Neuritin蛋白活性片段及其表达系统和专用载体的制作方法

专利名称：：Neuritin蛋白活性片段及其表达系统和专用载体的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种Neuritin蛋白活性片段及其表达系统和专用载体。
背景技术：
：Neuritin是1993年由Nedivi发现(NediviE，Hev皿iD，NaotD，etal.NumerouscandidateplasticityrelatedgenesrevealedbydifferentialcDNAcloning.Nature[J]，1993，363(24):718-722)，与神经可塑性相关的神经营养因子(NaeveGS，RamakrishnanM，KramerR,.etal.Neuritin:Ageneinducedbyneuralactivityandneurotrophinsthatpromotesneuritogenesis.ProcNatlAcadSci[J]，1997，94(3):2648-2653)。Neuritin能促进胚胎期神经突起的生长及其分支和突触的发育成熟，调节突触回路的形成(DiGiovanniS，FadenAI，YakovlevA，el.Neuronalplasticityafterspinalcordinjury:identificationofageneclusterdrivingneuriteoutgrowth..[J]FASEBJ.，2005，19:153-154);并可抑制神经祖细胞的凋亡，维持神经元的存活(PutzU，HarwellC,NediviE.SolubleCPG15expressedduringearlydevelopmentrescuescorticalprogenitorsfromapoptosis.[J]NatureNeurosience，2005,8(3):322-332)。鉴于Neuritin在神经突触可塑性、保护受损神经元和促进神经再生过程中的重要的作用，其有望成为对神经病变和神经损伤进行治疗的潜在靶点。由于正常生理情况下，体内天然Neuritin的含量很低，提取与纯化比较困难，无法满足生物学功能研究和临床应用的需要，因此利用基因工程方法制备大量Neuritin重组蛋白，成为对Neuritin基础和功能研究的重要途径之一。动物、植物、微生物作为生物反应器，为外源基因的表达提供了理想的环境，是基因工程及生物制药研究和应用的重要内容。大肠杆菌被誉为外源蛋白质表达的"工厂"，特点如下1)具有易操作性、生长速度快、培养条件简单等优势，许多真核生物基因在大肠杆菌中可以表达；2)由于其表达出的蛋白质多以不溶解的包涵体形式存在，需要经过菌体破碎、变性及复性等过程，给后续的活性鉴定和功能研究带来了不便；3)不具有真核生物中mRNA翻译后修饰、加工的场所，表达的产物往往缺乏天然的生物结构或活性。哺乳类细胞、昆虫细胞表达系统的特点如下:1)克服了上述原核表达系统的不足，能够表达结构复杂的分泌性的真核细胞蛋白；2)操作复杂、表达水平低、产业化生产造价昂贵，不易广泛推广使用(HeckneyRC.TrendsBiotech，1994,12(11):456463)。酵母作为单细胞低等真核生物，特点如下1)具有原核生物易于培养、繁殖快、便于基因工程操作和高密度发酵等特性；2)具有真核生物基因产物正确折叠所需的细胞内环境和糖链加工系统；3)能分泌外源蛋白到培养液中，便于纯化(3BruelC，ChaK，ReevesPJ，etal.ProcNatlAcadSciUSA，2000，97(7):.30043009)。因此，近年来酵母在真核基因外源性表达中的应用越来越广泛。目前的酵母表达系统包括巴斯德毕赤酵母表达系统、酿酒酵母表达系统、乳酸克鲁维酵母表达系统、多型汉逊酵母表达系统。毕赤酵母表达系统是近10年来最成功的外源基因表达系统之一，到目前为止，已经有200多种外源蛋白在此系统中得到表达(华慧，周思翔，王正荣.外国外医学生物医学工程分册，2003.26(3):112H7)(朱剑昆，许志详，黄伟达，等.中国医学科学院学报,2001，23(2):12713D(马翻，王小宁，张智清，等.分子与细胞免疫学，2001，2:6165)(官孝群，王跃祥，吴良成，等.生物工程学报，2001，17(2):126130.)(阎锡蕴，汤健，刁爱坡.微生物学通报，2001，28(1):4852)。巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)是甲醇营养型酵母，在缺少葡萄糖的情况下，以甲醇作为唯一的碳源生长，利用甲醇诱导乙醇氧化酶启动子(AOX)的表达，在有乙醇氧化酶存在的条件下进一步催化甲醇的代谢，进行重组蛋白质的表达。与其他表达系统相比，巴斯德毕赤酵母有以下诸多方面的优点①在蛋白质诱导表达的过程中虽然以甲醇作为唯一的碳源，但不存在细菌、动物细胞培养中的内毒残留问题(Geoff，PLin，Cereghino，etal.'CurrentOpinioninBiotechnology，200213:329332)。②有A0X1和A0X2两个基因编码乙醇氧化酶，其中A0X1基因的表达主要受较高水平甲醇的诱导和调节，能大幅度提高外源蛋白的产量。③具有真核生物翻译后的糖基化修饰、折叠、加工和外分泌的环境，在表达蛋白质过程中有适度的糖基化修饰，使所表达的外源蛋白结构与构象更接近于天然蛋白(Geoff，PLin，Cereghino，etal.CurrentOpinioninBiotechnology,2002,13:329332)。④毕赤酵母表达系统中表达的糖蛋白，其糖链部分经高尔基复合体的进一步剪切后，不含a-1，3甘露糖，避免了酿酒酵母中的免疫原性问题，使表达的糖蛋白更适于治疗用途(熊爱生，彭日荷，李贤，等.生物化学与生物物理学4报，2003，35(2):154160)。⑤在毕赤酵母中表达的蛋白既可存在于胞内，又可分泌至细胞外，而且毕赤酵母自身分泌的蛋白(背景蛋白)非常少，有利于外源分泌蛋白的纯化。⑥许多大肠杆菌中不能表达的蛋白质在巴斯德毕赤酵母中可以得到有效表达，方便的操作和低廉的成本使其极具市场潜力。尽管应用巴斯《i毕赤酵母表达外源蛋白具有以上优势，但外源基因在表达过程中受基因内部结构、分泌信号、甲醇诱导的浓度及诱导时间、培养温度、启动子、表达环境的pH值等诸多因素的影响，使外源蛋白的表达随环境条件的变化不稳定，甚至一些蛋白的表达量会很低或不表达。因此对于某种蛋白质的表达需要根据具体情况，对表达的条件进行分析和优化。为提高外源性蛋白的表达量，许多学者分别从内在因素和外在条件进行了探索研究(张惠堂，颜志强，蔡兴锋，杨胜利，龚毅.人睫状神经营养因子在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达和生物活性测定.[J]中国生物化学与分子生物学报.2005，21(3):427430)(张朝春，梁伟锋，杨希才.神经营养素-3基因的人工合成及其在毕赤酵母中的分泌性表达.[J]微生物学报，2004，44(2):210-213)。影响毕赤酵母外源表达的因素主要有两方面一方面，外源基因序列本身的内在特性影响着表达量的高低，主要包括mRNA5'端非翻译区的序列和长度、A+T组成以及密码子的使用频率；另一方面，载体的选择(梁伟锋，张朝春，杨希才.一种多拷贝毕赤酵母表达载体的构建及人脑源性神经营养因子的表达.[J]微生物学报，2005，45(1):34-37)和培养条件也起着重要的作用。首先应考虑针对毕赤酵母的特点对发酵条件进行优化，包括(1)甲醇的浓度甲醇的浓度直接影响细胞的生长和蛋白质的表达。研究发现，不同的甲醇浓度导致不同的蛋白表达量。有报道,酵母中的外源蛋白在甲醇浓度为O.7%(体积百分比)的条件下即有一定的表达量，并且随甲醇的浓度的提高(<3%)其蛋白的表达量明显地提高。利用摇瓶诱导表达过程中甲醇容易挥发，浓度逐渐减少从而使蛋白的表达量下降，因此,诱导培养期间维持甲醇的浓度将直接关系到表达量多少。(2)诱导时间诱导时间影响表达量的高低，在诱导期间，分别在24hr、36hr、48hr、72hr、96hr取样分析，发现外源蛋白随着时间的延长表达量逐渐增加，诱导时间在3d5d蛋白表达最高，过长时间的诱导表达，外源蛋白有可能被降解。因此需要根据载体特点和蛋白质性质优化诱导时间以获得最大表达量。在应用巴斯德毕赤酵母表达突变型人白细胞介素-2的发酵条件中，甲醇浓度为1%，诱导时间2d时，表达产物量最高，为0.204g/L(刘堰，苏畅，胡应和等。巴斯德毕赤酵母表达的突变型人白细胞介素-2的发酵条件与纯化研究。[J]生物工程学报.2005，21(3):430-434)。
发明内容本发明的目的是提供一种Neuritin蛋白的活性片段及其表达系统和专用载体。本发明提供的Neuritin蛋白的活性片段，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的由序列2衍生的蛋白质。所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指将序列2的全序列中任何位点的氨基酸进行取代和/或缺失和/或添加。序列表中的序列2由87个氨基酸残基组成，是Neuritin蛋白(GenbankAccessionNumber:NP—057672.1)第28位至114位氨基酸残基。为了使(a)中的Neuritin蛋白的活性片段便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表l标签的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>上述(b)中的Neuritin蛋白的活性片段可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的Neuritin蛋白的活性片段的编码基因可通过将序列表中序列1自5'端第1至261位核苷酸所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。本发明还保护所述Neuritin蛋白的活性片段的编码基因。所述活性片段的编码基因可为如下l)或2)或3)的DNA分子1)其编码序列是序列表中序列1所示的DNA分子；2)在严格条件下与l)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；3)与l)或2)限定的DNA序列具有90。/。以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。序列表中的序列1由261个脱氧核糖核苷酸组成，是Neuritin蛋白的编码基因(GenbankAccessionNumber:丽—016588.2)自起始密码子起第82位至342位核苷酸，编码序列2所示的氨基酸序列。上述严格条件可为在6XSSC，0.5。/。SDS的溶液中，在65。C下杂交，然后用2XSSC，0.1%SDS和1XSSC，0.1%SDS各洗膜一次。含有所述基因的重组表达载体或表达盒也属于本发明的保护范围。所述重组表达载体具体可为在pPIC9K质粒的多克隆位点插入所述编码基因得到的。本发明还保护一种毕赤酵母重组菌，是含有所述重组表达载体的毕赤酵母。本发明还保护一种生产所述Neuritin蛋白的活性片段的方法，是培养所述的毕赤酵母重组菌，进行诱导表达，得到所述活性片段。所述诱导表达所用的试剂为甲醇。所述甲醇在所述毕赤酵母的培养液中的终浓度可为0.5%-2%(体积百分含量)，优选为1%(体积百分含量)。所述培养时间可为24小时以上，优选为96小时。本发明提供了一种Neuritin蛋白的活性片段及其编码基因，所述活性片段仅为Neuritin蛋白的部分序列，但具有原蛋白的活性。本发明构建了所述活性片段的毕赤酵母表达系统，获得了较高表达量的活性片段。本发明还对用所述毕赤酵母表达系统生产Neuritin蛋白的活性片段的培养条件进行了优化，发现诱导用甲醇在培养液中的终浓度为1%，培养96小时可以获得最高量的活性片段。应用本发明的毕赤酵母表达系统生产Neuritin蛋白的活性片段，操作简便，产率高，具有巨大的应用前景和社会意义。以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。图1为pPIC9K质粒图谱。图2为pPIC9K-neuritin(半长)重组转移载体的PCR鉴定结果。图3为pPIC9K-neuritin(半长)毕赤酵母重组子的PCR鉴定结果。图4为pPIC9K-neuritin(半长)毕赤酵母重组子诱导表达的SDS-PAGE鉴定结7果。图5为甲醇浓度与毕赤酵母重组子蛋白表达量的关系。图6为不同时间毕赤酵母重组子表达蛋白的SDS-PAGE鉴定结果图7为M+-NAT纯化后的表达蛋白的SDS-PAGE分析结果。图8为纯化后表达蛋白的Western-blot鉴定结果。图9为Neuritin蛋白的活性片段作用后的pcl2细胞。图10为Neuritin蛋白的活性片段作用后的鸡胚背根神经节。具体实施例方式下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中用到的试验材料如下UNIQ-10柱式PCR纯化试剂盒(购自上海生物工程公司，目录号SK1142);UNIQ-10柱式质粒抽提试剂盒(购自上海生物工程公司，目录号SK1191);限制性内切酶(购自Promega公司，目录号R6411);T4连接酶(购自Proraega公司，目录号M1051);TaqDNA聚合酶(购自Promega公司，目录号Q4100);DNAMarker(大连宝生物公司产品，目录号D501B);酵母提取物(购自Oxide公司，目录号B17594);胰蛋白胨(购自Oxide公司，目录号229705);酵母氮源(YNB)(购自Invitrogen公司，目录号Y2025);RPMI1640(购自Sigma公司，目录号10-401—TY4903);Trypsin(北京华美公司，目录号BE2189);胎牛血清(购自Hyclone公司，目录号SH30406.02);PVDF膜(Millipore公司，目录号IPVH00010);Neuritin单抗(购自R&D公司，目录号MAB283);羊抗鼠的IgG-HRP(购自Bio—Rad公司，目录号170-5047);化学发光检测试剂盒(购自Pierce公司，目录号34095);Ni-NAT纯化试剂盒(Novagen公司产品，目录号70239-3);鼠抗6XHis单抗(购自Novagen公司，目录号70796-4);其余常用生化类试剂购自上海生物工程公司。实施例1、毕赤酵母表达系统的构建一、转移载体的构建1、载体的选择选择质粒pPIC9K(Invitrogen公司，目录号V175-20)作为出发质粒。pPIC9K质粒的图谱见图l。pPIC9K是一种穿梭型质粒，既能在原核细胞中复制，又能在真核细胞中表达，使用较方便。pPIC9K全长9276bp，含有一个ColEl复制起始位点和A即及Kna抗性基8因。pPIC9K是分泌型表达载体，具有AOXl基因的调控元件和分泌信号肽a-因子的编码序列，表达产物分泌到毕赤酵母细胞外，可以直接从酵母培养上清液中纯化外源蛋白，大大简化了纯化操作。2、目的基因的克隆以Clontech公司的产品"MultipleTissuecDNAPanel"中的人脑组织cDNA作为模板，用如下引物PCR扩增Neuritin蛋白的编码基因的部分片段上游引物5，-TAGAATTCCATCATCATCATCATCATGCGGGCAAGTGCGATGC-3，；下游引物5，-ATGCGGCCGCTCAGCCGCTGCCGCAGAGTTCGAAT-3，。5'端引物依次添加了保护碱基、EcoRI限制性内切酶位点及6XHis序歹ij。3，端引物依次添加了保护碱基及其NotI限制性内切酶位点。将PCR产物进行测序，结果表明扩增得到的DNA片段如序列表的序列3所示，含有序列表的序列l所示的核苷酸序列，编码序列2所示的氨基酸序列。将PCR产物纯化。3、转移载体的构建将步骤2得到的PCR产物和pPIC9K质粒用EcoRI和NotI进行双酶切，然后将双酶切的PCR产物与双酶切的质粒纯化后连接，转化大肠杆菌DH5ct。挑阳性菌落，进行PCR鉴定，见图2。图2中，泳道l:DNAMarker;泳道2-7:PCR扩增产物；泳道8:阴性对照(PCR反应未加模板)。将PCR鉴定阳性的转化子抽提质粒测序。测序结果表明，获得了含有正确读框的Neuritin蛋白编码基因的部分序列，将该重组质粒命名为pPIC9K-neuritin(半长)。测序结果见序列表的序列3。二、表达系统的构建1、宿主的选择选毕赤酵母GS115(Invitrogen公司，目录号K1750-01)作为受体菌，GS115的表型为His-Mut+，pPIC9K表达质粒能通过同源重组整合到GS115的染色体基因组中。2、转化通过电激法，将pPIC9K-neuritin(半长)质粒转化入毕赤酵母GS115，涂布在MD选择平板(13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg/L生物素；20g/L葡萄糖；15g/L琼脂)，3(TC培养至菌落出现。3、含高拷贝目的基因的酵母重组菌的筛选9将上述转化MD板上的单菌落接种至96孔板中，连续2次传代后，各吸取10iU菌液加到含有0.25，0.5，1.0，L5，2.0，3.0，4.Omg/mlG418(Invitrogen公司，目录号PB10324)的YPD板(20g/L葡萄糖；20g/L蛋白胨；10g/L酵母提取物；20g/L琼脂)上，3CTC培养2-5d，至菌落出现。3d后含有0.25-1.0mg/mlG418的YPD板上，可见不同程度的菌落生长；1.5-4.Omg/mlG418的YPD板上未见菌落生长；继续培养至5d,1.5-4.Orag/mlG418的YPD板仍未见菌落生长。从1.0mg/mlG418的筛选板上，挑取单菌落提取基因组进行PCR分析验证，见图3。图3中，1:DNAMarker;泳道2:阴性对照(PCR反应未加模板)；泳道3-6:毕赤酵母重组子。由图可见，序列3所示的DNA片段已重组入毕赤酵母基因组中。得到毕赤酵母重组子，进行测序验证，测序结果表明，序列3所示的DNA片段完全、正确地整合入酵母基因组中。将pPIC9K空载体导入毕赤酵母GS115，方法同上，作为阴性对照。实施例2、Neuritin蛋白的活性片段的获得一、毕赤酵母重组菌的诱导表达将实施例1获得的测序结果正确的毕赤酵母重组菌接种至5mlYPD培养基(20g/L葡萄糖；20g/L蛋白胨；10g/L酵母提取物)中，3(TC诱导培养，每隔24小时补加甲醇，使其终浓度为0.5%(体积比)，在24h、48h、72h和96h各取样lml，收集上清做SDS-PAGE分析。电泳结果见图4。图4中，1:蛋白质Marker;2:未转化的酵母培养上清(72h);3:转化空载体的酵母培养上清(72h);4:转化pPIC9K-neuritin(半长)的酵母诱导前培养上清；5:转化pPIC9K-neuritin(半长)的酵母诱导24h的培养上清；6:转化pPIC9K-neuritin(半长)的酵母诱导48h的培养上清；7:转化pPIC9K-neuritin(半长)的酵母诱导72h的培养上清；8:转化pPIC9K-neuritin(半长)的酵母诱导96h的培养上清。结果显示转化pPIC9K-neuritin(半长)的酵母，甲醇诱导24h时即有表达产物出现，72-96h时表达量最高，且表达的Neuritin蛋白的活性片段以可溶性分子形式存在于酵母培养上清中。未转化质粒的酵母及转化空载体的酵母在诱导72h时，均未检测到Neuritin蛋白的活性片段。在甲醇诱导的条件下，毕赤酵母重组菌可以有效表达Neuritin蛋白的活性片段。10二、毕赤酵母表达系统诱导条件的优化参照Invitrogen公司提供的酵母培养方法，对甲醇诱导浓度及诱导表达时间进行优化。1、甲醇诱导浓度的优化将实施例l获得的测序结果正确的酵母重组菌，摇瓶培养，设置以下4种不同的处理，每个处理设置3个重复处理l:每隔24h补加甲醇，使其终浓度为0.5%(体积比)；处理2:每隔24h补加甲醇，使其终浓度为1%(体积比)；处理3:每隔24h补加甲醇，使其终浓度为1.5%(体积比)；处理4:每隔24h补加甲醇，使其终浓度为2%(体积比)。以上4种处理采取相同的培养条件，诱导培养72h，取上清液测定总蛋白含量和目的蛋白含量，结果见图5和表2。表2不同处理的蛋白表达量处理l处理2处理3处理4总蛋白含量(mg/mL)0.110.200.180.13目的蛋白含量(mg/mL)0.050.1320.110.06目的蛋白占总蛋白的质量份45.7%66.0%60.1%48.0%结果显示当甲醇浓度为1%时，目的蛋白表达量最大，酵母菌密度最高。因此毕赤酵母表达Neuritin蛋白的活性片段的最佳甲醇诱导浓度为P/。(体积比)。2、诱导表达时间的优化将实施例l获得的测序结果正确的酵母重组菌，摇瓶培养，每隔24h补加甲醇使其终浓度为l。/o(体积比)。分别于诱导后24h、48h、72h和96h取上清液，进行SDS-PAGE。结果见图6，图6中，M:marker;1:诱导24h;2:诱导48h;3:诱导72h;4:诱导96h。结果显示，1%(体积比)甲醇诱导表达96小时Neuritin蛋白的活性片段的表达量最咼。实施例3、Neuritin蛋白的活性片段的纯化将实施例l获得的测序结果正确的酵母重组菌，摇瓶培养，每隔24h补加甲醇使其终浓度为1%(体积比)，培养96小时后取上清液按下列步骤进行纯化。111、盐析采用了硫酸铵盐析法对表达产物进行浓縮。在上清液中加入硫酸铵，至其终浓度为55%(每100mL溶液中含有55克硫酸铵)，充分混匀，4。C沉淀过夜，离心后获得蛋白质沉淀。2、亲和层析鉴于表达蛋白的N端融合有6XHis-tag，选择高亲合力的Ni-NTA亲和层析法进行纯化(张惠堂，颜志强，蔡兴锋，杨胜利，龚毅.人睫状神经营养因子在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达和生物活性测定.[J]中国生物化学与分子生物学报.2005，21(3):427430)(张朝春，梁伟锋，杨希才.神经营养素-3基因的人工合成及其在毕赤酵母中的分泌性表达.[J]微生物学报，2004，44(2):210-213)(梁伟锋，张朝春，杨希才.一种多拷贝毕赤酵母表达载体的构建及人脑源性神经营养因子的表达.[J]微生物学报，2005，45(1):34-37)。将盐析得到的蛋白质沉淀用上样液溶解后进行Ni-NTA亲和层析，得到纯化表达的蛋白。3、透析将纯化后的蛋白液放入透析袋中进行透析，以除去盐析时的硫酸铵和亲和层析洗脱液中的咪唑。4、纯化蛋白的分析鉴定留取上述步骤3得到的样品进行SDS—PAGE分析和Western-blot鉴定。SDS-PAGE分析结果见图7，图7中，1:甲醇未诱导酵母培养上清；2:1%甲醇诱导96h酵母培养上清；3:镍柱亲和层析样品bindbuffer洗脱液；4:镍柱亲和层析样品washbuffer洗脱液；5:镍柱亲和层析后的elutionbuffer;M:Marker。结果显示甲醇诱导96h的培养上清和镍柱亲和层析后的Elutionbuffer中均有目的蛋白的表达，而甲醇未诱导表达的培养上清、亲和层析的Bindbuffer和Washbuffer洗脱液中均未见目的蛋白的表达，表明表达产物经过镍柱亲和层析后得到了有效的纯化。Western-blot鉴定结果见图8，图8中，1:1%甲醇诱导96h的酵母培养上清；2:镍柱亲和层析纯化后表达产物；3:透析浓縮后表达产物。结果显示表达产物、纯化后的表达产物、透析浓縮后的产物均可见Neuritin蛋白特异性的杂交条带，证实表达产物确为Neuritin蛋白的活性片段，且得到了有效的纯化和浓縮。5、浓縮透析后的纯化蛋白液先用PEG2000进行浓縮，然后采用冷冻干燥技术获得Neuritin蛋白的活性片段的干粉。实施例4、Neuritin蛋白的活性片段的活性鉴定目前研究神经营养因子的生物学活性的方法很多(董跃伟，徐天瑞，熊郁良.中华眼镜蛇毒神经生长因子对鸡胚背根神经节及PC12细胞作用的观察[J].云南医药，2000，21(1):6-9)(张广献，祝其锋.NGF诱导PC12细胞分化的研究.生物学杂志[J].2002，19(4):14-15)(HiroshiN，KimihikoT，HisanoriL,etal.Balanceoftwosecretutionpathwaysofnevergrowthfactoerinpcl2cellschangesduringtheprogressionoftheirdifferentitation[J"].Neurosci.2000，59:632-642)(LeeKH，JeihRyuC,JeongHongH，etal.cDNAMicroarrayAnalysisofNerveGrowthFactor-RegulatedGeneExpressionProfileinRatPC12Cells[J].NeurochemicalResearch.2005,(30):533-540)(RobinsonM;BuBelloA;DaviesAM.ParacrineinteractionsofBDNFinvolvingNGFdependentembryonicsensoryneurons[J].CellNeurosci.1996,7(2):143-149)。以下分别从细胞和组织水平对Neuritin蛋白的神经生物学功能进行研究。一、Neuritin蛋白的活性片段对体外培养的PC12细胞的影响PC12细胞(中科院上海细胞所)是大鼠肾上腺髓质瘤移植出的一种肿瘤细胞，因其在培养过程中具有易获得性和细胞均一性的特点，已成为神经科学离体研究中的重要工具(杨浩，王春婷，于玲，等.稳定表达人CNTF诱导PC12细胞分化作用的研究[J].脑与神经疾病杂志，2003,11(1):4-8)。通常情况下PC12细胞作为一种儿茶酚胺细胞，表现出增殖细胞的一些特性；当用神经营养因子处理后，其可分化为交感神经元样细胞，表现出神经细胞的表型，在行态、生理、生化等方面接近于神经元(刘建辉，姜波，包永明，等.菟丝子提取物在PC12细胞株中的神经营养因子样活性[J].生物化学与生物物理进展，2003，30(2):226-230)(王丽梅，魏传垠，陈雪红，等.大鼠GDNF基因的克隆表达及对PC12工程细胞的影响[J].基础医学与临床，2003，23(3):263—268)(Levi—MontalciniR，MeyerH，HamburgerV.Invitroexperimentsontheeffectsofmousesarcomasandonthespinalandsympatheticgangliaofthechickerabryo[J"].CancerResearch.1954，14(1):49-57)。因此PC12细胞是目前广泛用来研究神经细胞功能、分化和凋亡的一种组织细胞培养模型。用实施例3得到的Neuritin蛋白的活性片段处理PC12细胞；用BSA处理PC12细胞，作为阴性对照。具体操作如下取对数生长期PC12细胞，按细胞密度为6X10MVml接种至96孔板中，每孔总液体量为125wl。实验设2组阴性对照组和实验组。每组设5个孔。阴性对照组加入BSA，终浓度为20yg/ml;实验组加入Neuritin蛋白的活性片段，终浓度为20ng/ml。培养48h后，给细胞换液。继续37T:培养箱中培养。细胞培养72h后，观察不同处理的细胞形态。见图9。图9中，A:Neuritin蛋白的活性片段处理的PC12细胞；B:阴性对照。实验结果表明培养第3天，BSA对照组的PC12细胞呈小圆型，且无突起生长；Neuritin处理组的PC12细胞胞体较大，有较长而密的突起长出，且部分突起交织成网状，出现类神经元样改变。二、Neuritin蛋白的活性片段对体外培养的鸡胚背根神经节的影响鸡胚背根神经节培养法是测定神经营养因子体外生物学活性的一种经典方法(FukuzonoS，FujimoriK，ShiraizuN.ProductionofbiologicallyactivematurebrainderivedneurotrophicfactorinEscherichiacoli[J].BiosciBiotechnolBiochem.1995，59(9):1727-1732)(MuX，SiloSantiago,Carroetal.Neurotrophinreceptorgenesareexpressedindistinctpatternsindevelopingdorsalrootganglia[J].Neurosci.1993，13:4029-4036)。该方法具有来源广泛、价格低廉、操作方法简便、结果直观且易于观察等优点，因此得到广泛的应用。本实验通过鸡胚背根神经节培养法探讨Neuritin蛋白的活性片段是否具有促进神经突起生长和延长神经元存活时间的作用。用实施例3得到的Neuritin蛋白的活性片段处理鸡胚背根神经节；用BSA处理鸡胚背根神经节，作为阴性对照。具体操作如下取孵化8天的受精鸡蛋，在解剖显微镜下挑取神经节，置于多聚赖氨酸包被的96孔培养板中，每孔中保证有2-3个完整的神经节。培养基为1.5。/Q胎牛血清RPMI1640，每孔总液体量为200ul。实验设为2组阴性对照组和实验组。每组设6个孔。阴性对照组加入BSA，终浓度20ug/ml;实验组加入Neuritin蛋白的活性片段，终浓度为20"g/ml。将神经节置于37。C培养箱中培养2-4d，培养3天后观察并比较2组神经节的神经纤维生长情况。结果见图IO。图10中，A为Neuritin蛋白的活性片段处理的鸡胚背根神经节；B为阴性对照。实验结果显示与阴性对照相比，Neuritin蛋白的活性片段具有良好的神经生物学活性，能促进鸡胚背根神经节神经纤维的生长，延长其存活时间。序列表<110>石河子大学〈120>Neuritin蛋白活性片段及其表达系统和专用载体<130〉CGGNARY81953〈160>3〈210>1〈211〉261〈212〉DNA〈213〉人属人(/fo卿s邵ie/Ls)<400>1gcgggcaagtgcgatgcggtcttcaagggcttttcggactgtttgctcaagctgggcgac60agcatggccaactacccgcagggcctggacgacaagacgaacatcaagaccgtgtgcaca120tactgggaggatttccacagctgcacggtcacagcccttacggattgccaggaaggggcg180a33g3t3tgtggg3t犯3Ctg3g3aa3g33tCC33333CCtC33C3tCC2L3ggC3gCtt3240ttcgaactctgcggcagcggc261<210>2〈211〉87<212〉PRT〈213>人属人(/fo膨s邵j'e/50<400〉2AlaGlyLysCysAspAlaValPheLysGlyPheSerAspCysLeuLeu15101516<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>权利要求1、Neuritin蛋白的活性片段，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的由序列2衍生的蛋白质。2、权利要求l所述活性片段的编码基因。3、根据权利要求2所述的基因，其特征在于所述活性片段的编码基因为如下1)或2)或3)的DNA分子1)其编码序列是序列表中序列1所示的DNA分子；2)在严格条件下与l)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；3)与l)或2)限定的DNA序列具有90。/q以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。4、含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体或表达盒。5、如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于:所述重组表达载体是在pPIC9K质粒的多克隆位点插入权利要求2或3所述基因得到的。6、毕赤酵母重组菌，是含有权利要求4或5所述重组表达载体的毕赤酵母。7、生产权利要求1所述活性片段的方法，是培养权利要求6所述的毕赤酵母重组菌，进行诱导表达，得到权利要求1所述活性片段。8、如权利要求7所述的方法，其特征在于所述诱导表达所用的试剂为甲醇。9、如权利要求8所述的方法，其特征在于所述甲醇在所述毕赤酵母的培养液中的终浓度为0.5%-2%(体积百分含量)，优选为1%(体积百分含量)。10、如权利要求9所述的方法，其特征在于所述培养时间为24小时以上，优选96小时。全文摘要本发明公开了一种Neuritin蛋白活性片段及其表达系统和专用载体。本发明的活性片段是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的由序列2衍生的蛋白质。本发明还提供了含所述活性片段的重组质粒和含有该重组质粒的毕赤酵母重组菌。培养所述毕赤酵母重组菌，进行诱导表达可得到所述活性片段。所述活性片段仅为Neuritin蛋白的部分序列，但具有原蛋白的活性。应用本发明的毕赤酵母表达系统生产Neuritin蛋白的活性片段，操作简便、产率高，具有巨大的应用前景和社会意义。文档编号C07K14/47GK101481413SQ20081022734公开日2009年7月15日申请日期2008年11月26日优先权日2008年11月26日发明者娜于,仙玲玲,崔丽娟,峤张,张树军,李新丽,磊杨,倩王,星罗,瑾黄,黎兴毅申请人:石河子大学