一种生物素标记兔抗罗非鱼IgM多克隆抗体的制备方法及应用的制作方法
【专利摘要】一种生物素标记兔抗罗非鱼IgM多克隆抗体的制备方法，含以下步骤：采集罗非鱼血清经纯化处理得纯化的罗非鱼IgM；将罗非鱼IgM免疫兔得兔抗罗非鱼IgM多克隆抗体，采用ELISA检测兔抗罗非鱼IgM多克隆抗体的抗罗非鱼血清效价；将纯化的罗非鱼IgM加强免疫后，收集、分离得含有兔抗罗非鱼IgM多克隆抗体的血清，经纯化处理，加入生物素混匀，得生物素标记兔抗罗非鱼IgM多克隆抗体；采用该法制成的生物素标记兔抗罗非鱼IgM多克隆抗体特异性好，纯度和效价高，能与罗非鱼IgM发生特异性结合反应；还公开了上述方法制成的生物素标记兔抗罗非鱼IgM多克隆抗体在ELISA中的应用及在Western-Blot中的应用。
【专利说明】一种生物素标记兔抗罗非鱼IgM多克隆抗体的制备方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于多克隆抗体【技术领域】，具体涉及为一种生物素标记兔抗罗非鱼IgM多克隆抗体的制备方法及应用。
【背景技术】
[0002]免疫球蛋白是动物体液免疫应答中的重要分子，作为低等脊椎动物的硬骨鱼类的主要免疫球蛋白就是IgM。该分子是一个四聚体，每个单体包含2条重链和2条轻链。高度纯化的鱼类血清IgM在鱼类免疫学中有重要的用途，如制备单克隆、多克隆抗体，检测鱼类病原体及鱼类免疫应答水平；探索IgM的产生、分布，还可用于研究免疫系统的进化。
[0003]罗非鱼已被农业部列为产业化开发的优质鱼类品种，近年来，随着养殖环境的破坏，养殖密度的增加，导致病害日趋严重，进而导致药物滥用、残留严重，商品鱼出口受阻，严重影响了我国罗非鱼养殖产业的可持续发展，研究开发鱼类疫苗，对罗非鱼的养殖与病害防制有重要意义。高纯度血清免疫球蛋白IgM及其抗体的制备是研究鱼类免疫应答、免疫检测方法的基础。目前，市面上还没有兔抗罗非鱼IgM抗体商品的出现，这为罗非鱼免疫应答水平的监测、及其免疫检测方法的建立提供了不利因素。因此，有必要制备特异性好、高纯度、高效价的兔抗罗非鱼IgM的多克隆抗体，为罗非鱼病害防治研究提供基础材料。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种生物素标记兔抗罗非鱼IgM多克隆抗体的制备方法，采用该制备方法制成的生物素标记兔抗罗非鱼IgM多克隆抗体特异性好，且纯度和效价高，并能与罗非鱼IgM发生特异性结合反应。
[0005]本发明的目的还在与提供采用上述生物素标记兔抗罗非鱼IgM多克隆抗体的制备方法制成的生物素标记兔抗罗非鱼IgM多克隆抗体。
[0006]本发明的第三个目的在于提供采用上述方法制成的生物素标记兔抗罗非鱼IgM多克隆抗体在ELISA法检测罗非鱼血清抗体效价中的应用。
[0007]本发明的第四个目的在于提供采用上述方法制成的生物素标记兔抗罗非鱼IgM多克隆抗体在Western-Blot中的应用。
[0008]本发明的第一个目的是通过如下技术方案来实现的:一种生物素标记兔抗罗非鱼IgM多克隆抗体的制备方法，含以下步骤:
[0009](I)选取健康罗非鱼的尾动脉血，静置使血清充分析出，离心，取上清，得罗非鱼血清；
[0010](2)取罗非鱼的血清，用等体积PBS稀释后，加入饱和硫酸铵搅拌处理，离心，取沉淀，溶解后，进行纯化处理，得纯化的罗非鱼IgM ；
[0011](3)第一次免疫时，按200 μ g/只SPF级新西兰兔的免疫剂量，取步骤(2)纯化的罗非鱼IgM与等体积的完全弗氏佐剂混合，充分乳化后在SPF级新西兰兔背部皮下进行多点注射免疫，10-14天后进行第二次、第三次以及第四次免疫，第二、三、四次免疫是将纯化的罗非鱼IgM按200 μ g/只SPF级新西兰兔的免疫剂量与等体积的不完全弗氏佐剂混合，充分乳化，在新西兰兔背部皮下多点注射免疫，每次间隔10-14天，第四次免疫后第10天，对免疫的新西兰兔耳静脉采血，ELISA检测新西兰兔血清中抗罗非鱼IgM抗体的效价；
[0012](4)四免后，用纯化的罗非鱼IgM按100μ g/只的免疫剂量加强免疫新西兰兔，
2?4天内进行心脏采血，收集、分离得到含有抗罗非鱼IgM的兔多克隆抗体的血清，再经纯化处理，得兔抗罗非鱼IgM多克隆抗体，将兔抗罗非鱼IgM多克隆抗体与生物素混匀，获得生物素标记兔抗罗非鱼IgM多克隆抗体。
[0013]本发明步骤⑵中饱和硫酸铵的用量为罗非鱼血清的1.5?3倍，其pH为7.4，PBS的pH也为7.4。
[0014]本发明步骤(2)和步骤(4)中纯化处理采用ProteinA+ProteinG亲和层析柱过柱纯化处理。
[0015]本发明步骤(4)中四免后血清效价达到1:640000以上，用纯化的罗非鱼IgM按100 μ g/只的免疫剂量加强免疫新西兰兔。
[0016]本发明步骤(4)中兔抗罗非鱼IgM多克隆抗体在与生物素混匀前先经透析处理。
[0017]本发明步骤(4)中所述的兔抗罗非鱼IgM多克隆抗体与生物素的浓度和用量相同。
[0018]本发明步骤⑷中将兔抗罗非鱼IgM多克隆抗体与生物素混匀，作用3?5小时后，进行透析处理以及采用BCA试剂盒测定其浓度并分装，获得生物素标记兔抗罗非鱼IgM多克隆抗体。
[0019]本发明步骤(I)中优选在37°C静置2小时，4°C冰箱过夜使血清充分析出，4000rpm/min离心IOmin,取上清,得罗非鱼血清。
[0020]本发明步骤⑵中离心时的转速优选为7000rpm,离心时间优选为30min。
[0021]本发明的第二个目的是通过如下技术方案来实现的:一种生物素标记兔抗罗非鱼IgM多克隆抗体，其特征是:采用上述的生物素标记兔抗罗非鱼IgM多克隆抗体的制备方法制成。
[0022]本发明的第三个目的是通过如下技术方案来实现的:上述生物素标记兔抗罗非鱼IgM多克隆抗体的制备方制成的生物素标记兔抗罗非鱼IgM多克隆抗体在ELISA法检测罗非鱼血清抗体效价中的应用。
[0023]本发明的第四个目的是通过如下技术方案来实现的:上述生物素标记兔抗罗非鱼IgM多克隆抗体的制备方制成的生物素标记兔抗罗非鱼IgM多克隆抗体在Western-Blot中的应用。
[0024]本发明具有如下有益效果:
[0025]本发明制备的生物素标记兔抗罗非鱼IgM多克隆抗体具有特异性好、纯度高、效价高的特点，可与罗非鱼IgM发生特异性结合反应、可用于ELISA实验的要求。本发明生物素标记兔抗罗非鱼IgM多克隆抗体的制备与应用，为罗非鱼有害细菌、病毒的疫苗研制、免疫水平检测以及免疫检测方法的建立提供一个重要工具，具有重要的理论意义和生产价值。【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1为本发明实施例1中罗非鱼IgM纯化的SDS-PAGE图谱；
[0027]图2为实施例3中荧光扫描仪扫描显色图，为Western-blot显色图谱，在80KD处重链有一明显的杂交条带。
【具体实施方式】
[0028]结合附图和实施例对本发明作进一步说明:
[0029]实施例1
[0030]本实施例提供的兔抗罗非鱼IgM多克隆抗体的制备方法，步骤如下所示:
[0031](I)健康的罗非鱼5尾，体重400_450g，从尾动脉采血，37°C放置2h，4°C静置过夜使血清充分析出，4°C 4000rpm/min,离心30min,取上清；
[0032](2)将罗非鱼血清用等体积0.01mol/L PBS (pH7.4)稀释后，加入两倍ρΗ7.4的饱和硫酸铵，边加溶液边搅拌；加完后继续搅拌I小时，进行离心，7000rpm，30min，取沉淀；
[0033](3)将沉淀用PBS溶解后，ProteinG+ProteinA亲和层析柱过柱纯化IgM，BCA试剂盒测定浓度，如图1所示，为纯化后IgM SDS-PAGE图谱；
[0034](4)将200 μ g纯化罗非鱼IgM与等体积的完全弗氏佐剂混合，充分乳化后在兔背部皮下多点注射免疫，10-14天内，用200 μ g纯化罗非鱼IgM与等体积的不完全弗氏佐剂混合进行第二次、第三次、第四次免疫，乳化充分后，在兔背部皮下多点注射免疫，先后共注射免疫四次，每次免疫间隔10-14天，第四次免疫10后，兔耳静脉采血，ELISA检测血清中兔抗罗非鱼IgM多克隆抗体的效价；
[0035](5)用100 μ g纯化的罗非鱼IgM加强免疫第四次免疫后的新西兰兔，2-4天后，收集、分离得到的含有抗罗非鱼IgM的兔多克隆抗体的血清，ELISA检测兔血清抗罗非鱼IgM的效价；
[0036]所测兔血清抗罗非鱼IgM的效价为1:640000以上；
[0037](6)用蛋白纯化仪,ProteinG+ProteinA亲和层析柱过柱纯化兔抗罗非鱼IgM的多克隆抗体；
[0038](7)用BCA试剂盒测定收集样品的浓度进行分装，所测纯化多抗浓度为1.539mg/mL ；ELISA测定纯化后兔多抗的滴度；
[0039]所测纯化兔抗罗非鱼IgM多克隆抗体滴度为3.125μ g/mL,即效价为1:320000。
[0040](8)纯化的兔抗IgM多克隆抗体，过夜透析，与等量的生物素溶液混合,作用4个小时以上，标记好的生物素-兔抗IgM多克隆抗体过夜透析，得生物素-兔抗罗非鱼IgM多克隆抗体用于ELISA检测得到良好的线性数据，证实生物素、兔抗罗非鱼IgM多克隆抗体标记成功，ELISA测定抗体滴度和最佳工作稀释度。测定抗体滴度为5.69μ g/mL，抗体效价为1:160000，最佳工作稀释度为1:10000。
[0041]实施例2
[0042]本实施例提供的生物素标记兔抗罗非鱼IgM多克隆抗体应用步骤如下:
[0043](I)试验罗非鱼经1.93 X IO3Cfu/尾低剂量无乳链球菌腹腔注射，采集48h，72h，一周、12天尾动脉血,37°C静置2小时，4°C冰箱过夜使血清充分析出，4000rpm/min离心lOmin，取上清，得罗非鱼血清；[0044](2)取无乳链球菌菌液，12000rpm/min离心5min，超声波破碎，BCA试剂盒测定裂解菌液浓度，按80 μ g/ml浓度100 μ I/孔包被100 μ L/孔包被ELISA板，4°C过夜；
[0045](3)甩掉包被液，1%牛血清白蛋白封闭ELISA板，37°C作用2个小时；
[0046](4) PBST洗板三次，PBS溶液梯度稀释(I)步所得血清，100 μ L/孔加入ELISA板中，37°C作用I个小时；
[0047](5) PBST洗板三次，PBS溶液1:10000稀释生物素-兔抗罗非鱼IgM多克隆抗体，
100μ L/孔加入ELISA板中，37°C作用I个小时；
[0048](6) PBST洗板三次，PBS溶液1:10000稀释HRP-链亲和霉素，100 μ L/孔加入ELISA板中，37°C作用I个小时；
[0049](7) PBST洗板三次，每孔加入100 μ LTMB工作液，37°C作用20分钟；
[0050](8)每孔加入50 μ L终止液终止反应，酶标仪读数，确定罗非鱼血清效价。结果显示48h罗非鱼血清效价最高，达1:51200，随后血清效价降低，12天血清效价为1:6400。证实所制备的生物素标记兔抗罗非鱼IgM多克隆抗体可以用于检测罗非鱼血清抗体效价的监测。
[0051]实施例3
[0052]本实施例提供的兔抗罗非鱼IgM多克隆抗体应用于Western-blot,步骤如下:
[0053](I)将5 μ g罗非鱼IgM用12%分离胶进行常规SDS-PAGE电泳；
[0054](2)电泳结束后，电转至硝酸纤维素膜(NC)上；
[0055](3)转膜结束后，剪下Marker条带在氨基黑染液中染5min，再用脱色液脱色，直到蛋白带清晰为止；
[0056]⑷NC膜加入5%脱脂奶粉中，37°C封闭lh，TBST洗3次，每次IOmin ；
[0057](5)加入纯化后的多抗(稀释至3.125 μ g/mL)，37°C孵育60min，TBST洗3次’每次 IOmin ；
[0058](6)加入突光标记 Donkey ant1-Rabbit IgGl: 15000, 37°C温育 60min, TBST 洗 3次，每次IOmin ；
[0059](7)荧光扫描仪扫描显色，如图2所示，为Western-blot显色图谱，在80KD处重链有一明显的杂交条带。
[0060]以上实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以上实施例。所述【技术领域】的普通技术人员依据以上本发明公开的内容和各参数所取范围，均可实现本发明的目的。
【权利要求】
1.一种生物素标记兔抗罗非鱼IgM多克隆抗体的制备方法，其特征是含以下步骤: (1)选取健康罗非鱼的尾动脉血，静置使血清充分析出，离心，取上清，得罗非鱼血清； (2)取罗非鱼的血清，用等体积PBS稀释后，加入饱和硫酸铵搅拌处理，离心，取沉淀，溶解后，进行纯化处理，得纯化的罗非鱼IgM ； (3)第一次免疫时，按200μ g/只SPF级新西兰兔的免疫剂量，取步骤(2)纯化的罗非鱼IgM与等体积的完全弗氏佐剂混合，充分乳化后在SPF级新西兰兔背部皮下进行多点注射免疫，10-14天后进行第二次、第三次以及第四次免疫，第二、三、四次免疫是将纯化的罗非鱼IgM按200 μ g/只SPF级新西兰兔的免疫剂量与等体积的不完全弗氏佐剂混合，充分乳化，在新西兰兔背部皮下多点注射免疫，每次间隔10-14天，第四次免疫后第10天，对免疫的新西兰兔耳静脉采血，ELISA检测新西兰兔血清中抗罗非鱼IgM抗体的效价； (4)四免后，用纯化的罗非鱼IgM按100μ g/只的免疫剂量加强免疫新西兰兔，2?4天内进行心脏采血，收集、分离得到含有抗罗非鱼IgM的兔多克隆抗体的血清，再经纯化处理，得兔抗罗非鱼IgM多克隆抗体，将兔抗罗非鱼IgM多克隆抗体与生物素混匀，获得生物素标记兔抗罗非鱼IgM多克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的生物素标记兔抗罗非鱼IgM多克隆抗体的制备方法，其特征是:步骤⑵中饱和硫酸铵的用量为罗非鱼血清的1.5?3倍，其pH为7.4，PBS的pH也为7.4。
3.根据权利要求1所述的生物素标记兔抗罗非鱼IgM多克隆抗体的制备方法，其特征是:步骤⑵和步骤⑷中纯化处理采用ProteinA+ProteinG亲和层析柱过柱纯化处理。
4.根据权利要求1所述的生物素标记兔抗罗非鱼IgM多克隆抗体的制备方法，其特征是:步骤⑷中四免后血清效价达到1:640000以上，用纯化的罗非鱼IgM按100 μ g/只的免疫剂量加强免疫新西兰兔。
5.根据权利要求1所述的生物素标记兔抗罗非鱼IgM多克隆抗体的制备方法，其特征是:步骤(4)中兔抗罗非鱼IgM多克隆抗体在与生物素混匀前先经透析处理。
6.根据权利要求1所述的生物素标记兔抗罗非鱼IgM多克隆抗体的制备方法，其特征是:步骤(4)中所述的兔抗罗非鱼IgM多克隆抗体与生物素的浓度和用量相同。
7.根据权利要求1所述的生物素标记兔抗罗非鱼IgM多克隆抗体的制备方法，其特征是:步骤(4)中将兔抗罗非鱼IgM多克隆抗体与生物素混匀，作用3?5小时后，进行透析处理以及采用BCA试剂盒测定其浓度并分装，获得生物素标记兔抗罗非鱼IgM多克隆抗体。
8.—种生物素标记兔抗罗非鱼IgM多克隆抗体，其特征是:采用权利要求1-7任一项所述的生物素标记兔抗罗非鱼IgM多克隆抗体的制备方法制成。
9.权利要求8所述的生物素标记兔抗罗非鱼IgM多克隆抗体在ELISA法检测罗非鱼血清抗体效价中的应用。
10.权利要求8所述的生物素标记兔抗罗非鱼IgM多克隆抗体在Western-Blot中的应用。
【文档编号】G01N33/573GK103454411SQ201310268486
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年6月28日 优先权日:2013年5月27日
【发明者】马艳平, 柯浩, 刘振兴, 冯国清, 郝乐 申请人:广东省农业科学院动物卫生研究所