专利名称：一种生物素蛋白连接酶融合蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种生物素蛋白连接酶融合蛋白、基因、重组表达载体、转化体及其制备方法。
背景技术：
生物素蛋白连接酶(EC 6. 3. 4. 15)能活化生物素形成生物酰5‘腺苷酸，再将生物素转移到生物素受体蛋白上，同时也是生物素的操纵子的抑制物，由birA基因编码。生物素蛋白连接酶广泛存在于原核生物和真核生物的体内，又可以称为生物素连接酶、生物素操纵子阻遏蛋白、生物素全酶合成酶以及羧化全酶合成酶，而存在于原核细胞的生物素蛋白连接酶又名BirA酶。大肠杆菌中BirA酶蛋白质的三级结构中其N端60个氨基酸残基形成一个螺旋转螺旋的结构，此为DNA结构域，而中间区域形成催化域，其C端结构尚未确定。分子量约为 35KD。在大肠杆菌中，BirA酶仅识别并生物素化一种蛋白质类型，即乙酰基-CoA羧基酶的亚基生物素羧基载体蛋白(biotin carboxyl carrier protein，BCCP)，由于其生物素化的能力，BirA酶作为一种重要的试剂已广泛用于蛋白质分子之间相互作用的研究，特别是细胞表面受体-配体相互作用的研究。通过在目的蛋白上加入1个能被BirA酶识别的肽序列(可生物素化的序列 BSP =Leu-His-His-Ile-Leu-Asp-Ala-Gln-Lys-Met-Val-Trp-Asn-His-Arg), BirA酶可将生物素结合到目的蛋白上，这样就可用标记的亲和素探测目的蛋白。 虽然BirA酶是大肠杆菌的固有成分，但现有商品化的BirA酶价格昂贵且活性不高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种廉价的、酶活高的生物素蛋白连接酶融合蛋白及其制备方法。为此，本发明公开了一种如下(a)或(b)的生物素蛋白连接酶融合蛋白(a)其氨基酸序列包括SEQ ID NO. 1所述的氨基酸序列，其N端为多聚碱性氨基酸的蛋白；(b)至少与SEQ ID NO. 1所述氨基酸序列90%同源性、N端为多聚碱性氨基酸且具有生物素蛋白连接酶活性的蛋白。在一实施方式中，所述多聚碱性氨基酸为多聚组氨酸，其中优选6聚组氨酸。在一实施方式中，所述生物素蛋白连接酶融合蛋白为SEQ ID N0. 2所述氨基酸序列。另一方面，本发明公开了一种编码本发明所述生物素蛋白连接酶融合蛋白多核苷酸分子。另一方面，本发明公开了一种包含本发明所述多核苷酸分子的重组表达载体。另一方面，本发明公开了一种包含本发明所述重组表达载体的转化体。在一实施方式中，所述转化体为大肠杆菌，优选为大肠杆菌BL21。
另一方面，本发明公开了所述生物素蛋白连接酶融合蛋白的制备方法，包括如下步骤①生物素蛋白连接酶融合蛋白表达载体的构建；②生物素蛋白连接酶融合蛋白转化体的制备；③生物素蛋白连接酶融合蛋白的表达；④生物素蛋白连接酶融合蛋白的纯化。在一实施例中，步骤④采取金属螯合柱纯化，优选为镍离子金属螯合柱纯化。本发明所述生物素蛋白连接酶融合蛋白比现有商业化的BirA酶的活性高出约1 倍左右，所述的制备方法工艺简单、产量高。
图1为PCR产物电泳图；图2为pET32-BirA质粒转化体表达产物SDS-PAGE电泳；图3为BirAl菌种大规模发酵产物SDS-PAGE电泳；图4为纯化产物SDS-PAGE电泳；图5为BirA酶活曲线具体实施例方式在本文，术语所述“生物素蛋白连接酶”(Biotin Ligase,BirA,EC6. 3. 4. 15)，能活化生物素形成生物酰5'腺苷酸，再将生物素转移到生物素受体蛋白上，同时也是生物素的操纵子的抑制物，由birA基因编码。生物素-蛋白连接酶广泛存在于原核生物和真核生物的体内，又可以称为生物素连接酶、生物素操纵子阻遏蛋白、生物素全酶合成酶以及羧化全酶合成酶，而存在于原核细胞的生物素蛋白连接酶又名BirA酶。大肠杆菌BirA酶的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所述，同类生物素蛋白连接酶有90%的同源性，其生物学作用没有种属特异性。本发明的所述蛋白质优选该物质是生物素蛋白连接酶及其突变体；其功能性活性片段或其类似物；具有高度同源性的同系物以及编码包含SEQ ID NO. 2描述的氨基酸序列的蛋白质的载体例如DNA载体(质粒或病毒)。功能性活性片段或类似物可通过添加、插入、修饰、取代或缺失以上所列的氨基酸序列中的一或多个氨基酸残基而形成。术语“类似物”也包括嵌合蛋白质、融合蛋白、抗独特型抗体、上述化合物的前体和其它功能等效物或模拟物。术语“突变体”是指氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所述生物素蛋白连接酶的突变体。 相比于天然蛋白，该突变体与它们野生型相比，具有增强的活性和/或改变了的立体专一性。天然蛋白的氨基酸序列突变体可通过向本发明的核苷酸中引入适当的核苷酸变化、或通过体外合成所需多肽来制备。这些突变体包括，例如缺失、插入或替换该氨基酸序列中的残基。可以通过缺失、插入和替换的组合以得到最终的构建体，提供最终的蛋白产品。蛋白的同源性百分比由GAP(Needleman和mmsh，1970)分析(GCG程序)确定，其 rPgap creation penalty = 5, gap extension penalty = 0. 30 ^^Ι/τWii^1JixiS 至少为15个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为15个氨基酸的区域进行测试。更优选地，被分析的序列长度至少为50个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为50个氨基酸的区域进行测试。更优选地，被分析的序列长度至少为100个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为100个氨基酸的区域进行测试。更优选地，被分析的序列长度至少为250个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为250个氨基酸的区域进行测试。甚至更优选地，被分析的序列长度至少为500个氨基酸时，GAP分析就在参与测试的两个序列的至少为500个氨基酸的区域进行测试。本发明涉及的方面还包括生物素蛋白连接酶类似物，在它们合成期间或合成后进行了不同的修饰，例如，通过生物素化、苄基化、糖基化、乙酰化、磷酸化、由已知保护/封闭基团的衍生作用、蛋白水解的切割作用、连接到抗体分子或其它细胞配体上等。这些修饰可以用来增加本发明生物素蛋白连接酶的稳定性和/或生物活性。蛋白的表达本发明包括编码本发明的生物素蛋白连接酶的DNA以及含有这些DNA的载体、转化体。本发明中，使用的术语“转化体”(transformant)，即带有异源DNA分子的宿主细胞。本发明还包括通过合成和重组技术生产本发明所述蛋白的方法。通过本领域已知的方法可以分离和纯化多核苷酸(DNA或RNA)、载体、转化体和生物体。用于本发明的载体可以是如噬菌体、质粒、粘粒、微型染色体、病毒或逆转录病毒载体。可用于克隆和/或表达本发明的多核苷酸的载体是能在需复制和/或表达多核苷酸的宿主细胞中复制和/或表达多核苷酸的载体。一般说来，多核苷酸和/或载体可用于任何真核或原核细胞，包括哺乳动物细胞(如人(如HeLa)、猴(如Cos)、兔(如兔网织红细胞)、大鼠、仓鼠(如CHO、NSO和幼仓鼠肾细胞)或小鼠细胞(如L细胞))、植物细胞、酵母细胞、昆虫细胞或细菌细胞(如大肠杆菌)。有关适用于多种类型宿主细胞的适当载体的例子可参见例如 F. Ausubel et al. , Current Protocolsin Molecular Biology. Greene Publishing Associates andWiley-Interscience(1992)禾口 Sambrook et al. (1989)。可以使用含有这些多核苷酸的宿主细胞来大量表达可用于例如药物、诊断试剂、疫苗和治疗剂的蛋白质。已开发出多种方法用于经由互补的粘性末端使多核苷酸与载体可操作相连。例如，可在欲插入载体DNA内的DNA区段添加互补的同聚体序列片段。然后通过互补同聚体之间的氢键连接载体和DNA区段以形成重组DNA分子。含有一或多种限制性位点的合成接头提供了另一种连接DNA区段与载体的方法。 用噬菌体T4DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶I处理通过内切核酸酶限制性消化产生的 DNA区段，所述的两种聚合酶用其3'，5’-核酸外切活性除去突出的Y-单链末端，并用其聚合活性补平3’-凹端。因此，这些活性的联合产生了平端DNA区段。然后在能催化平端 DNA分子连接的酶，如噬菌体T4DNA连接酶的存在下将平端区段与摩尔过量的接头分子一起保温。因此，反应产物是末端携有聚合接头序列的DNA区段。然后用适当的限制性酶裂解这些DNA区段，并连接至已用酶裂解的表达载体中，所述酶能产生与所述DNA区段相容的末端。从多个商家可以买到含有多个限制性内切核酸酶位点的合成接头。多核苷酸插入物应该可操作地连接于同表达多核苷酸的宿主细胞相容的适当启动子上。启动子可以是强启动子和/或诱导型启动子。列举的一些启动子的例子包括噬菌体λ PL启动子、大肠杆菌lac、trP、phoA、tac启动子、SV40早期和晚期启动子以及逆转录病毒LTR启动子。其它适当启动子是本领域技术人员已知的。表达重组载体进一步含有转录起始、终止位点，并在转录区含有用于翻译的核糖体结合位点。重组载体表达的转录物的编码部分可包括位于起点处的翻译起始密码子和适当地位于被翻译多肽的末端的终止密码子(UAA, UGA 或 UAG)。如上所述，表达载体可包括至少一个选择标记。所述标记包括对真核细胞培养物而言的二氢叶酸还原酶、G418、谷氨酰胺合酶或新霉素抗性；以及用于大肠杆菌和其它细菌培养的四环素、卡那霉素或氨苄青霉素抗性基因。适当宿主的代表性例子包括但不限于细菌细胞，如大肠杆菌、链霉菌和鼠伤寒沙门氏菌细胞；真菌细胞，如酵母细胞(如酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母)；昆虫细胞，如果蝇S2和夜蛾SF9细胞；动物细胞，如CH0，C0S，NS0，293 和Bowes黑素瘤细胞；和植物细胞。上述宿主细胞的适当培养基和培养条件是本领域已知的。为了有效地分离纯化或分泌目标蛋白，常常还可利用便于分离纯化的标签蛋白或标签多肽(Tag)。常用的有谷胱甘肽-S-转移酶(glutathiones-transferase, GST)、 六聚组氨酸肽(His. Tag)、蛋白质A (protein Α)和纤维素结合位点(cellulose binding domain)等。通过特殊性蛋白或多肽与目标蛋白构成融合蛋白的形式，表达后利用所述的标签蛋白或标签多肽的特殊性质可对目标蛋白进行分离和纯化。如His. Tag与 Ni-ChelatingS印harose柱特异性结合。所述的标签蛋白或标签多肽可以在纯化后用位点特异性蛋白酶消化去除融合序列，如可用凝血酶、肠激酶和)(a因子等，以获得目标蛋白。本发明还包括含有本发明的核苷酸序列的宿主细胞，所述核苷酸序列经本领域已知的技术与一或多种异源控制区(如启动子和/或增强子)可操作相连。可以选择能调节插入的基因序列的表达，或能按照所需的特殊方式修饰和加工基因产物的宿主菌株。在某些诱导物的存在下，某些启动子启动的表达会升高；因此，可以控制经基因改造的多肽的表达。另外，不同宿主细胞具有特征性的和特殊的翻译、翻译后加工和修饰(如磷酸化、裂解) 蛋白质的机制。可以选择适当的细胞系以确保对表达的外源蛋白质进行合乎需要的修饰和加工。通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染或其它方法，即可将本发明的核酸和核酸重组载体导入宿主细胞。所述方法描述于多个标准的实验室手册中，如Davis et al. ,BasicMethods In Molecular Biology (1986)。编码本发明所述蛋白的多核苷酸可以与含有选择标记的载体连接以在宿主中增殖。一般说来，可在沉淀物，如磷酸钙沉淀物或其与带电脂质的复合物中导入质粒载体。如果载体是病毒，可使用适当的包装细胞系在体外对其进行包装，再转导至宿主细胞。通过众所周知的技术可以鉴定出被成功转化的细胞，即含有本发明的DNA重组载体的细胞。例如，可培养导入表达重组载体所得的细胞以产生所需多肽。收集并裂解细胞， 使用如 Southern(1975) J. Mol. Biol. 95，503 或 Berent et al (1985) Biotech. 3，208 所述的方法，检测其DNA内容物中DNA的存在。或者，使用抗体检测上清液中蛋白质的存在。通过众所周知的方法从重组细胞培养物中回收和纯化本发明的所述蛋白较为有利，所述方法包括硫酸按或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析、疏水电荷作用层析和凝集素层析。在一些实施方案中，可使用高效液相层析(HPLC)进行纯化。在一些实施方案中，可使用上述的一种或多种层析方法纯化本发明的所述蛋白。 在其它实施方案中，可使用下述的一种或多种层析柱纯化本发明的所述融合蛋白，所述层析柱有Q sepharose FF 柱、SP sepharose FF 柱、Qsepharose High Performance 柱、Blue sepharose FF 柱、Blue 柱、PhenylSepharose FF 柱、DEAE Sepharose FF> Ni-Chelating Sepharose FF 柱或 Methyl 柱等。另外，可使用国际公开号WO 00/44772(全文列入本文作为参考)中描述的方法纯化本发明的蛋白。本领域技术人员可以容易地改动其中所述的方法以用于纯化本发明的蛋白。可以从包括例如细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞的原核或真核宿主经重组技术产生的产物中回收本发明的蛋白。以下结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1、表达载体的构建根据基因序列设计BirA酶的PCR扩增上下游引物，分别为BirA_Ul 5，TGCGGATCCATGAAGGATAACACCG 3’ ；BirA_Dl :5，TGCCCTCGAGTCATTTTTCTGCACTACG 3，，以大肠杆菌Dffia基因组DNA为模板，用pfu酶进行PCR扩增，PCR反应条件95°C 4分钟；95°C 40 秒，52. 50C 40秒，72°C 1分钟，共30个循环；72°C 7分钟；4°C放置。将扩增获得的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如下图1所示，其中1为BirA的PCR产物，2为250bp Marker 从上到下 8 条带依次为4. 5kb, 3. Okb, 2. 25kb, 1. 5kb, 1. Okb, 750bp, 500bp, 250bp ；在 1. Okb 附近扩增出特异性条带。将琼脂糖凝胶上1. OKB大小的特异性PCR条带切下，并用胶回收试剂盒回收其中的DNA，经限制性内切核酸酶BamHI和Β ο I双酶切，与BamHlAho I双酶切的载体pET3h 连接。连接液转化大肠杆菌菌株ToplO的感受态细胞，铺板于含氨苄青霉素的LB琼脂上。 分离已转化的单菌落，扩增，用BirA基因的正向、反向引物PCR鉴定出阳性克隆，命名为 pET32-BirA/toplO。抽提质粒pET32-BirA，通过限制性内切酶酶切做初步鉴定，结果显示构建成功。菌落送样至上海英骏生物技术有限公司进行测序验证，测序引物为 5’ T7promoter、3’ T7 terminator通用引物，测序结果证实pET32_BirA为表达载体的正确构建体，其DNA序列与所设计的BirA基因完全相同。表达菌株的筛选抽提pET32-BirA质粒，氯化钙法转化BL21 (DE3)宿主菌，获得多个克隆，挑选2个克隆进行表达鉴定。在试管中进行少量培养，0.5mM IPTG诱导4小时后，收获菌体。破菌后进行SDS-PAGE电泳。结果如图2，图中1为空pET3h的BL21 (DE3)宿主菌；2为1号克隆；3为2号克隆；挑选1号克隆，保种，命名为BirAl菌种，并做进一步的大规模发酵。大规模发酵BirAl菌种在LB培养基中培养过夜后，OD值约为2.0，然后以的接种率接种30L发酵罐，37度，pH维持7. 0，溶氧控制在30%~60%,培养5小时，待溶氧上升后开始补料 (30%葡萄糖与20%酵母粉混合液)两小时左右，然后加入终浓度0. 5mM IPTG诱导4小时， 收获菌体。破菌SDS-PAGE电泳，电泳图如图3，其中Marker从上到下4条带依次为116KD， 66. 2KD，45KD，35KD，1，发酵罐诱导前；2，发酵罐诱导1小时；3，发酵罐诱导2小时；4，发酵罐诱导3小时；5，发酵罐诱导4小时。可以观察到有目标蛋白VRlll相应条带出现。纯化使用Ni-chelating镍柱进行目标蛋白的纯化。取发酵好的BirAl菌体，洗涤干净,重悬于平衡缓冲液(50mM Tris, 0. 5M NaCl, 20mM imidazol，PH8. 0)中，高压勻浆破菌2 次，离心取上清。以平衡缓冲液平衡Ni-chelating镍柱，破菌上清挂柱，然后用洗脱缓冲液 (50mM Tris, 0. 5M NaCl, 500mMimidazol, PH8. 0)，收集洗脱峰的各个组分，收集含蛋白的组分，加入甘油并稀释至3mg/ml，冻存于-20度备用。SDS-PAGE电泳检测纯化结果如图4，其中M为Marker从上到下4条带依次为116KD，66. 2KD，45KD，35KD ；1为洗脱峰组分1 ；2为洗脱峰组分；3为洗脱峰组分；4为洗脱峰组分；5为洗脱峰组分；6为流穿组分。实施例2酶活检测1，按以下体系对VRlll蛋白进行生物素化反应
权利要求
1.一种如下(a)或(b)的生物素蛋白连接酶融合蛋白(a)其氨基酸序列包括SEQID NO. 1所述的氨基酸序列，其N端为多聚碱性氨基酸的蛋白；(b)至少与SEQID NO. 1所述氨基酸序列90%同源性、N端为多聚碱性氨基酸且具有生物素蛋白连接酶活性的蛋白。
2.如权利要求1所述的生物素蛋白连接酶融合蛋白，其特征在于所述多聚碱性氨基酸为多聚组氨酸。
3.如权利要求2所述的生物素蛋白连接酶融合蛋白，其特征在于所述多聚组氨酸为6聚组氨酸。
4.如权利要求1所述的生物素蛋白连接酶融合蛋白，其特征在于所述生物素蛋白连接酶融合蛋白为SEQ ID NO. 2所述氨基酸序列。
5.一种编码权利要求1所述生物素蛋白连接酶融合蛋白多核苷酸分子。
6.一种包含权利要求5所述多核苷酸分子的重组表达载体。
7.一种包含权利要求6所述重组表达载体的转化体。
8.如权利要求7所述的转化体，其特征在于所述转化体为大肠杆菌。
9.如权利要求8所述的转化体，其特征在于所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21。
10.权利要求1所述生物素蛋白连接酶融合蛋白的制备方法，包括如下步骤①生物素蛋白连接酶融合蛋白表达载体的构建；②生物素蛋白连接酶融合蛋白转化体的制备；③生物素蛋白连接酶融合蛋白的表达；④生物素蛋白连接酶融合蛋白的纯化。
11.如权利要求10所述的制备方法，其特征在于所述步骤④采取金属螯合柱纯化。
12.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于所述金属螯合柱为镍离子金属螯合柱。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种生物素蛋白连接酶融合蛋白、基因、重组表达载体、转化体及其制备方法。本发明公开了一种如下(a)或(b)的生物素蛋白连接酶融合蛋白(a)其氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列，其N端为多聚碱性氨基酸的蛋白；(b)至少与SEQ ID NO.1所述氨基酸序列90％同源性、N端为多聚碱性氨基酸且具有生物素蛋白连接酶活性的蛋白。本发明所述生物素蛋白连接酶融合蛋白比现有商业化的BirA酶的活性高出约1倍左右，所述的制备方法工艺简单、产量高。
文档编号C07K19/00GK102190730SQ201010146660
公开日2011年9月21日 申请日期2010年3月15日 优先权日2010年3月15日
发明者丛薇, 袁靖宇, 雷建强 申请人:上海泽润生物科技有限公司