HA蛋白表达质粒(pCAGGS-HA)，和仙台病毒HN蛋白表达质粒(pCAGGS-HN，pCAGGS-SIVct/HN，pCAGGS-SIVct+HN)共转染至细胞。然后将基因成功导入293T细胞(图25)。神经氨酸酶负责在流感病毒出芽过程中裂解与唾液酸的连接，因此制备HA假型载体需要神经氨酸酶。因此，检测多种HN表达质粒是否具有仙台病毒HN蛋白的神经氨酸酶活性；同时存在HN蛋白导致产生所需的载体。结果表明可以提供新的HA/HN假型慢病毒载体。
工业实用性本发明提供了被具有血凝素活性的膜蛋白假型化的逆转录病毒载体。优选将本发明的载体用于基因治疗等。特别是，所述载体可用于对导气管进行体内给药，也可用于对靶造血干细胞进行回体(ex vivo)给药。
序列表<110>株式会社载体研究所(DNAVEC Research INC.)<120>含有血凝素活性膜蛋白的假型逆转录病毒载体<130>D3-107PCT<140><141><150>JP 2000-169090<151>2000-06-01<160>49<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的DNA序列<400>1gcagatctca accaggaggc gaggctgcat tttggg 36<210>2<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的DNA序列<400>2gcgaattcta cttactggtg ctgtaaagga gccaaa 36<210>3<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的DNA序列<400>3atcggaattc ttttattgta agatggattg gtttttaaat 40<210>4<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的DNA序列<400>4cgggatccgc ggccgcggat atggatctgt ggagatagag gaacatat48<210>5<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的DNA序列<400>5tcgagactag tgacttggtg agtaggctt 29<210>6<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的DNA序列<400>6tcgaaagcct actcaccaag tcactactc 29<210>7<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的DNA序列<400>7aatttctcga gcggccgca 19<210>8<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的DNA序列<400>8aatttgcggc cgctcgaga 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权利要求
1.基本上纯的假型逆转录病毒载体，其含有具有血凝素活性的膜蛋白。
2.根据权利要求1的假型逆转录病毒载体，其中具有血凝素活性的膜蛋白衍生自包含于单链负链RNA病毒中的具有血凝素活性的蛋白质。
3.根据权利要求2的假型逆转录病毒载体，其中具有血凝素活性的膜蛋白衍生自副粘病毒的HN蛋白和/或正粘病毒的HA蛋白。
4.根据权利要求2的假型逆转录病毒载体，其中具有血凝素活性的膜蛋白是包含于单链负链RNA病毒中的具有血凝素活性的蛋白质的部分或全部胞质结构域，其中所述部分或全部已通过取代，缺失和/或添加而进行修饰。
5.根据权利要求1至3中任一项的假型逆转录病毒载体，其进一步含有副粘病毒的F蛋白。
6.根据权利要求5的假型逆转录病毒载体，其中F蛋白的部分或全部胞质结构域已通过缺失和/或添加而修饰。
7.根据权利要求1至6中任一项的假型逆转录病毒载体，其进一步含有得自对人细胞有感染性的病毒的包膜蛋白。
8.根据权利要求7的假型逆转录病毒载体，其中所述载体含有得自逆转录病毒的兼嗜性包膜蛋白。
9.根据权利要求7或8的假型逆转录病毒载体，其中所述载体含有得自水泡性口炎病毒的VSV-G蛋白。
10.根据权利要求1至9中任一项的假型逆转录病毒载体，其中所述逆转录病毒载体衍生自肿瘤病毒。
11.根据权利要求1至9中任一项的假型逆转录病毒载体，其中所述逆转录病毒载体衍生自慢病毒。
12.根据权利要求11的假型逆转录病毒载体，其中所述慢病毒衍生自猴免疫缺陷病毒。
13.根据权利要求3或5的假型逆转录病毒载体，其中所述副粘病毒是仙台病毒。
14.根据权利要求1至13中任一项的假型逆转录病毒载体，其中的载体以可表达的方式含有外源基因。
15.根据权利要求14的假型逆转录病毒载体，其中的载体被用于将基因转移至具有粘液的细胞。
16.根据权利要求15的假型逆转录病毒载体，其中具有粘液的细胞是粘膜上皮细胞。
17.根据权利要求16的假型逆转录病毒载体，其中的粘膜上皮细胞是鼻腔或肺支气管的粘膜上皮细胞。
18.根据权利要求14的假型逆转录病毒载体，其中的载体被用于将基因转移至血细胞或造血细胞。
19.根据权利要求18的假型逆转录病毒载体，其中的血细胞或造血细胞是造血干细胞。
20.用于基因转移的组合物，所述组合物含有根据权利要求14至19中任一项的假型逆转录病毒载体。
21.根据权利要求20的组合物，其是药物组合物。
22.将外源基因导入细胞的方法，所述方法包括使细胞与根据权利要求14至19中任一项的假型逆转录病毒载体接触的步骤。
23.用于产生根据权利要求1至19中任一项的假型逆转录病毒载体的包装细胞，所述细胞以可表达的方式含有编码具有血凝素活性的蛋白质的DNA。
24.产生根据权利要求1至19中任一项的假型逆转录病毒载体的方法，所述方法包括在根据权利要求23的包装细胞中转录衍生自逆转录病毒的基因转移载体DNA的步骤。
全文摘要
本发明提供了含有血凝素活性膜蛋白的逆转录病毒载体。利用这种具有血凝素活性的膜蛋白，本发明构建了假型逆转录病毒载体。该病毒载体能将基因高效转移至宿主细胞。特别是证实了通过所述载体可将基因高效转移至通过常规技术几乎不能将基因转移至其中的细胞，例如包括造血干细胞的血液细胞和造血细胞以及包括粘膜上皮细胞的粘膜细胞。本发明的病毒载体作为基因治疗的载体非常有用。
文档编号C12N15/867GK1444650SQ01813585
公开日2003年9月24日 申请日期2001年6月1日 优先权日2000年6月1日
发明者米满吉和, 中岛俊洋, 中丸健治, 小林雅典, 长谷川护, 上田泰次, 饭田章博, 榊原裕幸 申请人:株式会社载体研究所