专利名称：甲型流感病毒胶体金快速检测试纸的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗甲型流感病毒核蛋白单克隆抗体，产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株及含有该单克隆抗体的甲型流感病毒胶体金快速检测试纸。
背景技术：
流行性感冒(influenza)简称流感，是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病。临床特点为急起高热，全身酸痛、乏力，或伴轻度呼吸道症状。该病潜伏期短，传染性强，传播迅速。流感病毒分甲、乙、丙三型，甲型流感威胁最大。由于流感病毒致病力强，易发生变异，人群对变异株缺乏免疫力，易引起暴发流行，流感对人类的危害很大，一场流感的流行可导致人群平均寿命的降低。迄今为止，世界上已发生过四次大的流行和若干次小流行，造成数十亿人发病，数千万人死亡，严重影响了人们的生活和社会经济的发展。世界上最严重的流感爆发于1918年，有2000多万人死亡，超过第一次世界大战的总死亡人数，是造成死亡最多的一次传染病大爆发。而目前在美国，每年因流感导致的死亡人数超过车祸和艾滋病造成的死亡人数，在我国和发展中国家已成为严重危害人类健康的头号大敌。
甲型流感病毒是单链RNA病毒，基因组有8段RNA组成，而编码流感病毒蛋白。流感病毒分为甲型流感极易导致世界性流行；乙型流感则可局部流行，而丙型流感常呈散发流行。甲型流感病毒自1918年世界大流行后已发生了4次大变异。1933年首次分离出A0型，相继变异为A1(亚甲型，1946年分离)、A2(亚洲A型，1957年分离)、A3(香港亚洲A型，1968年分离)与新A1型(1977年分离)。对人危害大的是甲、乙型流感，而丙型流感危害不大。由于甲、乙型流感病毒表面的神经氨酸酶(NA)和血凝素(HA)逃避机体免疫系统的选择极易发生变异，而流感病毒的核蛋白(NP)不易发生突变，相对极为保守。因此以上流感病毒病原学的特征为流感的流行规律和诊断及防治研究奠定了基础。
流感四季均可发病，但以冬春季为多。5-20岁的发病率较高，但新亚型大流行则无显著年龄差别。本病的传染原为病人及隐性感染者，经飞沫传播，人群普遍易感，特别是小孩和老年人。本病除散发外，易发生暴发流行、大流行甚至世界性大流行。流感的流行常沿交通线迅速蔓延，先集体后散居，先城市后农村。
流感流行期间，根据接触史和群体发病史、典型临床症状和体征及实验室检查，可作出临床诊断。散发病例，因与许多急性病初期症状相似，诊断较为困难。只要全面掌握流行病学和临床特征及一些必要的实验室检查(血白细胞计数和分类、咽拭子培养、胸部X线检查等)，临床诊断也并不困难。
流感是由甲和乙型流感病毒引起的主要在冬季爆发的传染病。传染因素对传染的临床诊断很有用，在健康人群中这种传染被认为是可以自身抵制的，但对于幼儿和免疫力低的病人则可引起患病甚至死亡。因此在发病初期和临床病理的每个阶段执行明确的病理诊断是十分必要的。
临床病人由于不同的呼吸道病毒(如流感病毒，呼吸道合胞病毒，副流感，腺病毒等)感染引起的疾病症状可以十分相似，这导致了流行诊断比较困难，确诊往往依赖于实验室诊断。快速的诊断方法应该是在疾病的发病初期就可以得到明确的诊断，便于阻止疾病的传染及改变流行的爆发。
目前流感病毒的检测主要有以下几种方法一、常规实验室检测1、病毒分离实验室诊断流感的金标准是分离流感病毒。采用标本的时间以发病头5天为宜，鼻咽分泌物作为病毒分离的标本，阳性率高于其他标本。可以用鸡胚培养或用细胞培养的方法分离病毒。当前由于有”0”相毒株的出现，在分离流感病毒时应尽量考虑采用敏感细胞，用鸡胚时，采用羊膜腔接种。对分离物进行血凝活性检查时，不应采用鸡红细胞，而应采用人或豚鼠的红细胞。分离甲型乙型流感病毒多采用9-11日龄鸡胚。但是这些方法具有严重的缺陷。因为它们既费时又费力，通常需要2-7天才能得到最终结果，这样在临床方面对病人的有效治疗就有一定的局限性。
2、血清学检测用已知流感病毒抗原同时检测患者急性期和恢复期的双份血清，如果恢复期血清中抗流感病毒抗体效价比急性期高4倍或4倍以上有诊断意义。由于流感病毒抗原变异极为复杂，不同地区，甚至同一地区不同单位所流行毒株的抗原性不完全相同，因而进行血清抗体测定时，所用的抗原最好用当时当地的流行株加上代表性毒株，或流行株的核蛋白作为标志物为好。
2、1血凝抑制试验此法最大的优点是简便可靠。缺点是易受血清中非特异性抑制物的干扰影响，血清不需处理，恢复期血清的溶血圈比急性期大2mm以上方有诊断意义。
2、2单扩溶血测定此法的优点是敏感性比血凝抑制测定高些，不受测定血清中非特异性抑制物的干扰影响，血清不经处理，不必稀释就可来做实验。缺点是实验中需用补体。此测定所用抗原同血凝抑制试验，急性期和恢复期血清应在同一块板上，并有对照板。只有恢复期血清的溶血圈比急性期的大2mm以上方有诊断意义。
二、快速诊断直接检查病毒蛋白抗原和病毒核酸可达到快速诊断目的，常用方法有免疫荧光法、免疫酶法、放射免疫法、免疫胶体金、电镜技术、核酸杂交和PCR法等。
1、免疫学方法1、1免疫酶法免疫酶法(EIA)的基本原理，是利用酶与抗体与抗原结合后，形成酶结合物，它既不改变抗体或抗原的免疫学活性，又保留酶本身的酶学活性，然后加入酶的相应底物，在酶的催化作用下使原来无色的底物发生水解、氧化或其他反应，生成有色产物。
利用Directigen甲型流感病毒快速诊断试剂盒(Directigen Flu-A)，诊断实验可在15分内完成，可直接用从病人采集的咽漱液或咽拭子浸出液进行检测。该实验是以免疫酶染法为基础而设计的。首先用去垢剂混合物提取各种临床标本中的病毒抗原，再将病毒抗原滴加于具有吸附能力的检测膜上。然后加入碱性磷酸酶标记的抗甲型流感病毒核蛋白单克隆抗体，待抗原与抗体充分作用后加入底物显色。该法敏感快速，但操作复杂。
Boon A.C.M.等利用微孔滴度细胞酶免疫法(cell-EIA)用来做为地区监测流感甲的方法。根据不同的颜色反应或二抗不同的标记，可以用来检测流感甲不同的亚型(H3N2，H1N1，H5N3，H5N1，H7N7，H9N2)，此方法在一天中可以检测大量的样本。流感爆发季节可以作为快速有效便宜的诊断流感甲的方法。利用cell-EIA和商品化的Directigen Flu-A对样本的诊断进行比较，cell-EIA灵敏性(74％)和特异性(91.6％)均高于Directigen Flu-A(65％，84.6％)，但灵敏性和特异性有待提高。
Reina J等用新的dot blot EIA方法可以同时并快速直接检测甲和乙型流感病毒抗原。他们对临床160位标本鉴定，利用细胞法鉴定74位为流感阳性，利用新EIA法对鉴定的阳性标本进一步鉴定，68.9％被鉴定阳性。其中41例甲流感利用新EIA法鉴定有34例为阳性；33例乙流感利用新EIA法鉴定有17例为阳性(P＜0.05)，利用EIA法鉴定没有假阳性结果。结果表明可以利用此法进行对甲流感的常规诊断。
EIA敏感性高，特异性强，操作简便，肉眼可观察，便于大规模检测，在流感病毒研究中，它主要用于流感的快速诊断和单克隆抗体筛选，很少用于病毒株的抗原性分析，因发现它特异性不高，不同亚型毒株间易出现交叉反应。
1、2免疫荧光法 将患者鼻咽分泌物脱落细胞涂片，用免疫荧光法可直接查流感病毒抗原。免疫荧光是一高度敏感和特异的技术，但它需要在标本中少量的细胞和专业的技术人员来解释结果。
1、3免疫胶体金 胶体金标记，实际上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理可能是胶体金表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。目前医学检验中应用的免疫胶体金诊断技术主要有两种，胶体金快速免疫层析法和快速斑点免疫金渗滤法。这两种方法的基本原理都是以微孔滤膜为载体，包被已知抗原或抗体，加入待检标本后，经滤膜的毛细吸管作用或渗滤作用使标本中的抗原或抗体与膜上的包被的抗体或抗原结合，再用胶体金结合物标记而达到检测目的。Patterson S等利用免疫胶体金方法检测流感内部蛋白和外部蛋白的抗原决定簇，并可用于快速检测流感病毒，但是特异性不高。
免疫胶体金快速诊断技术具有放射免疫法、酶免疫法等诊断方法不可取代的优点首先，它不需要酶联免疫法中所要求的底物，因而可省去一些操作步骤，使操作简单化；其次。胶体金无污染，不会危害操作者、以及污染环境；再次，胶体金抗体复合物在冻干状态下室温储存稳定；此外胶体金还具有检测迅速、灵敏、不需要复杂仪器设备、产物显色永久不褪等优点。
由于免疫胶体金快速诊断技术已日趋成熟，以及它的便捷、灵敏、安全、低成本等特点，使其在诊断领域中迅速推广。目前市场上出售和各文献报道主要集中在妇女妊娠测系列、病原体抗原或抗体检测系列、药物滥用检测系列、疾病相关蛋白检测系列等。
2、基因诊断2、1核酸杂交法 此法比电镜、免疫酶标等方法更为特异、敏感，而且可定量与分型。目前常用于流感病毒快速诊断和毒粒基因分析。核酸分子杂交技术能广泛的用于临床标本中病毒序列的检测，只是因为常规应用的方法(如免疫学方法等)就可成功的检测临床标本中的病毒，临床就不需要它来诊断疾病。另一方面，核酸分子杂交技术作为诊断疾病的工具仍有一定的困难，如需要一定的设备，费时长，故在许多实验室尚不能作为常规诊断方法来应用，因此目前该方法仅用于研究。
2、2 RT-PCR 对许多RNA病毒来说RT-PCR诊断方法比传统的病毒分离和抗原诊断方法既快又灵敏。在鸟类和家禽类等动物中已检测到流感甲具有15种HA和9种NA，并且在香港发现动物中的H5N1和H9N2型流感病毒也可以直接传染给人类。虽然病毒分离和免疫荧光等是流感检测强有力的工具，但在检测不同表型的鸟类和畜类流感方面可能会出现假阴性结果。Fouchier RA.M等利用流感甲第7基因节段膜蛋白保守基因序列做引物，进行RT-PCR检测，快速、灵敏、特异，并且对目前所知道的流感甲基因变异种类均适用。
RT-PCR可以很容易的同时诊断多种病毒，另一些诊断方法如病毒分离和免疫荧光分析却不能。虽然免疫荧光分析可利用临床标本的细胞检测流感甲和乙，腺病毒，呼吸道合胞病毒抗原的存在，但对流感和腺病毒的诊断并不是广泛应用。虽然病毒分离被认为是金标准，但由于流感和腺病毒的同时感染，可以在腺病毒生长明显之前就破坏细胞单分子层，这样就很难通过细胞培养的方法鉴定这些呼吸道病毒。
甲型、乙型流感病毒，呼吸道合胞病毒的A型B型，腺病毒，呼吸道合胞病毒等多种病毒可引起病毒性呼吸道感染、中耳炎、腮腺炎。由甲和乙流感病毒引起的感染可以从轻微的呼吸道疾病到致死性肺炎，并且可爆发世界性的发病和死亡。丙型流感病毒通常只在儿童和青少年中引起轻微的呼吸道疾病，引起地方性的流行。丙型流感病毒很难找到快速和敏感的诊断方法在于对其流行病学行为了解较少。Coiras MT等根据流感病毒核蛋白的保守区域，呼吸道合胞病毒的融合蛋白基因，腺病毒的六邻体蛋白基因合成PCR引物，利用多重反转录巢式PCR的方法可同时诊断甲乙丙型流感病毒，呼吸道合胞病毒和腺病毒等引起相似临床症状的呼吸道病毒[15]。Grondahl B等利用多重反转录PCR(m-RT-PCR)的方法可以在一次实验中快速的诊断出流感甲乙型病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、肠道病毒、副流感1、3型病毒这9种引起相似急性呼吸道感染的病原体。和对于较多组织不适应的EIA法比较，m-RT-PCR诊断结果和正确结果的符合率达95％以上。
Plakokefalos E等对甲型、乙型流感病毒的诊断用ELISA和RT-PCR进行比较，ELISA和RT-PCR的敏感性分别是64％和100％，特异性分别是98％和97％；阳性诊断分别是94％和86％，阴性诊断分别是93％和100％。结果表明RT-PCR比ELISA有明显的敏感性，当发生病毒灭活现象时仍可检测出流感的发生；并且对流感的地区性监测管理有诊断意义。
Rebelo H.等对流感的爆发利用病毒分离，EIA，RT-PCR，补体结合实验进行诊断并做比较。连续7年中的1685个流感相似样本中RT-PCR、EIA、病毒分离的阳性诊断率分别为43.6％，17.5％，5％。结果表明RT-PCR诊断比其它三种诊断方法快、灵敏，并和地区流感爆发的形式有很好的相关性。
尽管基因检测技术有很多优点，但也有不足之出，如PCR技术，最大的优点恰恰带来了它在实际应用中最大的障碍，DNA扩增的高效性导致了极微量的污染即可出现假阳性，因而使结果失真。此外，病毒作为外原基因的入侵者，必需在阐明其全部或部分核苷酸序列时，才可以设计引物或探针，进行核酸分子杂交和PCR检测。
从现有的流感检测方法可见，病毒分离、EIA、RT-PCR诊断方法尽管都有一定的特异性和敏感性的优点，但在操作上需要专业技术人员、专门的仪器设备和特定的条件及费时等缺点，而近年发展成熟的免疫胶体金诊断技术具有特异性高、敏感性高、操作简单而不需要专业人员和仪器设备，已成为流感快速诊断的发展方向。
发明内容
本发明的目的是提供一种可以快速，准确检验甲型流感病毒的甲型流感病毒胶体金快速检测试纸。
本发明的另一目的是提供了抗甲型流感病毒核蛋白单克隆抗体，及产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
为达上述目的，本发明采用的技术方案如下本发明所用产生甲型流感病毒核蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株3F1已于2003年7月30日，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC0987。
本发明抗甲型流感病毒核蛋白单克隆抗体，可以用常规技术从保藏号为CGMCC0987的杂交瘤细胞株3F1产生。
本发明甲型流感病毒胶体金快速检测试纸，其包含从保藏号为CGMCC0987的杂交瘤细胞株3F1产生的抗甲型流感病毒核蛋白单克隆抗体。
本发明的优点是本发明甲型流感病毒胶体金快速检测试纸具有以下特点①检测快速10分钟内出结果；②特异性仅对甲型流感病毒呈阳性，而对其它呼吸道病毒和细菌等13种以上病原体呈阴性结果；③敏感性对甲型流感病毒核蛋白可以检出15ng的水平。
④准确率高经八所三甲医院临床试验共3000例，与免疫荧光和免疫酶联比较，总符合率为96.5％～99.0％；⑤保存和运输方便在室温下可保存18个月。
⑥临床及家居使用上极为便利，而且具有产业性。
为了进一步理解本发明的实质，下面结合具体实施方式
对本发明做进一步说明。
具体实施例方式
实施例1抗甲型流感病毒单克隆抗体的制备(1)髓瘤细胞SP2/0骨髓瘤细胞购于军事医学科学院微生物流行病研究所。用时将储存在液氮罐中的SP2/0细胞复苏，在含有10％小牛血清DMEM培养液中培养48-72小时，待细胞生长良好，细胞浑圆、透亮、大小均一、排列整齐，呈对数分裂，准备融合。
将DMCK细胞培养好后，直接涂玻片上，-30℃超低温冰箱保存，供监测抗细胞克隆用。
(2)免疫亲代细胞流感A1(A/京防25/96 H1N1)、流感A3(A/沪防/1/98 H3N2)型病毒购于中国预防医学科学院病毒研究所国家流感中心。将病毒株复苏分别接种在DMCK细胞中培养，待细胞病变达(+++)，立即放入-70℃超低温冰箱保存，以此作为免疫动物的抗原。
流感A1、流感A3病毒抗原基质片的制备将流感各型病毒接种在DMCK细胞培养，待细胞病变达(+++)时，将细胞从瓶壁上消化下来，离心沉淀，取洁净活胶棉涂的10孔玻片，将病变细胞平铺于玻片孔内，立即用电风扇吹干，丙酮固定，再吹干，-30℃超低温冰箱保存，备抗体检测用。
制备的抗原液从-70℃超低温冰箱取出溶解后，用4号针头分别给BALB/C小鼠(购于军事医学科学院动物中心)鼻孔滴入5-6滴，每只二次，间隔10天。融合前3日，在小鼠脾脏和腹腔以抗原各0.15ml进行攻击。
(3)细胞融合融合剂PEG(分子量1500，日本产)；培养液10％小牛血清DMEM。SP2/0细胞和免疫的BALB/C鼠的淋巴细胞分别按2×107和1×108比例融合。
(4)阳性孔的监测将融合孔上清液分别加在上述病毒基质片上和DMCK细胞片上。放37℃恒温箱内30分钟。以免疫荧光技术羊抗鼠荧光标记物显示。以荧光显微镜观察结果，凡于病毒片反应者又于MDCK细胞片反应者，为抗细胞阳性孔，应弃掉。同时用重组乙型流感病毒核蛋白10μg/ml包被抗原板，加上融合孔上清，并以羊抗鼠酶标记二抗，以酶联仪测定，凡是大于空白对照2个OD值为阳性。
(5)获得阳性孔流感A1检出38孔阳性孔；流感A3检出44孔阳性孔。
(6)阳性孔进行扩大培养、传代与克隆将各型流感阳性孔立即进行复苏、冻存，进行传代及复苏的冻存工作。
(7)流感A1的5个株；流感A3的5个株以有限稀释法进行克隆化，培养传代5个月。约传40代，每传1代进行一次检测，并进行反复液氮冻存和复苏。
(8)甲型流感核心单克隆抗体(FluA-McAb)的获得采用间接酶联免疫方法鉴定甲型流感病毒核心抗原单克隆抗体，首先用基因重组表达的核心蛋白抗原(15μg/ml)包被酶联板，-4℃过夜，第二天用洗涤液洗3次，然后加入制备的FluA3-McAbs，充分结合后，加入酶标鼠二抗反应，筛选并获得针对核蛋白的单克隆抗体，这样共获得产生甲型流感病毒核蛋白单克隆抗体的甲型流感核蛋白的杂交瘤细胞株5株。
(9)抗体分泌稳定性实验以上5株产生甲型流感核蛋白的杂交瘤细胞株FluA-McAb5株经连续克隆化检测单克隆抗体(McAb)阳性率达100％，在体外传代5个月，并经反复冻存复苏均能达到保持稳定的分泌抗体，上清效价1∶6400-1∶12800(++)IFA，或间接酶联免疫上清效价在1∶25600-1∶51200以上。
(10)细胞核学特征对上述杂交瘤细胞中期染色体检测流感A为84条；证明他们是SP2/0骨髓瘤与小鼠细胞的杂交瘤细胞。
(11)，选取其中的一株产生抗甲型流感病毒核蛋白的杂交瘤细胞株命名为3F1，并于2003年7月30日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC0987。
实施例2鼠源病毒检查为了鉴定制备的抗甲型流感病毒核蛋白单克隆抗体的特异性，即与所使用的鼠源病毒无交叉反应。
检查鼠源病毒包括出血热病毒(EHFV)；淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)；3型呼肠弧病毒(Reovirus)；仙台病毒；脱脚病病毒；小鼠腺病毒(MAV)；小鼠肺炎病毒(PVM)。
细胞接种法将CGMCC 0987 3F1杂交瘤细胞株分泌上清分别接种于Vero(非洲绿猴肾传代细胞)；2BS(人胚肺)二倍体细胞，接种量为107。接种细胞后传两代，观察细胞是否有病变，同时制片，用IFA法检测病毒抗原，为阴性。
动物接种法CGMCC 0987 3F1杂交瘤细胞株接种出生24小时以内乳鼠各10只；体重15-20克成年小鼠个10只；体重300-350克的豚鼠各5只。每只动物腹腔内接种107活细胞，存活率为85％。
鸡胚接种法培养的CGMCC 0987 3F1杂交瘤细胞株接种SPF鸡(购于北京市实验动物研究中心)胚尿囊腔和卵黄囊，每种途径10只，每只接种106活细胞孵育5天，用1％鸡血球做HA检测病毒血凝素为不凝集，同组鸡胚中80％存活。
实施例3支原体检查培养法CGMCC 0987 3F1杂交瘤细胞株细胞制片加支原体单克隆抗体(购于军事医学科学院微生物流行病研究所)作用30分钟，荧光染色，同时做阴、阳性对照，结果阴性对照结果(-)；阳性对照结果(+)；检测标本结果阴性。培养上清进行包被后加单克隆抗体，用ELISA方法检测，同时做阴性对照，标本结果阴性。
实施例4单克隆抗体的检定免疫球蛋白类及亚类用免疫双扩散法，结果CGMCC 0987 3F1杂交瘤细胞株产生的抗甲型流感病毒核蛋白单克隆抗体(3F1-McAb)为IgG2a。
亲和力CGMCC 0987 3F1杂交瘤细胞株产生的抗甲型流感病毒核蛋白单克隆抗体(3F1-McAb)用IFA法测定亲和力常数为1.1×10-6M/L。
实施例5特异性封闭试验以兔抗3F1-McAb血清封闭，证实3F1-McAb分别被不同浓度的异种动物血清封闭。
采用IFA方法3F1-McAb与甲型流感病毒结合，呈阳性反应。与MDCK细胞结合，呈阴性反应。以上证明单抗与靶抗原的特异性，同时采用免疫印迹试验技术识别抗原表位特性，结果表明FluA抗原经还原剂处理后，SDS-PAGE 12％梯度胶电泳，能分辨二十多条清晰的蛋白带，转印后采用HRP染色，结果3F1-McAb与56KD核蛋白抗原起反应。
实施例6交叉试验3F1-McAb与流感B病毒、副流感病毒1、2、3型、腺病毒3、7型、呼吸道合胞病毒，呼肠病毒及SARS病毒均呈阴性反应。
效价测定
3F1-McAb间接荧光法IFA测定效价1∶6400-1∶12800；间接酶联测定效价1∶25600-1∶51200。
实施例7细胞库的建立和抗甲型流感病毒核蛋白单克隆抗体的生产单克隆抗体生产场所应符合GMP要求，洁净无污染，工作人员无传染病，不得从事其他可以导致传染源污染单抗制剂工作；无关人员不得进入生产区内，在同一年内，不得同时生产其他无关单抗。
1、细胞库建立原始细胞库和生产细胞库及种子批。
1、1原始细胞库3F1杂交瘤细胞产生抗甲型流感病毒核蛋白的3F1杂交瘤细胞。
1、2种子细胞库3F1杂交瘤细胞，为扩大培养冻存的细胞种子，每批细胞管数20支，贴上标签方入液氮罐中保存。每批留取保存时进行细菌、真菌、支原体及病毒污染的检测。
1、3生产细胞库经检定合格的3F1杂交瘤细胞按生产条件大量培养，冻存的细胞管数为生产细胞库。每一生产细胞批细胞管数10支，每次生产腹水时取生产管1支复苏、扩增及生产，不再回冻。
2、抗甲型流感病毒核蛋白单克隆抗体的制备2、1小鼠腹水法(1)小鼠SPF级小鼠，经检查无鼠源病毒污染，在腹水生产过程中如发现动物不健康、咬伤、感染者应弃掉。
(2)动物实验设施有北京医学动物管理委员会颁发的医学动物二级以上合格证。
(3)细胞扩大培养取生产批细胞管1支复苏，加营养液进行扩大培养，1支生产细胞只用一次，不再冻存。
(4)细胞接种制备腹水均需在无菌条件下进行，注射杂交瘤细胞之前，每只小鼠腹腔注射降植烷0.5ml。一周后每只小鼠注射3F1杂交瘤细胞1-3×106。
(5)腹水的采集注射细胞后7-10天，或小鼠濒死前一次采集腹水，亦可以多次采集。离心分离出上清即为粗提抗体。注明批号、采集日期，置-20℃保存。
2、2细胞培养法可用细胞培养瓶培养收集上清液制备单克隆抗体。
(1)种子细胞来源于生产细胞库。
(2)培养基牛血清培养基。
(3)抗体收集可一次性收集，也可以连续收集，每一管种子细胞扩大培养后收集的上清为一个批号。
2、3粗制抗体的检测无论是小鼠腹水还是细胞培养法制备的单克隆抗体，都需进行如下检定(1)无菌试验。(2)支原体检查。(3)鼠源病毒检查。(4)效价测定合格用于抗体的纯化。
2、4抗体纯化(1)将3F1-McAb分别用50％、33％、33％三种浓度的SAS盐析三次。SAS一般不会引起蛋白质变性，可以出除不需要的白蛋白分子。
(2)DEAE-52纤维素对盐析过的单克隆抗体进行洗脱，可见抗体活性峰与蛋白峰的重叠。
(3)结果3F1-McAb腹水纯化回收率分别为100％，免疫电泳结果显示一条清晰的沉淀线。
(4)应用将纯化的单克隆抗体按效价的4-8单位应用于检测。
连续生产三批，各批产品必须符合质检要求，批间具有良好的重复性。
1)腹水效价的检定3F1-McAb腹水自腹腔取出后，立即分别用FluA抗原基片进行效价测定，要求IFA效价达到1∶6400-1∶12800，或间接酶联免疫上清效价达到1∶25600-1∶51200。
2)腹水纯化随时测定纯化后的效价，要求每次测定(IFA)效价应达1∶6400-1∶12800。
2、5纯化后处理(1)灭活必要时56℃水浴灭活30分钟，离心取上清。
(2)合并不同亚批的合格制品合格后在2-8℃放置一个月以上，除去部分不稳定蛋白。
(3)除菌分装将灭活单抗用0.22um滤膜过滤，过滤后，每4-8单位加入青霉素10单位，链霉素1ug/ml，再加入适量的20％甘露醇进行分装，每支2ml，-30℃过夜，次日再进行冻干。
实施例8单克隆抗体的大量生产采用体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。
(1)实体瘤法对数生长期的3F1杂交瘤细胞按1～3×107/ml接种于小鼠背部皮下，每处注射0.2ml，共2～4点。待肿瘤达到一定大小后(一般10～20天)则可采血，从血清中获得单克隆抗体的含量可达到1～10mg/ml。但采血量有限。
(2)腹水的制备常规是先腹腔注射0.5ml Pristane(降植烷)或液体石蜡于BALB/C鼠，1～2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获5～10ml腹水。也可用注射器抽提腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达到5～10mg/ml，这是目前最常用的方法，还可将腹水中细胞冻存起来，复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水快、量多。
实施例9大量单克隆抗体的纯化单克隆抗体的纯化方法同多克隆抗体的纯化，腹水特异性抗体的浓度较抗血清中的多克隆抗体高，纯化效果好。按所要求的纯度不同采用相应的纯化方法。一般采用盐析、凝胶过滤和离子交换层析等步骤达到纯化目的，也有采用较简单的酸沉淀方法。目前最有效的单克隆抗体纯化方法为亲和纯化法，多用葡萄球菌A蛋白或抗小鼠球蛋白抗体与载体(最常用Sepharose)交联，制备亲和层析柱将抗体结合后洗脱，回收率可达90％以上。蛋白可与蛋白可与IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3结合，同时还结合少量的IgM。洗脱液中的抗体浓度可用紫外光吸收法粗测，小鼠IgG单克隆抗体溶液在A280nm时，1.44(吸光单位)相当于1mg/ml。经低pH洗脱后在收集管内预置中和液或速加中和液对保持纯化抗体的活性至关重要。
实施例10甲型流感病毒胶体金快速检测试纸的制备(1)胶体金的制备采用化学还原法，向氯化金水溶液内加入柠檬酸三钠还原剂，使金离子聚合成40nm胶体金颗粒。先将0.01％的HAuCl4溶液500ml加热至沸腾，迅速加入6.5ml 1％柠檬酸三钠水溶液，加热至出现红色后继续煮沸7～10min。恢复体积至500ml。
(2)胶体金-抗体结合物制备及纯化①、取胶体金颗粒溶液500ml，在磁力搅拌器下用0.2M K2CO3调解PH至8.2。
②、将本发明实施例7或8制备的抗甲型流感病毒核蛋白单克隆抗体用0.01M PB稀释成1mg/ml。取5支试管各加入1ml胶体金溶液，分别加入在前4管30ul、40ul、45、50ul待标记抗体，最后一管作为对照。混匀后室温放置5分钟，前4管中各加入100ul浓度为10％的NaCl。混匀后室温放置10分钟，和对照管对比，以没有变蓝色的一管所加入的抗体量作为最佳蛋白标记量。在此基础上加10％，作为标记使用量。
③、根据体积和标记实用量计算标记所需蛋白量，将1mg/ml的单克隆抗体缓慢加入胶体金溶液中，加入10mg蛋白的时间不超过5分钟。室温下搅拌30分钟。进行胶体金—抗体结合物稳定性检定取出2支试管，每管中加入1ml已经加入抗体的胶体金溶液，其中一管中加入100ul浓度为10％的NaCl，混匀后室温放置10分钟。对比两管的颜色，应无变化。
④、加10％BSA，至终浓度为1％，室温搅拌5分钟。
⑤、加10％PEG，至终浓度为0.2％，室温搅拌5分钟。
⑥、8000rpm/min离心30分钟，小心吸去上清，用200ml胶体金保存液悬浮沉淀，再次以8300 RPM离心30分钟，小心吸去上清。用50ml胶体金保存液悬浮沉淀。置4℃保存备用。
(3)胶体金-抗体结合物玻璃纤维素膜的制备取胶体金-抗体结合物溶液，均匀喷在玻璃纤维素膜上，放在平坦的塑料板上，然后冷冻1小时，放入冷冻干燥机上冻干过夜，至完全干燥。切成0.6～0.8cm宽的条，干燥环境中保存。
(4)抗体固相硝酸纤维素膜的制备①、将本发明实施例7或8制备的抗甲型流感病毒核蛋白单克隆抗体用0.01MPBS稀释成3.5±0.1mg/ml。用喷膜机将以上抗体以1ul/cm的速度喷于硝酸纤维素膜上(检测线)。
②、将羊抗鼠IgG多克隆抗体稀释用0.01MPBS稀释成2±0.1mg/ml。用喷膜机将以上抗体以1ul/cm的速度喷于硝酸纤维素膜上(对照线)。和检测线的间隔为0.5cm。
③、把固定有抗体的硝酸纤维素膜置37℃烤箱中干燥30分钟。充分干燥。
④、置2℃~8℃干燥环境中保存备用。
(5)组装试纸①、在塑料板中间位置粘铁抗体固相硝酸纤维素膜。
②、在塑料板上固定硝酸纤维素膜位置的顶端，粘附吸水垫，低端粘附金标记抗体结合物-玻璃纤维素膜条带。吸水垫和胶体金垫应覆盖硝酸纤维素膜边沿约1毫米左右。
③、胶体金垫下方粘附样品垫，样品垫覆盖胶体金垫约1毫米。
④、在切条机上切成0.4cm宽的条带。
(6)包装(7)成品入库根据检定结果进行分类，然后将制备的甲型流感金标记快速检测试纸按要求入库。
(8)检定合格成品置常温下保存。
甲型流感病毒胶体金快速检测试纸质量保证1杂交瘤细胞株的质量保证(1)亲本骨髓瘤细胞购于军事医学科学院微生物流行病研究所，该细胞具有稳定遗传性和无限增殖能力。
(2)免疫亲代流感毒株细胞购于中国预防医学科学院病毒研究所国家流感中心，是经过技术检定符合质量标准的细胞株。
(3)免疫小鼠Balb/C购于军事医学科学院动物中心，该中心具备SPF级饲养场所，并经过国家认证，小鼠经过检定，符合国家标准。
(4)建立单克隆细胞检定方法检测结果抗体分泌稳定性阳性率为100％，细胞核学特征符合杂交瘤的核学特征，鼠源病毒检查为阴性，支原体检查为阴性，无菌试验为阴性。
2单克隆抗体的质量保证(1)免疫球蛋白类及亚类用免疫双扩散法，结果符合要求。
(2)亲和力用IFA法测定亲和力常数为1.1×10-6M/L，符合要求。
(3)特异性采用IFA方法，特异性为100％。
(4)交叉试验3F1-McAb与流感B病毒、副流感病毒1、2、3型、腺病毒3、7型、呼吸道合胞病毒，SARS病毒均呈阴性反应。
(5)效价测定用间接荧光法(IFA法)，不低于1∶6400-1∶12800，符合要求。
3粗制抗体的检测无论是小鼠腹水还是细胞培养法制备的甲型单克隆抗体，都需进行如下检定(1)无菌试验为无菌生长，阴性。
(2)支原体检查为阴性。
(3)鼠源病毒检查为阴性。
(4)效价测定用IFA法测定或间接酶联免疫法测定，符合纯化要求。
成品质控标准的建立1、成品外观检查试纸条宽度4mm±0.2mm试纸表面平整，边沿整齐。
试纸条个组分粘贴牢固，衔接紧密，以保证加样后液体的移动连续。
2、液体移行速度抽提液在硝酸纤维素膜上移动2cm时间不低于15秒。
实验本发明流感病毒甲型胶体金快速检测试纸的检测结果评价实验1甲型流感病毒不同亚型的反应15株不同甲型流感病毒鸡胚培养病毒上清全部呈阳性。其中甲1型7株甲3型8株。
实验2交叉反应和呼吸道合胞病毒无交叉反应；和副流感病毒1、2、3型无交叉反应；和腺病毒3、7型无交叉反应；和4株SARS病毒无交叉反应。
实验3流感病毒甲型胶体金快速检测试纸的真实性评价。
灵敏度500份阳性样品中检测出阳性494份，灵敏度为98.8％。
特异度500份阴性样品种检出阴性496份，特异度为99.2％。
实验4对比实验选取四种甲型流感病毒鸡胚培养病毒上清，其中甲1型和甲3型各2株。
将该四种甲型流感病毒鸡胚培养病毒上清用抽提液作不同浓度的稀释，然后用美国Quidel公司产品和本公司产品作对比检测。结果如下
权利要求
1.具有保藏号为CGMCC 0987的杂交瘤细胞株。
2.抗甲型流感病毒核蛋白单克隆抗体，可以从具有保藏号为CGMCC 0987的杂交瘤细胞株产生。
3.甲型流感病毒胶体金快速检测试纸，其特征在于其包含权利要求2所述的抗甲型流感病毒核蛋白单克隆抗体。
4.如权利要求3所述的甲型流感病毒胶体金快速检测试纸，其特征在于权利要求2所述的抗甲型流感病毒核蛋白单克隆抗体包附胶体金。
全文摘要
本发明公开了保藏号CGMCC0987的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株产生的抗甲型流感病毒核蛋白单克隆抗体，及含有该单克隆抗体的甲型流感病毒胶体金快速检测试纸。该检测试纸可以检测快速甲型流感病毒，特异性、敏感性及准确率高，保存和运输方便，临床及家居使用上极为便利，而且具有产业性。
文档编号G01N33/569GK1591014SQ0315652
公开日2005年3月9日 申请日期2003年9月3日 优先权日2003年9月3日
发明者王炳彦 申请人:北京阿斯可来生物工程有限公司