Pcna融合蛋白及表达方法和生物素化方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医药生物领域，特别是涉及一种PCNA融合蛋白及表达方法和生物素化 方法。
【背景技术】
[0002] 1978年，Miyachi等在系统性红斑狼疮患者的血清中发现了一种只存在于增殖性 细胞(正常增殖细胞及肿瘤细胞）的抗原，并将其命名为增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen，简称PCNA)。以后的研究发现PCNA与细胞增殖的启动密切相关，是 反映细胞增殖状态的良好指标，因此近年来掀起了对PCNA研究的热潮，尤其在肿瘤方面。
[0003] PCNA作为细胞异常增殖的关键蛋白与临床研究紧密相关。国内外在多种肿瘤疾病 中进行了PCNA的研究，涉及PCNA与肿瘤发生发展、分级、分期、放疗敏感性、预后、复发和转 移、死亡原因、肿瘤标志物等各个方面的相关性。研究结果显示:在常见的胃癌、肺癌、肝癌 等疾病中都有PCNA的异常表达。除此之外，也有研究表明某些细胞增殖性疾病的发生和发 展也与PCNA相关，如:类风湿性关节炎中滑膜细胞、老年核性白内障和皮质性白内障晶体上 皮细胞及动脉粥样硬化中血管平滑肌细胞的异常增殖。
【发明内容】
[0004] 本发明主要解决的技术问题是提供一种PCNA融合蛋白及表达方法和生物素化方 法，该融合蛋白涵盖了人PCNA的主要抗原表位，采用BirA活化生物素形成生物素酰-5'-腺 苷酸，将生物素特异地转移到PCNA-Avi tag上，反应条件温和且标记的专一性极高。每一个 AviTag仅可以加入一个生物素分子，对整个蛋白的活性和功能影响很小，因此本方法特别 适合用于抗原的生物素化。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是:提供一种PCNA融合蛋白，所 述PCNA融合蛋白的序列为Seq No. 1，所述序列包括849个碱基，共编码283个氨基酸，所述编 码序列中前261个氨基酸为PCNA序列。
[0006] 提供一种PCNA融合蛋白的表达方法，包括步骤为： (1)对PCNA基因进行PCR扩增得到PCR产物，上游引物包括BamH I序列，下游引物包括 Xho I序列； (2 )分别对PCR产物和表达载体pET-22b (+)用限制性内切酶进行酶切，酶切后的所述 PCR产物和所述表达载体连接得到连接产物，所述限制性内切酶为BamH I和Xho I; (3) 将所述连接产物转化入E. coli DH5a感受态细胞中，并于培养基上进行培养得到 阳性质粒； (4) 将所述阳性质粒转入E.coli BL21感受态细胞中，并于培养基上培养得到阳性菌 种，并对所述阳性菌种进行诱导培养； (5) 对所述诱导培养后的阳性菌种纯化，得到PCNA融合蛋白。
[0007] 在本发明一个较佳实施例中，步骤（1 )中所述上游引物为5 ' - CGGATCCGATGTTCGAGGCGC-3 '，所述下游引物为5 ' -CTCGAGAGAGCCTTAGTGCCA-3 '。
[0008] 在本发明一个较佳实施例中，步骤(3)中所述连接产物转化入细胞中是通过热激 法实现的；步骤(3)中所述细胞涂布于含40yg/mL氨苄青霉素的LB固体琼脂培养基上，挑取 单菌落接种至含有40yg/mL氨苄青霉素的LB液体琼脂培养基中培养;步骤(3)中所述培养过 夜，提取质粒后进行双酶切，鉴定并筛选得到阳性质粒。
[0009] 在本发明一个较佳实施例中，步骤(4)中所述阳性质粒转入细胞中是通过热激法 实现的；步骤(4)中所述细胞涂布于含40yg/mL氨苄青霉素的LB固体琼脂培养基上，在37°C 下培养16小时，挑取单菌落接种至含有40yg/mL氨苄青霉素的LB液体琼脂培养基中培养;步 骤(4)中所述培养为过夜培养，培养后提取质粒，双酶切，筛选得到阳性菌种。
[0010]在本发明一个较佳实施例中，步骤(4)中对所述阳性菌种进行诱导培养的步骤为： 将所述阳性菌种转接至含有40 yg/mL氨苄青霉素的LB液体琼脂培养基中培养，并加入IPTG 进行诱导表达优化，诱导培养温度为20-37°C。
[0011] 在本发明一个较佳实施例中，步骤(5)中所述诱导培养后的阳性菌种先进行离心 并超声破碎，再用Binding Buffer平衡好的Ni-NTA Agarose亲和层析柱纯化。
[0012] 提供一种PCNA融合蛋白的生物素化方法，包括步骤为：向N，N-二羟乙基甘氨酸溶 液中加入PCNA融合蛋白、生物素连接酶、三磷酸腺苷、乙酸镁和生物素混匀孵育，去除游离 生物素得到生物素化的PCNA融合蛋白。
[0013] 在本发明一个较佳实施例中，所述孵育是在30°C下孵育1小时，所述去除游离生物 素是在超滤管中进行的。
[0014] 在本发明一个较佳实施例中，所述生物素化的PCNA融合蛋白是包被于ELISA板上， 通过Streptavidin-HRP二抗进行检测判断。
[0015] 本发明的有益效果是:本发明的PCNA融合蛋白及表达方法和生物素化方法，得到 的PCNA融合蛋白能够特异性偶联生物素，其氨基酸序列包含人PCNA，同时在C末端带有一段 序列标签-AviTag。几乎所有的蛋白质都可以在一个独特的Avi-tag位点轻易且有效地被生 物素化，该方法不会对蛋白的抗原活性产生影响。
【附图说明】
[0016] 为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使 用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于 本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它 的附图，其中： 图1是本发明实施例二中PCNA融合蛋白质粒图； 图2是本发明实施例二中PCNA融合蛋白质粒酶切鉴定图； 图3是本发明实施例三中PCNA的表达和纯化图，图中BI为诱导前，M为Marker，AI为诱 导后，S为上清，P为沉淀，FT为穿透，E1-E6为不同管收集的洗脱产物。
【具体实施方式】
[0017] 下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施 例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通 技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范 围。
[0018] 实施例一： PCNA cDNA基因的人工合成： 根据GenBank已公开的人PCNA cDNA序列(GenBank序列登录号:BC000491.2)，在该序列 开放阅读框(Open Reading Frame，0RF)的3'端终止密码子之前添加能够翻译AviTag的基 因序列。
[0019] AviTag的基因序列： CTGAACGATATTTTCGAAGCTCAGAAAATCGAATGGCACGAAGGCTCTo
[0020] 实施例二： PCNA融合蛋白的表达 (一)实验材料： 1、菌株与载体：大肠杆菌E.coli DH5a和BL 21a购自Invitrogen公司。载体pET_22b (+)购自No vangen公司。
[0021 ] 2、酶与试剂:DNA聚合酶、限制性内切酶、T4连接酶为NEB公司产品。
[0022] 3、生化试剂：IPTG为Sigma公司产品。过硫酸铵、TEMED、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、 低熔点琼脂糖为Bio-Rad公司产品。氨苄青霉素购自上海生物工程有限公司。Bir A购自 Epigen Biotech公司，Streptavidin-HRP 二抗购自Thermo Fisher公司。限制性内切酶 (BamH I和Xho I)购于New England Biotech公司。
[0023] 4、培养基:大肠杆菌培养基为LB，所述LB包括质量分数为1%的蛋白胨、质量分数为 0.5%的酵母提取物、质量分数为1%的NaCl，pH值为7.0。
[0024] (二)实施步骤： 1、人工合成目的基因序列之后，进行PCR反应得到PCR产物。
[0025] 2、上游引物：5，_ CGGATCCGATGTTCGAGGCGC -3，。
[0026] 3、下游引物：5，_ CTCGAGAGAGCCTTAGTGCCA -3'。
[0027] 4、回收PCR产物，并将PCR产物和表达载体pET-22b( + )经过BamH I/Xho I双酶切， 所述PCR产物形成粘性末端，二者16°C过夜连接得到连接产物。所述连接产物通过热激法转 化入E. col i DH5a感受态细胞中，涂布于含40yg/mL氨苄青霉素的LB固体琼脂培养基上，培 养过夜，挑取单菌落接种至含有40yg/mL氨苄青霉素的LB液体琼脂培养基中，培养过夜，提 取质粒，双酶切，鉴定并筛选阳性质