专利名称：用蛋白生物芯片检测sars患者血液中生物标记的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的生物样品中蛋白质分析方法，一种通过捕获阴离子吸附表面芯片的生物标记，并用激光解析电离质谱分析来检测生物标记。在此提及的此项发明大体上与SARS研究领域有关。更确切地讲，此发明涉及到血清生物标记(Serum Biomarkers)，而这些生物标记能被用来以更高的特异性和灵敏度将SARS患者区分出来。
背景技术：
不论是细胞的正常功能还是病理特性都在一定程度上取决于细胞所表达的蛋白质功能。因此，鉴定细胞内表达的蛋白质的区别，可用于诊断疾病，并最终用于药物开发和疾病治疗。而要进行蛋白质表达和功能的差异化分析，要求能够达到分辨细胞内分子的复杂混合物的程度。但细胞内许多物质往往以微量存在，目前用于分析蛋白的方法在上述各方面都有局限，用这些常规手段难以进行定性鉴定和定量分析。
如，一种常用的分子分离方法是凝胶电泳。通常是用凝胶内等电点聚焦先分离蛋白质，再用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳进行第二次分离。结果得到一张根据等电点范围(净电荷)和大小(质量)来区分蛋白质的图。虽然有用，但是该方法存在以下几方面的局限。首先，该方法只提供生物分子的两项特征—质量和等电点(pI)。其次，各维度的分辨率受到凝胶分辨能力的限制。例如，通常很难区分质量差异小于5％或pI差异的生物分子。第三，凝胶的容量和灵敏度都有限，可能无法检测出少量表达的生物分子。第四，无法观察到分子量低于约10-20kDa的小蛋白或小肽。
又如，临床诊断疾病一般方法是要求特异性地检测出疾病的已知标记。但是，制备特异性结合标记并且能在复杂的混合物中鉴别出标记的试剂需要大量时间，这阻碍了此类诊断方法的发展。
其它分析方法可能克服以上局限之一或几项，但是难以将它们有效组合。例如，分析层析能够根据多种分析物/吸附剂相互作用来分离生物分子，但是作多维度分析却困难而费时。而且，该方法的灵敏度也很有限。
用质谱的方法测定蛋白质是较新的方法，但目前的质谱分析方法只能对蛋白质进行定性分析，无法进行定量分析，尤其在是样品中混合物复杂，蛋白质含量极小的情况下。
发明内容
本发明的目的是建立一种在生物样品中检测正常人细胞，非SARS但发烧患者细胞，SARS患者细胞在血液中生物标记的用途。此发明涉及到血清生物标记(SerumBiomarkers)，而这些生物标记能被用来以更高的特异性和灵敏度将SARS患者区分出来。
本发明涉及一种通过捕获阴离子吸附表面芯片的生物标记，并用激光解析电离质谱分析来检测SARS生物标记。
本发明中的生物标记是利用一台赛弗吉生物系统公司(Ciphergen Biosystems，Inc.，Fremont，CA，USA)的PBS II型质谱仪来发现的。该设备的质量精确度约为+/-0.15％。
赛弗吉生物系统公司生产的蛋白生物芯片WCX-2(阴离子吸附表面芯片，有羧酸化功能)，结合血清中阳离子蛋白。具吸收剂的阴离子底基与样本接触，例如患者血清，经过一段足够的时间使标记物或生物标记物能与阴离子吸附剂结合。经过一段培育期，底基洗去未吸附的物质。任何适宜的洗液均可使用，最好用水溶液。被吸附的分子范围可以通过调整洗涤的严格度。洗液的洗提特性依靠的因素有pH，离子浓度和温度。
生物标记物首先能够被具有能与生物标记物结合的阴离子吸附表面芯片捕获，非吸附物能从芯片上洗脱，吸附到底基的生物标记物在飞行质谱仪中被检测。生物标记物通过离子发生源，如激光，被离子化，产生的离子被一个离子感受集合器收集，然后质量分析器分析那些通过的离子。之后，检测器将检测的离子信息转换为质荷比。生物标记物的检测明显地将与信号强度的检测有关。这样，生物标记物的数量与质量都可以被检测出来。
飞行质谱对待分析物的分析生成飞行时间谱。该飞行时间谱的最终分析并不表示离子化能量攻击一个样本产生的单独的脉冲信号，而是一系列脉冲的信号之和。这样降低了干扰，并增加了动态范围。该飞行时间数据受数据处理软件的影响。在赛弗吉生物系统公司软件中数据处理主要包括转换飞行时间与质荷比而产生质谱，降低基线而减少仪器的偏移量，和过滤高频噪音而减轻高频噪音。
通过对生物标记物的吸附和检测而产生的数据可利用计算机的数据分析程序进行分析。该计算机程序分析这些数据以显示检测出的标记物的数量，并显示信号的强度和确定被检测的每个生物标记物的分子量。数据分析还能包括一系列的确定生物标记物的信号强度和矫正数据对预定统计分布状态的偏离。例如，通过计算与某些参数相关的每个峰值的高度，可规范观测到的峰。该参数可能是由仪器和类似能量吸收分子等化学成分产生的不重要的干扰，这可以设置调零。
计算机可以将计算结果数据转换成各种形式来表现。其标准谱可以表示，但在一种形式中只有峰高和质量信息可以在谱带中保留，产生一个较清晰的图，并使具有几乎相同分子量的生物标记物更易显现。在另一种形式中，两个或更多的谱比较，便于突显独特的生物标记物和那些高于或低于校准样本的生物标记物。
分析一般包括展示从待分析物得到的信号的图谱中峰的鉴定。峰可以通过视图进行选择，软件是可用的，它可自动检测峰。一般情况下，该软件通过鉴定信号具有信噪比高于一个选择阈值并标记出在峰信号的质心处的峰的质量这样的方式操作。在一个有效的程序中，比较许多谱线以认定出现在质谱中某一选定范围内同样的一些峰。该软件的一个版本聚集所有出现在确定的质量范围内的各条光谱的峰，对所有在质量(质荷比)中值附近的峰指定一个质量(质荷比)簇。
通常用于分析数据的软件可包括代码用于一个运算法则来分析信号以确定该信号是否表示一个信号中的峰，按照目前的发明，该峰相应于一个生物标记物的信号。该软件也能结合分类树或ANN分析。从观测生物标记物的峰中获得的数据，以决定一条生物标记物峰或生物标记物的峰组合的出现是否代表SARS状态。数据的分析直接或间接地将从样本的质谱分析获得的多种参数转换为函数关系。这些参数包括，但不局限于一条或多条峰是否出现，一条或一组峰的形状，一条或多条峰的高度，及峰高数据的其他算法。
任何合适的数字化计算机都可完成并使用分类模型。合适的数字化计算机包括小型、微型、大型计算机使用标准或特殊操作系统，如Unix，WindowsTM，或LinuxTM为基础的操作系统。数字化计算机可以与质谱仪分开，也可连在一起。此发明体现在训练数据集和分类模式上，训练数据集和分类模式可用计算机编码表示，一台数字计算机即可运行这种编码。计算机编码储存在任何合适的计算机可读工具中包括光盘、磁盘、内存条、磁带等，并且能写入任何合适的计算机操作语言包括C，C++，可视basic，等。
不管是发展已知生物标记的分类系统，还是寻找新的SARS生物标记，上述系统都是很有用的。反过来，分类系统是试验诊断的基础，为单个或联合使用分子标记提供诊断依据。
发明中使用的生物标记是包含一个多肽分子(polypeptide)的生物分子。这些生物标记是通过由质谱测定法(mass spectrometry)测定的不同的分子量，在质谱测定法中光谱峰图的形状以及它们对于吸附表面的吸附特性而彼此进行辨别。
在本发明中，像在此描述的那样，将一个给定的生物标记的质量和亲和特性表现出来从而标识出该生物标记，这样的标识使得研究人员可以确定一个特殊的被检测的生物分子能否成为本发明中的生物标记。这些特征反映了这些生物分子的固有特征，而没有对这些生物分子的辨别设定限制。
对生物标记的检测需要将一个血清样本放在赛弗吉生物系统公司WCX2芯片的一个吸附点上，接着用pH4.0的50mM的乙酸钠进行清洗。向吸附点上加入SINAPINICS酸并让其干燥。而后，用表面加强激光解析电离飞行时间质谱测定法(SELDI-TOF-MS，PBSII)对芯片进行分析，而一个显示了单个蛋白质分子的遗留物图将生成，这张图是在蛋白质分子的质量-电荷比的基础上，以彼此分开的峰图的形式显示出来的。
用此种方法收集到的光谱数据将用数据管理软件进行分析。每组的质量光谱都符合散点分析(scatterplotanalysis)的条件。作为在SARS组和对照组中有相同的表达水平(levelof expression)的潜在的生物标记，在散点上的蛋白质簇(protein cluster)被消除了，也就是那些在两种环境下都增强或都衰减的蛋白质簇。残留下来的多肽将被进一步分析以确定它们将SARS组和对照组准确区分开来的能力。在两组中表现差异最大的蛋白质簇会被收集起来。
因为本项发明中的生物标记是通过质量和吸附特性来标识的，因而它们可通过质谱测定法进行检测而无需知道它们特定的身份。然而，如果有必要，这些生物标记也可通过，比如，确定多肽的氨基酸序列来进行鉴别。例如，一个生物标记能用许多酶描绘出来，例如V8蛋白酶(V8 protease)，而且消化片段(digestion fragments)的分子量可被用来在数据库中搜索序列，这些序列与由多种酶生成的消化片断的分子量相吻合。或者，如果此生物标记不是已知数据库中的蛋白质分子，在生物标记的N极氨基酸序列(N-terminal AminoAcid Sequence)的基础上，可使用降解探针，而后，这些探针会被用来描绘由探测到了生物标记的样本所生成的基因组或cDNA库。最后，蛋白质生物标记可用蛋白质梯状排序法(Protein Ladder Sequencing)进行排序。通过将分子碎成碎片并将碎片用酶解作用或其他可按顺序从碎片末端除去一个单个氨基酸分子的方法进行处理后，可生成蛋白质梯度(Protein Ladders)。然后，用质谱对此梯度进行分析。阶梯状碎片(Ladder Fragments)在质量上的差异可鉴别出从分子末端被除去的氨基酸。
SARS是一种由冠状病毒(Corona Virus)引起的致命的疾病。一种基于聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，即“PCR”)技术，针对SARS的诊断方法已经开发出来。然而，此项技术只在50％的样本中是准确的，而且较高的假阴性(False Negatives)比例，限制了其临床应用。
通过对比从血清中获得的样本的质谱，鉴别出了本发明中的生物标记。生物标记呈现在血清中，而血清是从不同的对象组中获得的。这其中包括急性SARS对象，非SARS但发烧对象(None-SARS Fever)，SARS康复对象—感染后30天，以及非SARS对照对象—健康个体或由其他疾病的个体。
具体实施例方式
实施例1 正常人细胞及非SARS但发烧患者细胞，急性SARS患者细胞在血液中生物标记的区分(1)实验方法一、材料1.标本来源收集2003年中国用WHO标准评价(临床诊断)的SARS病人的血清/血浆样本。
2.试剂尿素、乙腈、三氟乙酸、SPA(Sinapinic acid)均购自Sigma公司。
二、方法1.样品的收集全血采集后吸取血清，置于-80℃保存；2.样品的准备最初用赛弗吉蛋白芯片系统各种化学物质芯片(疏水性、离子性、金属结合物)来评价以决定哪种亲和性化学物质在蛋白质数目和分析方面提供最好的血清图形。我们观察到WCX2芯片效果最好。
3.芯片的预处理样本(3μl)用U9(6μl)稀释(一种缓冲液包含50mMTris-HCI pH9，9摩尔尿素，2％CHAPS)，4℃放置30分钟，然后放入108μl结合缓冲液(50mM NaAOc，pH4.0)(完全稀释39倍)充分混匀。100μl稀释样本用微加样器加到WCX2生物芯片上。100μl稀释样本加载到覆盖一个芯片位点的槽中并在室温条件下轻微震荡1小时。从槽中移去缓冲液。200μl同样的结合缓冲液加到每个槽中并震荡洗涤5分钟。重复洗涤。移去缓冲液并在每个槽中加200μl HPLC-梯度水快速冲洗。水从槽中去除。在分析前，加入0.5μl的SINAPINIC酸(5mg/mL 50％乙腈；0.5％三氟乙酸)，任其自然干燥。
4.芯片检测芯片放入赛弗吉生物系统公司PBSII质谱阅读器中，就会生成飞行时间质谱。外部使用All-in-1肽分子质量标准来校正质量精确性。绝大多数阅读器设定激光强度为170-190，灵敏度为8-10。在自动资料收集前需要手工设定来评估阅读条件。
此研究所用的资料分析处理包括三个阶段(a)峰值检测和排列；(b)选出鉴别能力最高的峰；(c)利用生物标记图软件进行资料分析。
选出2,000-50,000Da质量范围进行分析，因为此范围包含绝大多数分解的蛋白和肽。分子量0-1,000Da从分析中剔除掉。峰值测定包括(a)基线扣除，(b)质量准确性的校正，(c)自动峰值检测。
生物标志图软件利用一套训练数据集来分析蛋白质特性。分类树将一套数据集分成两个节点，每次对一种形式的问题使用一个规则。根据峰的出现或缺失和强度水平作出分开的决定。样本级别决定终点的分类，而样本级别由此点大多数样本决定。成本函数的计算体现在每个节点的多样性。此过程选择的峰决定了分开的规则，这些峰是两派生节点上最大降低成本的关键。
(2)实验结果用统计学方法，分析所得数据的形式是用计算机读取的格式。过分析几千种血清蛋白峰，发现下述4种生物标志物可以用于区分对照组(正常人，非SARS但发烧患者)细胞及急性SARS(感染发烧后1-7天)患者细胞。
分析37例急性SARS(感染发烧后1-7天)病人与74例对照组(正常人及非SARS但发烧患者)血清中蛋白质的组成，结果发现3939±1Da，8136±1Da，11514±1Da，4137±1Da中4个蛋白质组成的生物标志物可将对照组(正常人及非SARS但发烧患者)与急性SARS(感染发烧后1-7天)患者准确的分组。
预测准确率用统计学分析及双盲分析中，结果显示用这4个蛋白质组成的生物标志物进行检测，发现36/37例急性SARS(感染发烧后1-7天)患者与67/73例对照组(正常人及非SARS但发烧患者)被正确分组，准确率为93.6％(103/110)。
敏感度和特异性在双盲分析中37例急性SARS患者(感染发烧后1-7天)中有36例患者被本方法诊断为SARS患者，73例对照组(正常人及非SARS但发烧患者)均被本方法诊断为非SARS患者。灵敏度为97.3％(36/37)，特异性为91.8％(67/73)。
(2)结论将来自具有统计意义的急性SARS(感染发烧后1-7天)患者群的样品与对照组(正常样品，非SARS但发烧患者)比较，用阴离子吸附表面芯片所捕获的4种血清蛋白生物标记，可以用于鉴别诊断。
本项发明提供了根据SARS的不同阶段而而在对象中表现异常的生物标记。本项发明中的生物标记依据其质量-电荷比(即mass-to-charge ratio，例如M3939表明其质量-电荷比为3939)来确定名称。所有的生物标记在用50mM的乙酸钠，pH4.0，进行清洗后，都被吸附在阴离子吸附表面芯片上(WCX2芯片)。首选的所有生物标记的生物源是血清。
本发明利用阴离子吸附表面芯片对37例确诊为急性SARS(感染发烧后1-7天)患者与73人对照组(正常人和非SARS但发烧患者)血清进行蛋白质对比分析，结果发现血清中质荷比3939±1Da，8136±1Da，11514±1Da，4137±1Da中的4个蛋白质相对含量有明显的差异，并且4个蛋白质所组合成的分组标准诊断急性SARS(感染发烧后1-7天)的灵敏度为97.3％，特异性为91.8％。因此，这是目前最好的诊断方法。
权利要求
1.一种用蛋白生物芯片捕获生物样品中蛋白质的蛋白质分析方法，其特征是采用激光解析电离分析对样品中蛋白质组进行鉴别检测。
2.权利要求1所述的蛋白质分析方法，其中所述的鉴别检测中蛋白质组的方法是质谱法。
3.权利要求1所述的蛋白质分析方法，所用蛋白生物芯片的吸附剂是阴离子。
4.权利要求1所述的蛋白质分析方法，所用蛋白生物芯片的吸附表面捕获多个生物标记，可以检测多个生物标记群。
5.权利要求1所述的蛋白质分析方法，所用蛋白生物芯片的吸附表面捕获涉及到血清生物标记(Serum Biomarkers)。
6.用权利要求1的方法分析生物样品中特异的生物标记以检测正常人细胞及非SARS但发烧患者细胞，急性SARS患者细胞在血液中生物标记的用途。
全文摘要
本发明涉及一种通过被阴离子吸附表面芯片上捕获的生物标记，并用激光解析电离质谱分析来检测生物标记。在一个蛋白生物芯片的吸附表面上捕获多个生物标记，并对捕获的生物标记进行分析。可以检测多个生物标记群。本发明的方法可用于检测血液中正常人细胞及非SARS但发烧患者细胞，急性SARS患者细胞的生物标志组合。用这些生物标记组合的诊断法可以鉴别SARS和正常人，非SARS。本方法准确、方便且快捷。
文档编号G01N33/569GK1595162SQ0315655
公开日2005年3月16日 申请日期2003年9月9日 优先权日2003年9月9日
发明者吴小意, 李晓燕 申请人:北京德易信达科技开发有限公司