专利名称：同时检测miRNAs与蛋白标记物的硅纳米线芯片及其检测方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物分子检测领域，特别涉及一种同时检测miRNAs与蛋白标记物的硅纳米线芯片及其制备方法、检测方法及应用。
背景技术：
目前，心血管病是威胁人类健康的常见病高发病，而急性心肌梗塞则因为发病迅猛、致死率及致残率高，给社会及患者家庭造成极大负担。如果要降低急性心肌梗塞的危害，早期诊断、针对性治疗以及根据病程进展调整用药等是必不可少的环节，而检测及监控某些生物标记物显然有助于这几方面的实施。除了目前临床上常用的几种蛋白标记物 cTnT、cTnI、CK-MM和CK-MB，近年来微小核糖核酸(microRNAs，miRNAs)被认为是很有应用前景的生物标记物。
按2000年欧洲心脏病学会和美国心脏病学会对心机梗死的定义，急性、演变中或新近心肌梗死诊断条件具备下列任何条件之一心肌生化标志的典型升高和逐渐下降 (cTnT或cTnl)或较快增高和下降(CK-MB)，至少伴有下列情况之一者心肌缺血症状；心电图出现病理性Q波；心电图示心肌缺血(ST段抬高或压低)；冠心动脉介入术(如冠状动脉成形术)。但即使是目前国际上通行诊断金标准cTn通常在心肌损伤4-8小时后升高，因而建议如果在入院时(有心肌缺血症状约I小时)检测cTn水平未升高，则需在6-9小时后再次抽血检测，甚至需要在12-24小时后第三次检测。因而如果要早期诊断急性心梗，需要检测一些更早期即出现显著性变化的分子标记物。近年未有研究显示某些miRNAs可在急性心梗后早期出现变化，提示了 miRNAs作为诊断指标的可能性。例如D’ Alessandra等人采集了 33例急性心肌梗死患者的血衆,TaqMan Human MicroRNA A and B Arrays筛选急性心梗后8倍以上变化的miRNAs并用实时定量PCR验证，最后选择了 6个miRNAs进一步研究。结果发现急性心梗后3小时内即有miRNAs升高，其中miR-1，miR-133a, miR-133b, miR-122和miR-375的峰值比目前诊断用的“金标准”心肌肌I丐蛋白(cardiac troponin, cTn)更早出现。Wang等人则针对性选择了肌肉富含的miR-1、miR-133a、miR_499和心肌特异性的miR-208a进行研究。在结扎法大鼠AMI模型中，miR_208a在术后I小时即显著升高。而在临床病例中，AMI (33例)患者这四种血浆miRNAs比健康对照(30例)、非AMI型冠心病(16例)以及其它心血管病(17例)都明显升高。更重要的是miR-208a在非AMI 患者中不能检测到，而在AMI病例症状发生4小时后可100%检测到。之后有更多研究报道 miR-1、miR-133、miR-328、miR-499_5p等对于AMI的诊断价值。因为miRNAs变化出现更早，而且miRNAs本身也比较稳定，因而用miRNAs作为AMI诊断指标是相当有前景的。
微小RNAs (microRNAs,简称miRNAs)是一类非编码的RNA分子，长度在18-25核苷酸。近年来miRNAs对各种疾病的诊断价值越来越受到重视。虽然随着现代芯片技术的应用，可以灵敏地检测出在疾病中miRNAs表达谱的变化。然而其检测仍然存在以下缺陷检测样品需经繁琐的步骤处理，包括细胞、组织或血液样品中总RNA的富集抽提及纯化，而后经反转录成cDNA，某些情况下还需PCR扩增，方可上样检测。而究其根本原因，则在于细胞、 组织或血样中miRNAs含量很低，经常在pM-fM级，超出目前的检测方法的极限低值。而且生物样品中的其它复杂成分，例如糖、脂质、金属离子、大分子蛋白质等，也会干扰目标miRNA 与探针的结合，从而对检测的灵敏度和特异性产生重大影响。繁琐的前期处理过程是目前制约生物芯片在临床大规模使用的瓶颈之一。
最近的基于纳米技术的场效应F E T的硅纳米线阵列(SiNW)芯片则有望通过提高检测灵敏度解决这个难题。以SiNW结构为核心，采用场效应晶体管实现信号采集和放大，能够更有效检测目标信号。此种芯片具有灵敏度高、检测速度快、易于集成与高通量检测的优点。因此，本发明不仅解决硅纳米线阵列保存应用中存在的容易受污染问题，且使其在生物检测中，即使待测组份本体液的呈现多样性的情况下，也同样可以使芯片面对Na、K、 Fe、Cu和Ca等离子的扩散污染的考验以及PH值等多种化学因素的影响，即实现了检测的高稳定性。发明内容
本发明克服现有技术的以上缺陷，提出一种用于同时检测miRNAs与蛋白标记物的硅纳米线芯片，可用于同时检测复杂生物样品中miRNAs和蛋白标记物，从而早期诊断急性心梗相关的miRNAs标记物。
本发明提供一种同时检测miRNAs与蛋白标记物的硅纳米线芯片，所述芯片包括: 至少一种单链DNA探针在硅纳米线阵列中的集成排布，以及蛋白标记物抗体在硅纳米线阵列中的集成排布。
本发明中，所述单链DNA探针包括针对特定miRNAs的完全匹配探针、单碱基不匹配探针、阴性对照探针、线虫cel-39探针。
本发明中，所述针对特定miRNAs 探针包括 miR-1、miR_133a、miR-145、miR_146a、 miR-206、miR_208a、miR-21、miR_29a、miR-499 探针。
本发明中，所述蛋白标记物抗体包括针对cTnT、cTnl、CK-MM、CK-MB的特异性抗体、阴性对照抗体、牛血清白蛋白抗体。
本发明硅纳米线生物检测芯片包括半导体衬底、生长在半导体衬底上的二氧化硅隔离层、生长在二氧化硅隔离层上的多晶硅层、和生长在多晶硅层上的钝化层；其中，多晶硅层中包括图形化形成的硅纳米线阵列；钝化层的结构为从下至上依次包括SiON层、TaN 层和Ta2O5层，且TaN/Ta205层仅覆盖于硅纳米线阵列中各硅纳米线的表面和侧壁。
本发明硅纳米线生物检测芯片中，所述二氧化硅隔离层的厚度为1000 A- 5000 Ac 所述多晶硅层厚度为5<) Α-Ι000 A。所述硅纳米线的线宽范围为5nm 130nm;其厚度为 5nm IOOnm。所述SiON层的厚度为10 A- 50 A;所述TaN层的厚度为10 A 50 A;所述Ta205 层的厚度为10人 50 A。
本发明还提供一种用于同时检测miRNAs与蛋白标记物的硅纳米线芯片的制备方法，包括如下步骤
步骤SOl :提供半导体衬底；
步骤S02 :在所述半导体衬底上生长二氧化硅隔离层；
步骤S03 :在所述二氧化硅隔离层上生长多晶硅层；
步骤S04 :图形化所述多晶硅层以形成硅纳米线阵列；
步骤S05 :在所述硅纳米线阵列上生长一定厚度的钝化层，其中，所述钝化层结构从上至下依次包括SiON层和TaN/Ta205层；
步骤S06 :去除硅纳米线阵列中各硅纳米线之间的TaN/Ta205层。
本发明制备方法中，所述步骤S02中的所述二氧化硅隔离层生长工艺为湿氧氧化工艺。
本发明制备方法中，所述步骤S04中的形成硅纳米线阵列是通过等离子干法刻蚀工艺完成的。
本发明制备方法中，所述步骤S05中的SiON层是通过热氧化法在硅纳米线阵列表面生长形成，所述TaN/Ta205层是通过原子层淀积工艺生长形成的。
本发明制备方法中，所述步骤S06中的去除工艺是采用等离子干法刻蚀工艺。
本发明还提供了一种同时检测miRNAs与蛋白标记物的方法，利用如权利要求I所述的用于同时检测miRNAs与蛋白标记物的娃纳米线芯片,对急性心肌梗塞相关miRNAs与蛋白标记物进行检测，包括如下步骤
I)每一条硅纳米线在上样前检测0-5V (梯度O. IV)电压下的电流值；
2)每一条硅纳米线在上样后检测0-5V (梯度O. IV)电压下的电流值；
3)根据电压电流比计算每一条硅纳米线在上样前后的电阻值；
4)每一条硅纳米线在上样前后的电阻值比作为有效参数；
5)预先获得在同批硅纳米线芯片上多种miRNAs及蛋白标记物的不同浓度标准曲线，即取O-IM浓度范围内多个点与电阻值比作6)每次测定的电阻值比与特定miRNA及蛋白标记物的标准曲线比对，得到待测样品的特定miRNA及蛋白标记物的浓度。
本发明还提供了一种所述同时检测miRNAs与蛋白标记物的硅纳米线芯片在检测急性心肌梗塞相关miRNAs与蛋白标记物中的应用。
本发明应用的一具体例中，取血浆样品(例如，200uL)与修饰在不同硅纳米线表面的单链DNA探针或抗体结合，导致上样前后每条硅纳米线的电阻发生变化。由于每一条硅纳米线修饰了针对不同miRNA的探针或针对不同蛋白标记物的抗体，通过分析电阻的变化，对比标准曲线，可以得到每一种特定miRNA或蛋白标记物的浓度绝对值。每一种指标超出正常范围即被视为异常。
本发明涉及一种微小核糖核酸(microRNAs, miRNAs)与蛋白标记物联合诊断急性心肌梗塞(acute myocardial infarction, AMI)相关标志物的娃纳米线芯片，其目的在于利用一张硅纳米线集成芯片同时快速检测血浆样品中某些特定miRNAs(例如，miR-1、 miR-133a、miR-145、miR_146a、miR-206、miR_208a、miR-21、miR_29a、miR-499 等)以及目前临床上常用的蛋白标记物(包括心肌肌I丐蛋白T(cardiac troponin T简称cTnT)、心肌肌隹丐蛋白I (cardiactroponin I简称cTnl)、肌酸激酶肌肉型(creatine kinase MM简称 CK-MM)、肌酸激酶肌肉型杂化型(creatine kinase MB简称CK-MB))的浓度，从而判断某些特定miRNAs和蛋白标记物的量是否异常，进一步为诊断病人是否发生急性心肌梗塞提供参考。
本发明用于同时检测miRNAs与蛋白标记物的娃纳米线芯片，是多种单链DNA探针与特异性抗体在硅纳米线阵列中的集成排布。其中，DNA探针包含三大类1)用于做阴性对照的完全不匹配探针；2)用于检测样品内参的线虫cel-39探针；以及3)针对目标miRNAs 的探针。每类探针包含三组探针包括完全匹配探针以及2条单碱基不匹配探针，以去除非特异性结合的影响。蛋白标记物特异性抗体包含针对cTnT、cTnl、CK-MM和CK-MB的特异性抗体、空白对照、用于阴性对照的兔抗鼠抗体、以及用于检测样品内参的牛血清白蛋白 (BSA)抗体。
本发明硅纳米线生物检测芯片用于同时检测复杂生物样品中miRNAs和蛋白标记物。本发明硅纳米线芯片包括多种单链DNA探针在硅纳米线阵列中的集成排布；以及四种蛋白标记物cTnT、cTnl、CK-MM和CK-MB抗体在硅纳米线阵列中的集成排布。所选miRNAs 和蛋白标记物皆在急性心肌梗塞时相比较正常人的血浆有显著的增高，而不同的miRNAs 和蛋白标记物最早出现变化的时间段各不相同，通过联合检测，达到在较宽的时间窗内诊断急性心梗的目的。更重要的是，由于通常特定miRNAs的变化出现比蛋白标记物更早，本发明本发明硅纳米线生物检测芯片可用于实现早期(临床症状出现1-2小时后)诊断急性心梗的目的。
图I表明本发明硅纳米线芯片中探针及抗体的集成排布示意图。
图2表明以miR-1区为例的不同类探针的排布图。
图3表明以cTnT区为例的抗体的排布图。
图4表明本发明硅纳米线芯片的制备方法的示意图。
图5表明一条硅纳米线上样前后电压电流曲线图，显示上miRNA样后电阻增大。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点部被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、 条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识， 本发明没有特别限制内容。
图I-图3对本发明用于同时检测急性心梗miRNAs与蛋白标记物的硅纳米线芯片中的探针及抗体集成排布进行详细说明。图4对本发明硅纳米线芯片的制备方法进行详细说明。
本发明用于同时检测miRNAs与蛋白标记物的硅纳米线芯片，包括半导体衬底；生长在所述半导体衬底上的二氧化硅隔离层，其厚度为1000 A 5000 A;生长在所述二氧化硅隔离层上的多晶硅层，其厚度为50 A 1000 A;生长在所述多晶硅层上的钝化层，该钝化层结构从下至上依次包括SiON层、TaN/Ta205层。SiON层的厚度为10 A 50 A； TaN/Ta205层仅覆盖于所述硅纳米线阵列中各硅纳米线的表面和侧壁。TaN层的厚度为10 A 50 A； Ta2O5层的厚度为10人 50 Ai多晶硅层中包括图形化形成的硅纳米线阵列；硅纳米线的线宽范围为5nm 130nm ;娃纳米线的厚度为5nm lOOnm。
本发明实施例中，优选地，二氧化硅隔离层的厚度为2000A,多晶硅层的厚度为500A;Si()N层的厚度为10 A5TaN层的厚度为20 A； Ta2O5层的厚度为20 A;硅纳米线的线宽范围为20nm ;硅纳米线的厚度为50nm。
图I所示为本发明用于同时检测急性心梗miRNAs与蛋白标记物的硅纳米线芯片一具体实施例的结构示意图。本发明硅纳米线芯片包括一种或多种单链DNA探针在硅纳米线阵列中的集成排布，以及蛋白标记物抗体在硅纳米线阵列中的集成排布，如图I所示，其包括
I)目标 miRNA 区包含 miR-1 区、miR_133a 区、miR-145 区、miR_146a 区、miR-206 区、miR-208a 区、miR-21 区、miR_29a 区、miR-499 区等；
2)miRNA内参区即线虫Cel-39区；
3)miRNA阴性对照区即与所有miRNAs都有10个以上碱基不匹配的完全不匹配区；
4)目标蛋白标记物区包含cTnT区、cTnl区、CK-MM区和CK-MB区；
6)蛋白内参区为BSA区；
7)蛋白阴性对照区即与所有人源抗原都不能特异性结合的兔抗鼠抗体；
5)空白区此区的硅纳米线既不修饰探针也不修饰抗体，目的在于去除背景值的影响。
本发明用于同时检测急性心梗miRNAs与蛋白标记物的硅纳米线芯片结构与现有的芯片结构显著不同的是，现有的芯片仅在硅纳米线修饰抗体来检测常用的cTnT、CK-MM、 CK-MB指标，从未联合修饰多种miRNA的探针来检测在急性心梗早期即发生显著变化的 miRNAs指标。本发明中，由于miRNAs指标变化发生的时相较早(例如，本发明中选取的是 2小时即有显著升高的miRNAs)，使得本发明能达到检测出与早期急性心梗有关的miRNAs， 有助于作为早期诊断的判断指标。同时，在较晚的时相则能通过本发明检测到cTnT等蛋白指标的变化，有助于作为进一步确诊急性心梗的判断指标。
本发明所述硅纳米线芯片中，单链DNA探针可以是针对特定miRNAs的完全匹配探针，或单碱基不匹配探针、或阴性对照探针、或线虫cel-39探针。优选地,所述针对特定 miRNAs 探针包括 miR-1、miR_133a、miR-145、miR_146a、miR-206、miR_208a、miR-21、 miR-29a、miR-499探针。本发明一具体实施例的miRNAs区不同类探针的排布图，如图2所示。在本发明的一个实施例miR-1区，不同类探针的排布如下1)完全匹配探针每一个碱基都与目标miRNA互相匹配，此类探针重复修饰3-10条硅纳米线；2)单碱基不匹配探针 除一个碱基外，其余碱基都与目标miRNA互相匹配，此类探针2条，重复修饰3-10条硅纳米线。
本发明中，根据实验结果，在急性心梗2小时显著变化的miRNAs包括以下
升高mir_872、mir-136、mir-122、mir_l、mir-150、mir-434、mir-322、mir-335、 mir-484、mir-378、mir_144、mir_206、mir-145、mir_133a、mir-361、mir_106b、mir_18a、 mir_208a、mir-28、mir_29a、no-mir-16、mir-374、mir-320、mir_15b、mir_99b、mir-330、 mir-350、mir-342、mir-146a、mir-152、mir-24-l、mir-24-2、mir-451、mir-146b、mir-505、 mir-21、mir-93、mir_450a、mir-101b、mir-10b、mir_200c、mir-24-2、mir_34b、mir_34c、 mir-96、mir-425、mir-101a、mir_98、mir_130a、mir_23b、mir_92b、mir_210、mir_140、 mir_133b、let_7d、mir_30e、mir_23a、mir—203、mir—429、mir_27a、mir_199a、mir_130b、mir-217、mir-652、mir_29c、mir_27b、mir_30a、mir-126、mir_30d、mir_200b、mir_148b、 mir-127、mir-127、mir_133a、mir_216a、mir-221、mir_28、mir_379、mir-455、mir_487b、 mir-499、mir-7a_l、mir-872 ；
降低mir-10a、mir-139、mir_328b、mir-365、let_7f_l、mir_135a、let_7f_2、 let_7a_2、mir-145、let_7a_l、mir-221、let_7c_2、let_7c_l、mir-132、let_7e、mir-212、 let_7b、let_7i、mir_135b、mir_181c、mir-187、mir_23a、mir-30c_l、mir-324、mir-338、 mir-351、mir-3545、mir-377、mir-421、mir-451、mir_708o
针对上述部分变化最显著的miRNAs，本发明设计的检测探针及序列如表I所示
表I :miRNAs的检测探针序列
权利要求
1.一种用于同时检测miRNAs与蛋白标记物的硅纳米线芯片，其特征在于，所述芯片包括至少一种单链DNA探针在硅纳米线阵列中的集成排布，以及蛋白标记物抗体在硅纳米线阵列中的集成排布。
2.如权利要求I所述的用于同时检测miRNAs与蛋白标记物的硅纳米线芯片，其特征在于，所述单链DNA探针包括针对miRNAs的完全匹配探针、单碱基不匹配探针、阴性对照探针、线虫cel-39探针。
3.如权利要求2所述的用于同时检测miRNAs与蛋白标记物的硅纳米线芯片，其特征在于，所述针对 miRNAs 探针包括 miR-1、miR_133a、miR-145、miR_146a、miR-206、miR_208a、miR-21、miR-29a、miR-499 探针。
4.如权利要求I所述的用于同时检测miRNAs与蛋白标记物的硅纳米线芯片，其特征在于，所述蛋白标记物抗体包括针对cTnT、cTnl、CK-MM、CK-MB的特异性抗体、阴性对照抗体、牛血清白蛋白抗体。
5.如权利要求I所述的用于同时检测miRNAs与蛋白标记物的硅纳米线芯片，其特征在于，所述芯片结构包括 半导体衬底； 二氧化硅隔离层，其生长在所述半导体衬底上； 多晶硅层，其生长在所述二氧化硅隔离层上；所述多晶硅层中包括图形化形成的硅纳米线阵列； 钝化层，其生长在所述多晶硅层上；所述钝化层结构从下至上依次包括SiON层、TaN/Ta2O5层；其中，所述TaN/Ta205层仅覆盖于所述硅纳米线阵列中各硅纳米线的表面和侧壁。
6.如权利要求5所述的硅纳米线芯片，其特征在于，所述二氧化硅隔离层的厚度为I000A 5000Ao
7.如权利要求5所述的硅纳米线芯片，其特征在于，所述多晶硅层厚度为50A-1000 Ad
8.如权利要求5所述的娃纳米线芯片,其特征在于,所述娃纳米线的线宽范围为5nm 130nm ;其厚度为5nm lOOnm。
9.如权利要求5所述的硅纳米线芯片，其特征在于，所述SiON层的厚度为10A 50 A；所述TaN层的厚度为10 A 50 A;所述Ta2O5层的厚度为10 A 50 A0
10.一种用于同时检测miRNAs与蛋白标记物的硅纳米线芯片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤 步骤SOI:提供半导体衬底； 步骤S02 :在所述半导体衬底上生长二氧化硅隔离层； 步骤S03 :在所述二氧化硅隔离层上生长多晶硅层； 步骤S04 :图形化所述多晶硅层以形成硅纳米线阵列； 步骤S05 :在所述硅纳米线阵列上生长钝化层，其中，所述钝化层结构从下至上依次包括 SiON 层和 TaN/Ta205 层； 步骤S06 :去除硅纳米线阵列中各硅纳米线之间的TaN层和Ta2O5层。
11.如权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S02中的所述二氧化硅隔离层生长工艺为湿氧氧化工艺。
12.如权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S04中的形成硅纳米线阵列是通过等离子干法刻蚀工艺完成的。
13.如权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S05中的SiON层是通过热氧化法在硅纳米线阵列表面生长形成，所述TaN/Ta205层是通过原子层淀积工艺生长形成的。
14.如权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S06中的去除工艺是采用等尚子干法刻蚀工艺。
15.一种利用如权利要求I所述的硅纳米线芯片同时检测miRNAs与蛋白标记物的检测方法，其特征在于 1)每一条硅纳米线在上样前检测0-5V(梯度O. IV)电压下的电流值； 2)每一条硅纳米线在上样后检测0-5V(梯度O.IV)电压下的电流值； 3)根据电压电流比计算每一条硅纳米线在上样前后的电阻值； 4)每一条硅纳米线在上样前后的电阻值比作为有效参数； 5)预先获得在同批硅纳米线芯片上多种miRNAs及蛋白标记物的不同浓度标准曲线，取O-IM浓度范围内多个点与电阻值比作图； 6)每次测定的电阻值比与特定miRNA及蛋白标记物的标准曲线比对，得到待测样品的特定miRNA及蛋白标记物的浓度。
16.如权利要求I所述的硅纳米线芯片在检测急性心肌梗塞miRNAs中的应用，其特征在于，所述硅纳米线芯片在急性心肌梗塞症状出现的I小时-72小时内检测到急性心肌梗塞miRNAs的变化。
全文摘要
本发明公开一种用于同时检测miRNAs与蛋白标记物的硅纳米线芯片，包括至少一种单链DNA探针在硅纳米线阵列中的集成排布以及蛋白标记物抗体在硅纳米线阵列中的集成排布。本发明还公开所述硅纳米线芯片的结构及制备工艺。本发明还公开所述硅纳米线芯片用于同时检测miRNAs与蛋白标记物的检测方法以及在检测急性心肌梗塞miRNAs中的应用。本发明实现快速同时检测急性心肌梗塞miRNAs与蛋白标记物，具有灵敏度高、检测速度快、易于集成、高通量、稳定性高、抗污染等优点。
文档编号G01N27/04GK102980920SQ20121045797
公开日2013年3月20日 申请日期2012年11月14日 优先权日2012年11月14日
发明者赵宇岚, 朱建军, 何靖, 蒋宾 申请人:华东师范大学, 上海集成电路研发中心有限公司