专利名称：一种用末端转移酶介导生物素标记扩散染色质检测精子dna碎片的方法
技术领域：
本发明涉及细胞分子物学，是一种用末端转移酶介导生物素标记扩散染色质检 测精子DNA碎片的方法。
背景技术：
由于精子DNA的完整性与否，直接影响男性生育质量，因此，本领域近几年 公开了多种检测精子完整性的方法，意在用于临床，提高诊断男性不育症的准确性， 并有效避免不良遗传的发生。然而，这些方法在应用中发现均存在较大不足例如 吖啶橙染色、慧星实验及荧光TUNEL等方法，需要使用流式细胞仪或荧光显微镜 等贵重仪器分析，而且试剂价格昂贵，使临床应用受到较大限制，使精子DNA检测 方法无法推广应用；同时，有些方法中使用的检测标本不易保存，还有些方法对精 子的质量判断准确性较低等。
发明内容
本发明的目的是提供一种用末端转移酶介导生物素标记扩散染色质检测精子 DNA碎片的方法，它不需要昂贵的检测仪器及试剂、精子标本可保存、试验结果可 靠、晕环清晰、分辨率高。
本发明为实现上述目的通过以下技术方案实现: 一种用末端转移酶介导生約素 标记扩散染色质检测精子DNA碎片的方法，其步骤如下
① 将载有处理后精液标本的载玻片置入4。C环境温度下冷藏4-7分钟；
② 取出冷藏后的载玻片，在室温为22'C下将载玻片浸入0.08N的盐酸内7分钟，使精子DNA变性；
③ 将经过步骤②处理过的载玻片浸入20-30毫升的精子裂解液内20分钟，精子 裂解液的组份及制备方法是按重量比取6.404克三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、.46 克乙二胺四乙酸和11.680克氯化钠混合后，加90毫升蒸馏水进行溶解，溶解后再 加入1毫升曲拉通X-100和6.17克的二硫代苏糖醇，然后定容至100毫升，调PH 值至7.5;
④ 将经过步骤③处理过的载玻片置入20-30毫升三羟甲基氨基甲烷-硼酸-乙二 胺四乙酸二钠盐缓冲液中3分钟；
⑤ 将载玻片由三羟甲基氨基甲烷-硼酸-乙二胺四乙酸二钠盐缓冲液中取出后依 次用70%、 90%和100。/。的乙醇进行脱水，每次脱水2分钟；
⑥ 制备末端转移酶介导生物素标记反应混合液将1微升脱氧核糖核苷酸末端 转移酶、1微升生物素标记的脱氧尿苷三磷酸和98微升平衡缓冲液混匀备用；
⑦ 将经过步骤⑤处理后的载玻片，置入20微升、PH值为7.5的磷酸缓冲液中 洗3次，每次3分钟，然后取100毫升末端转移酶介导生物素标记反应混合液置于 载玻片上，加盖玻片或封口膜置入37'C环境下暗的湿盒内反应1小时；
⑧ 将载玻片由湿盒中取出，置入磷酸缓冲液中洗3次，每次3分钟，洗后滴IOO 微升连接辣根过氧化物酶的链霉亲和素，室温下反应30分钟；
⑨ 将步骤⑧中反应后的载玻片洗片后滴入100微升3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐工 作液，避光反应10分钟，然后用蒸馏水冲洗2次后晾干；
⑩ 在显微镜下将精子染色液A液5毫升滴于载玻片上，15秒钟后吸掉未反应的 溶液，再滴于载玻片上5毫升精子染色液B液，IO秒钟后吸掉未反应的溶液，再用 蒸馏水洗2次，晾干后观察结果。步骤⑩中所述的精子染色液A液是按重量比取1克水溶性伊红和0.01克叠氮 化钠，置入900毫升蒸馏水中溶解，然后定容至1000毫升，即为精子染色液A液。
步骤⑩中所述的精子染色液B液是按重量比取0.625克的亚甲基蓝和0.625 克的天青A，置入1000毫升PH值为8的巴比妥钠缓冲液中溶解，溶解后即为精子 染色液B液，其中巴比妥钠缓冲液，按重量比即由1.84克巴比妥和10.3克巴比妥钠， 置入900毫升蒸馏水中溶解，然后定容至1000毫升后调PH至8.0而制取的。
步骤 中所述的三羟甲基氨基甲烷-硼酸-乙二胺四乙酸二钠盐缓冲液由下述原 料及方法制取按重量比取10.8克三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、5.5克硼酸、0.74克 乙二胺四乙酸二钠，溶于900毫升蒸馏水，定容至1000毫升，调PH值为7.5。
步骤⑦中所述磷酸缓冲液由下述原料及方法制取按重量比取8克氯化钠、0.2 克氯化钾、0.2克磷酸二氢钾和1.15克磷酸氢二钠溶于900毫升蒸馏水中，定容至 1000毫升，调PH值为7.4。
本发明的优点在于不需要使用流式细胞仪或荧光显微镜等昂贵仪器，只需要 采用光学显微镜观察精子DNA的损伤，从而使本发明的检测方法为广泛应用于临床 提供了廉价的基础，而且，本发明方法在光学显微镜下观察精子DNA损伤时的分辩 率高，直观性好，晕环清晰，判断精子质量的准确性高，同时，由于本发明的方法， 能够减少假阳性结果的产生，进一步提高了试验结果的可靠性，为不育患者的治疗 提供了可靠的临床诊断依据。本发明的方法还具有操作简便的优点。
图1和图2均是采用本发明方法观察到的精子DNA碎片，图中，a是阳性的 DNA损伤精子,深棕色，没有晕环；b是阴性的DNA损伤精子，呈红色，有清晰的 晕环，图l中c是无晕环精子，是用200倍光学显微镜即可清楚的观察到上述结果。
具体实施例方式
本发明的一种用末端转移酶介导生物素标记扩散染色质检测精子DNA碎片的
方法，其步骤如下
① 将载有处理后精液标本的载玻片置入4t环境温度下冷藏4-7分钟；
② 取出冷藏后的载玻片，在室温为22'C下将载玻片浸入0.08N的盐酸内7分钟， 使精子DNA变性；
③ 将经过步骤②处理过的载玻片浸入20-30毫升的精子裂解液内20分钟，精子 裂解液的组份及制备方法是按重量比取6.404克三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、1.46 克乙二胺四乙酸和11.680克氯化钠混合后，加90毫升蒸馏水进行溶解，溶解后再 加入1毫升曲拉通X-100和6.17克的二硫代苏糖醇，然后定容至100毫升，调PH 值至7.5;
④ 将经过步骤③处理过的载玻片置入20-30毫升三羟甲基氨基甲烷-硼酸-乙二 胺四乙酸二钠盐缓冲液中3分钟；
将载玻片由三羟甲基氨基甲垸-硼酸-乙二胺四乙酸二钠盐缓冲液中取出后依 次用70%、卯％和100%的乙醇进行脱水，每次脱水2分钟；
⑥ 制备末端转移酶介导生物素标记反应混合液将1微升脱氧核糖核苷酸末端 转移酶、1微升生物素标记的脱氧尿苷三磷酸和98微升平衡缓冲液混匀备用；
⑦ 将经过步骤⑤处理后的载玻片，置入20微升、PH值为7.5的磷酸缓冲液中 洗3次，每次3分钟，然后取100毫升末端转移酶介导生物素标记反应混合液置于 载玻片上，加盖玻片或封口膜置入37'C环境下暗的湿盒内反应1小时；
⑧ 将载玻片由湿盒中取出，置入磷酸缓冲液中洗3次，每次3分钟，洗后滴IOO 微升连接辣根过氧化物酶的链霉亲和素，室温下反应30分钟；
8⑨ 将步骤⑧中反应后的载玻片洗片后滴入100微升3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐工
作液，避光反应10分钟，然后用蒸馏水冲洗2次后晾干；
⑩ 在显微镜下将精子染色液A液5毫升滴于载玻片上，15秒钟后吸掉未反应的 溶液，再滴于载玻片上5毫升精子染色液B液，IO秒钟后吸掉未反应的溶液，再用 蒸馏水洗2次，晾干后观察结果。
步骤⑩中所述的精子染色液A液是按重量比取1克水溶性伊红和0.01克叠氮 化钠，置入900毫升蒸馏水中溶解，然后定容至1000毫升即为精子染色液A液。
步骤⑩中所述的精子染色液B液是按重量比取0.625克的亚甲基蓝和0.625 克的天青A，置入1000毫升PH值为8的巴比妥钠缓冲液中溶解，溶解后即为精子 染色液B液，其中巴比妥钠缓冲液，按重量比即由1.84克巴比妥和10.3克巴比妥钠, 置入900毫升蒸馏水中溶解，然后定容至1000毫升后调PH至8.0而制取的。
步骤 中所述的三羟甲基氨基甲烷-硼酸-乙二胺四乙酸二钠盐缓冲液由下述原 料及方法制取按重量比取10.8克三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、5.5克硼酸、0.74克 乙二胺四乙酸二钠，溶于900毫升蒸馏水，定容至1000毫升，调PH值为7.5。
步骤⑦中所述磷酸缓冲液由下述原料及方法制取按重量比取8克氯化钠、0.2 克氯化钾、0.2克磷酸二氢钾和1.15克磷酸氢二钠溶于900毫升蒸馏水中，定容至 1000毫升，调PH值为7.4。
本发明可在光学显微镜下观察到清晰的生物素标记的DNA损伤的精子，它呈 深棕色且无晕环，还可观察到清晰显示有扩散光晕的没有DNA损伤精子，它呈红色 晕环。
本发明方法中步骤①至⑤是精子染色质扩散实验，它可使精子核膜解聚，使精 子染色质损伤处产生单链DNA片断，并可去除核蛋白后，使紧密包装的精子核染色质结构松散，DNA环附于残留的核结构，有DNA碎片的精子没有晕环形成，没有 DNA碎片的精子有晕环形成。
本发明所述精液标本，其处理方法是精液和低熔点琼脂凝胶按l: 2.5的体积 比混匀，放在36"C 38T:下孵育4 6分钟，取20微升滴在经过浓度为0.6%的标准 琼脂预处理过的载玻片上，盖上盖玻片。
本发明方法步骤⑤中用乙醇对载玻片脱水，是将载玻片置入染色缸内进行脱水， 风干后，继续下面步骤，脱水操作过程要求将载玻片处于水平状态。
本发明步骤⑨中所述的3，3'-二氨基联苯胺四盐酸盐工作液是用3，3'-二氨基 联苯胺四盐酸盐显色试剂盒中浓縮液5微升、30%双氧水1微升和磷酸缓冲液94微 升混合制成100微升3， 3' -二氨基联苯胺四盐酸盐工作液。
本发明方法中所述的湿盒，是在盒内放置浸透水的纱布。
权利要求
1、一种用末端转移酶介导生物素标记扩散染色质检测精子DNA碎片的方法，其特征在于步骤如下①将载有处理后精液标本的载玻片置入4℃环境温度下冷藏4-7分钟；②取出冷藏后的载玻片，在室温为22℃下将载玻片浸入0.08N的盐酸内7分钟，使精子DNA变性；③将经过步骤②处理过的载玻片浸入20-30毫升的精子裂解液内20分钟，精子裂解液的组份及制备方法是按重量比取6.404克三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、1.46克乙二胺四乙酸和11.680克氯化钠混合后，加90毫升蒸馏水进行溶解，溶解后再加入1毫升曲拉通X-100和6.17克的二硫代苏糖醇，然后定容至100毫升，调PH值至7.5；④将经过步骤③处理过的载玻片置入20-30毫升三羟甲基氨基甲烷-硼酸-乙二胺四乙酸二钠盐缓冲液中3分钟；⑤将载玻片由三羟甲基氨基甲烷-硼酸-乙二胺四乙酸二钠盐缓冲液中取出后依次用70％、90％和100％的乙醇进行脱水，每次脱水2分钟；⑥制备末端转移酶介导生物素标记反应混合液将1微升脱氧核糖核苷酸末端转移酶、1微升生物素标记的脱氧尿苷三磷酸和98微升平衡缓冲液混匀备用；⑦将经过步骤⑤处理后的载玻片，置入20微升、PH值为7.5的磷酸缓冲液中洗3次，每次3分钟，然后取100毫升末端转移酶介导生物素标记反应混合液置于载玻片上，加盖玻片或封口膜置入37℃环境下暗的湿盒内反应1小时；⑧将载玻片由湿盒中取出，置入磷酸缓冲液中洗3次，每次3分钟，洗后滴100微升连接辣根过氧化物酶的链霉亲和素，室温下反应30分钟；⑨将步骤⑧中反应后的载玻片洗片后滴入100微升3，3′-二氨基联苯胺四盐酸盐工作液，避光反应10分钟，然后用蒸馏水冲洗2次后晾干；⑩在显微镜下将精子染色液A液5毫升滴于载玻片上，15秒钟后吸掉未反应的溶液，再滴于载玻片上5毫升精子染色液B液，10秒钟后吸掉未反应的溶液，再用蒸馏水洗2次，晾干后观察结果。
2、 根据权利要求1所述的一种用末端转移酶介导生物素标记扩散染色质检测精 子DNA碎片的方法，其特征在于步骤⑩中所述的精子染色液A液是按重量比 取1克水溶性伊红和0.01克叠氮化钠，置入卯O毫升蒸馏水中溶解，然后定容至1000 毫升，即为精子染色液A液。
3、 根据权利要求1所述的一种用末端转移酶介导生物素标记扩散染色质检测精 子DNA碎片的方法，其特征在于步骤⑩中所述的精子染色液B液是按重量比 取0.625克的亚甲基蓝和0.625克的天青A，置入1000毫升PH值为8的巴比妥钠 缓冲液中溶解，溶解后即为精子染色液B液，其中巴比妥钠缓冲液，按重量比即由 1.84克巴比妥和10.3克巴比妥钠,置入900毫升蒸馏水中溶解，然后定容至1000毫 升后调PH至8.0而制取的。
4、 根据权利要求1所述的一种用末端转移酶介导生物素标记扩散染色质检测精 子DNA碎片的方法，其特征在于步骤⑤中所述的三羟甲基氨基甲烷-硼酸-乙二胺 四乙酸二钠盐缓冲液由下述原料及方法制取按重量比取10.8克三羟甲基氨基甲烷 盐酸盐、5.5克硼酸、0.74克乙二胺四乙酸二钠，溶于卯O毫升蒸馏水，定容至1000 毫升，调PH值为7.5。
5、 根据权利要求1所述的一种用末端转移酶介导生物素标记扩散染色质检测精子DNA碎片的方法，其特征在于步骤⑦中所述磷酸缓冲液由下述原料及方法制取:按重量比取8克氯化钠、0.2克氯化钾、0.2克磷酸二氢钾和1.15克磷酸氢二钠溶于 900毫升蒸馏水中，定容至1000毫升，调PH值为7.4。
全文摘要
本发明公开了一种用末端转移酶介导生物素标记扩散染色质检测精子DNA碎片的方法，其步骤如下将载有处理后精液标本的载玻片置入环境温度下冷藏，取出冷藏后的载玻片，在室温下将载玻片浸入盐酸内，使精子DNA变性；将处理过的载玻片浸入精子裂解液内，置入缓冲液中，将载玻片由缓冲液中取出后用乙醇进行脱水，再制备末端转移酶介导生物素标记反应混合液；将处理后的载玻片，置入磷酸缓冲液中洗3次，然后取末端转移酶介导生物素标记反应混合液置于载玻片上，将反应后的载玻片洗片后滴入工作液避光反应，然后用蒸馏水冲洗，在显微镜下将精子染色液A液和B液滴于载玻片上，晾干后观察结果。本发明不需要昂贵的检测仪器及试剂、精子标本可保存、试验结果可靠、晕环清晰、分辨率高。
文档编号G01N21/77GK101550447SQ20091001493
公开日2009年10月7日 申请日期2009年4月30日 优先权日2009年4月30日
发明者艳 刘, 张丽红, 娟 李, 王克华, 王磊光, 王秋菊, 毅 邱 申请人:张丽红