修饰型生物素结合蛋白的制作方法

专利名称：修饰型生物素结合蛋白的制作方法
技术领域：
本申请要求2008年8月13日提出的日本国专利申请2008-208766的优先权。
本发明涉及修饰型生物素结合蛋白。
背景技术：
抗生物素蛋白是卵清来源的蛋白质，链霉菌抗生物素蛋白是放线菌 (Streptomyces avidinii)来源的蛋白质。抗生物素蛋白或链霉菌抗生物素蛋白与生物素 (D-[ (+) -Cis-六氢-2-氧代-IH-噻吩并-(3，4)-咪唑-4-戊酸]之间的亲和性(affinity) 非常高(KD = 10_16 _14)，是两生物分子间相互作用之中最强的相互作用之一。分子量是 60kDa左右。现在，抗生物素蛋白/链霉菌抗生物素蛋白-生物素相互作用在生物化学、分子生物学或医学领域有着广泛应用(Green, (1975), Adv. Protein Chem.，29 :85-133 ；Green, (1990) ,Methods Enzymo 1.，184 :51-67)。抗生物素蛋白/链霉菌抗生物素蛋白这两种蛋白质均形成四聚体，每一个亚基结合1分子的生物素。
在抗生物素蛋白的利用方面，其非特异性结合是一个问题。抗生物素蛋白有些情况下与细胞、DNA、蛋白质或膜这些生物体成分非特异性结合，例如，在使用抗生物素蛋白-生物素结合对物质进行检测时，有些情况下抗生物素蛋白与检测对象物质以外的物质发生非特异性结合，导致背景增高。作为抗生物素蛋白的非特异性结合高的理由，可以列举出等电点高、具有分子量的约10%的糖链、等等。抗生物素蛋白是强碱性蛋白质，其等电点为10以上非常之高，整体上带有正电荷，因而可以认为其容易与带负电荷的物质居多的生物体成分发生结合。
此外，可以认为，抗生物素蛋白表面的糖链容易与生物体成分结合(Marttila等， (2000) FEBS Lett，467，31-36)。为了降低抗生物素蛋白的非特异性结合，进行了下述的研究利用糖苷酶除去抗生物素蛋白的糖链而得到的化学修饰中性抗生物素蛋白的研究 (Bayer 等，(199 Appl Biochem Biotechnol，53 (1)，1-9)，通过将抗生物素蛋白中的糖基化靶点即17位的天冬酰胺残基取代成异亮氨酸残基来生物合成不受糖链修饰的抗生物素蛋白的研究(Marttila等，(2000) FEBS Lett，467，31-36)，等等。而且，还进行了通过采用基因工程方法将抗生物素蛋白所具有的赖氨酸残基、精氨酸残基变换为中性氨基酸、 酸性氨基酸，来降低抗生物素蛋白的等电点的研究(Marttila等，(1998)FEBS Lett,441, 313-317)。
然而，通过这样的修饰，虽然例如DNA、细胞针对抗生物素蛋白的非特异性结合得以降低，但关于在应用于临床检查系统等时所必须的针对人血清的非特异性结合的抑制， 尚未进行充分研究。此外，在生物合成抗生物素蛋白变体时，有必要使用基于昆虫细胞的表达系统。因此，现状是因培养需要时间及成本高，序列修饰抗生物素蛋白尚未达到实用化。
作为关于抗生物素蛋白、链霉菌抗生物素蛋白这样的生物素结合性蛋白质与生物素之间的亲和性的研究，有报告称，对链霉菌抗生物素蛋白的结构进行大的修饰，增强了其与荧光生物素的结合(Asian 等，(2005) Proc Natl Acad Sci U.S.A.，102，8507-8512)。但是，该蛋白质同时大幅损失了与生物素的结合能力。
本发明人等从食用菌白黄侧耳(Plueurotus conucopiae)中纯化了对稻瘟病菌 (Magnaporthe grisea)显示抗菌性的蛋白质。发现该蛋白质显示生物素结合性，将其命名为tamavidinaamavidin 1)。tamavidin 1蛋白质的氨基酸序列、以及编码该蛋白质的基因的碱基序列均在W002/072817中公开(W002/072817中的SEQ ID NO 1和2)。而且， 还从同一食用菌中鉴定出tamavidin 1的同源物(tamavidin 2)，其显示具有强的生物素结合能力。tamavidin 2蛋白质的氨基酸序列、以及编码该蛋白质的基因的碱基序列均在 W002/072817中公开(W002/072817中的SEQ ID NO :3和4)，且重组蛋白质的生产也取得了成功。tamavidin 1和2可在大肠杆菌中表达，特别是tamavidin2可以通过使用亚胺基生物素柱的纯化容易地制备，且其与链霉菌抗生物素蛋白相比具有更高的耐热性，就这点而言，其是一种优异的生物素结合性蛋白质。然而，在针对核酸和/或蛋白质的非特异性结合方面，其虽然比传统的抗生物素蛋白少，但却与链霉菌抗生物素蛋白程度等同。
现有技术文献 专利文献 专利文献1 :W002/07^17A1 非专利文献 非专利文献2 :W02008/081938A1 非专利文献1 :Marttila 等，(2000) FEBS Lett，467，31-36 非专利文献2 :Bayer 等，(1995)Appl Biochem Biotechnol，53 (1)，1-9) 非专利文献3 :Marttila 等，(1998) FEBS Lett，441，313-317 非专利文献4 :Α1οη 等，(1990) Biochem Biophys Res Commun, 170,1236-1241 非专利文献5 :Aslan 等，(2005) Proc Natl Acad Sci U. S. A.，102，8507-8512 非专利文献6 :Weber 等，(1989) Science 243:85-88 非专利文献7 =Livnah 等，(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 90 :5076-5080 非专利文献8 :Qureshi et al. (2001) J. Biol. Chem. 276 (49), p. 46422-46428

发明内容
发明所要解决的问题 本发明的课题是提供在保持生物素结合能力高的tamavidin的特性的同时，性能提升的修饰型生物素结合蛋白，所述性能提升是指非特异性结合性降低和/或进一步的生物素结合提高。
解决问题的方法 本发明通过对天然的tamavidin 2(以下，在本说明书中也记作“TM2”)的氨基酸序列(SEQ ID NO 2)进行修饰，成功地提高了其性能。
本发明的优选实施方式 本发明优选包含以下实施方式。
[实施方式1] 在包含SEQ ID NO :2所述的氨基酸序列、或在该序列中具有一个 数个氨基酸突变的氨基酸序列、或与该序列具有80%以上的同一性的氨基酸序列，且显示生物素结合活性的蛋白质中，选自下组中的一个或多个残基被取代成酸性氨基酸残基或中性氨基酸残基的修饰型生物素结合蛋白 1) SEQ ID NO 2的104位的精氨酸残基； 2) SEQ ID NO 2的141位的赖氨酸残基； 3) SEQ ID NO 2的洸位的赖氨酸残基；以及 4) SEQ ID NO 2的73位的赖氨酸残基。
[实施方式2] 实施方式1所述的修饰型生物素结合蛋白，其中，选自1) 4)中的氨基酸残基被取代成疏水性指数为2以下的氨基酸残基。
[实施方式3] 实施方式1所述的修饰型生物素结合蛋白，其中，1)SEQ ID N0:2的104位的精氨酸残基、和/或、2) SEQ ID NO :2的141位的赖氨酸残基被取代成酸性氨基酸残基或中性氨基酸残基。
[实施方式4] 实施方式3所述的修饰型生物素结合蛋白，其中，1)SEQ ID NO 2的104位的精氨酸残基、和/或、2) SEQ ID NO 2的141位的赖氨酸残基被取代成酸性氨基酸残基。
[实施方式5] 实施方式3或4所述的修饰型生物素结合蛋白，其中，1)SEQ ID NO :2的104位的精氨酸残基、和/或、2) SEQ ID NO 2的141位的赖氨酸残基被取代成谷氨酸残基。
[实施方式6] 实施方式1 5中任一项所述的修饰型生物素结合蛋白，其中，进一步，SEQ ID NO :2的40位的天冬氨酸残基被取代成天冬酰胺残基。
[实施方式7] 实施方式1 6中任一项所述的修饰型生物素结合蛋白，其选自下组 在SEQ ID NO 2中，104位的精氨酸残基被取代成谷氨酸残基、且141位的赖氨酸残基被取代成谷氨酸残基的修饰型生物素结合蛋白(R104E-K141E)； 在SEQ ID NO :2中，40位的天冬氨酸残基被取代成天冬酰胺残基、且104位的精氨酸残基被取代成谷氨酸残基的修饰型生物素结合蛋白(D40N-R104E)； 在SEQ ID NO :2中，40位的天冬氨酸残基被取代成天冬酰胺残基、且141位的赖氨酸残基被取代成谷氨酸残基的修饰型生物素结合蛋白(D40N-K141E)；以及 在SEQ ID NO :2中，40位的天冬氨酸残基被取代成天冬酰胺残基、104位的精氨酸残基被取代成谷氨酸残基、且141位的赖氨酸残基被取代成谷氨酸残基的修饰型生物素结合蛋白(D40N-R104E-K141E)。
[实施方式8] 实施方式1 7中任一项所述的修饰型生物素结合蛋白，其满足以下a)_l)的条件中的一个至全部 a) SEQ ID NO 2的14位的天冬酰胺残基未被修饰、或者被取代成谷氨酰胺或天冬氨酸； b) SEQ ID NO 2的18位的丝氨酸残基未被修饰、或者被取代成苏氨酸或酪氨酸； c) SEQ ID NO :2的34位的酪氨酸残基未被修饰、或者被取代成丝氨酸、苏氨酸或苯丙氨酸； d) SEQIDNO:2的36位的丝氨画？残基未被修饰、或者被取代成苏氨酸或酉各氨酸； e)SEQIDNO:2的40位的天冬氨酸残基未被修饰、或者被取代成天冬酰胺； f) SEQIDNO:2的69位的色氨画？残基未被修饰； g) SEQIDNO:2的76位的丝氨画？残基未被修饰、或者被取代成苏氨酸或酉各氨酸； h) SEQIDNO:2的78位的苏氨画？残基未被修饰、或者被取代成丝氨酸或酉各氨酸； i)SEQIDNO:2的80位的色氨画？残基未被修饰； j) SEQIDNO:2的96位的色氨画？残基未被修饰； k) SEQIDNO2的108位的色氨丨酸残基未被修饰；以及 1)SEQIDNO2的116位的天冬氨酸残基未被修饰、或者被取代成谷氨画I或天冬酰胺。
[实施方式9] 实施方式1所述的修饰型生物素结合蛋白，其包含与SEQ ID NO 2所述的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸序列。
[实施方式10] 实施方式1 9中任一项所述的修饰型生物素结合蛋白，其满足以下性质中的一个至全部 i)与由SEQ ID NO 2所述的氨基酸序列组成的蛋白质相比，具有低的等电点； ii)与由SEQ ID NO :2所述的氨基酸序列组成的蛋白质相比，显示对核酸和/或蛋白质的低的非特异性结合； iii)与由SEQ ID NO :2所述的氨基酸序列组成的蛋白质相比，显示低的纤连蛋白结合性； iv)与由SEQ ID NO :2所述的氨基酸序列组成的蛋白质相比，显示高的生物素结合性。
[实施方式11] 在包含SEQ ID NO :2所述的氨基酸序列、或在该序列中具有一个 数个氨基酸突变的氨基酸序列、或与该序列具有80%以上的同一性的氨基酸序列，且显示生物素结合活性的蛋白质中，SEQ ID NO :2的40位的天冬氨酸残基被取代成天冬酰胺残基的修饰型生物素结合蛋白ο [实施方式12] 实施方式11所述的修饰型生物素结合蛋白，其与由SEQ ID NO :2所述的氨基酸序列组成的蛋白质相比，显示高的生物素结合性。
[实施方式13] 编码实施方式1 12中任一项所述的蛋白质的核酸。
[实施方式14] 包含实施方式13所述的核酸的载体。
[实施方式I5] 固定化有实施方式1 14中任一项所述的蛋白质的载体。
以下，对用于实施本发明的优选实施方式进行说明。
tamavidin tamavidin是从作为食用菌的担子菌白黄侧耳(Pleurotus conucopiae)中发现的新的生物素结合蛋白(W002/072817)。该文献中记载 -tamavidin 1与tamavidin 2相互之间的氨基酸同源性为65. 5%，与生物素强结合； -tamavidin 2在大肠杆菌中高表达在可溶性级分中；以及 -用大肠杆菌表达tamavidin2时，经过4. 5小时的培养，每50ml培养可以获得约Img的高纯度纯化重组蛋白质。与已知的生物素结合性蛋白质抗生物素蛋白、链霉菌抗生物素蛋白相比，这是非常高的值。
本说明书中的“tamavidin 2”是指tamavidin 2 (TM2)或其变体。本发明通过对 TM2或其变体的特定氨基酸残基进行修饰，提供显示对核酸和/或蛋白质的非特异性结合比野生型TM2更低的修饰型TM2。在本说明书中，当记作“tamavidin 2”、“TM2”时，如无特别说明，是指野生型的TM2及其变体。但是，根据文意，有些情况下也作为包括本发明的修饰型TM2在内的TM2的野生型、突变型和本发明的修饰型的统称使用。此外，TM2显示生物素结合性，因而在本说明书中，有时也将TM2称作“生物素结合蛋白”。
具体地，TM2(野生型)典型地，可以是包含SEQ ID NO 2的氨基酸序列的蛋白质、 或由包含SEQ ID NO :1的碱基序列的核酸编码的蛋白质。或者，TM2可以是包含SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的蛋白质或由包含SEQ IDNO 1的碱基序列的核酸编码的蛋白质的变体，该蛋白质具有与tamavidin 2等同的生物素结合活性。TM2的变体可以是包含在SEQ ID NO: 2的氨基酸序列中包含一个或多个氨基酸的缺失、取代、插入和/或添加的氨基酸序列的蛋白质，该蛋白质具有与TM2等同的生物素结合活性。取代可以是保守取代，即将特定的氨基酸残基替换为具有相似物理化学特征的残基。保守取代的非限定性例子包括含脂肪族基团的氨基酸残基之间的取代(例如lie、Val, Leu或Ala间的相互取代)、极性残基之间的取代(例如Lys和Arg、Glu和Asp、Gln和Asn之间的相互取代)等。
氨基酸缺失、取代、插入和/或添加而成的变体可以通过对编码野生型蛋白质的DNA实施例如作为公知技术的定点诱变(例如参见Nucleic Acid Research, Vol. 10， No. 20,p. 6487-6500，1982，通过引用将其全文引入到本说明书中)而产生。在本说明书中， “一个或多个氨基酸”是指通过定点诱变方法能够缺失、取代、插入和/或添加的程度的氨基酸。此外，在本说明书中，“一个或多个氨基酸”根据情况可以指一个或数个氨基酸。
就定点诱变方法而言，例如，除希望的变异即特定的不一致之外，还可以使用与要突变的单链噬菌体DNA互补的合成寡核苷酸引物按如下方式进行。即，使用上述合成寡核苷酸作为引物合成与噬菌体互补的链，用得到的双链DNA转化宿主细胞。将转化后的细菌的培养物铺在琼脂上，由含噬菌体的单个细胞形成噬菌斑。这样，理论上有50%的新菌落含有单链形式的具有突变的噬菌体，其余的50%携带原序列。在合适的温度下，使获得的噬菌斑与通过激酶处理而标记的合成探针杂交，所述合适的温度指该温度下所述探针与和带有目的突变的DNA完全一致的噬菌斑杂交，而不与携带原有链的噬菌斑杂交。然后，收集与该探针杂交的噬菌斑，进行培养，回收DNA。
而且，在保持其活性的同时对生物活性肽的氨基酸序列施加一个或多个氨基酸的缺失、取代、插入和/或添加的方法，除了上述的定点突变外，还有用诱变物处理基因的方法，以及选择性地断开基因，然后删除、取代、插入或添加选定的核苷酸，再进行连接的方法。更优选地，本发明中的TM2是由在SEQ ID NO 2中缺失、取代或添加1 10个氨基酸的氨基酸序列组成、且具有生物素活性的蛋白质。
TM2的变体还可以是包含与SEQ ID NO 2的氨基酸序列具有至少80%以上、优选85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、或99%以上、更优选 99. 3%以上的氨基酸同一性的氨基酸序列、且具有与TM2等同的生物素结合活性的蛋白质。
两个氨基酸序列的同一性％可通过目测和数学计算来确定。或者两个蛋白质序列的同一'性百分比可以通过使用以Needleman，S. B.及Wunsch，C. D. (J. Mol. Bol. ,48 443-453,1970)的算法为基础的、可从威斯康星州大学遗传学计算机组(UWGCG)获得的GAP 计算机程序进行序列信息比较来确定。GAP程序优选的默认参数包括= (I)Henikoff, S.以 R Henikoff, J. G. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA，89 10915-10919，1992)所记载的得分 / 矩阵(7 - 7 U >夕’· 卜丨厂；/夕ζ )、blosum62 ； (2) 一个空位扣12分；(3)连续空位加扣 4分；以及(4)末端空位不扣分。
也可使用该领域技术人员使用的进行序列比较的其它程序。关于同一性百分比， 例如Altschul 等(Nucl. Acids. Res.，25，p. 3389-3402，1997)中记载的可用 BLAST 程序对序列信息进行比较和确定。该程序可于网络上在Nantional Center for Biotechnology Information(NCBI)或 DNA Data Bank of Japan(DDBJ)网站使用。在相同站点，对利用 BLAST程序进行同一性检索的各种条件(参数)进行了详细记载，可对部分设定进行适当变更，但检索通常使用默认值来进行。此外，两个氨基酸序列的同一性％也可用遗传信息处理软件GENETYX Ver. 7 (GENETYX制)等程序或FASTA算法等来确定。此时，也可用默认值进行检索。
两个核酸序列的同一性％可通过目测和数学计算来确定，此外，该比较更优选使用计算机程序对序列信息进行比较。具有代表性的优选计算机程序为遗传学计算机组 (GCG ；威斯康星州Madison)的威斯康星·软件包、10. O版“GAP”程序(Devereux等，1984， Nucl. Acids Res. ,12 :387)。使用该“GAP”程序，不仅可对两个核酸序列进行比较，还可比较两个氨基酸序列，并可对核酸序列和氨基酸序列进行比较。此处，“GAP”程序的优选默认参数包括(1)实行关于核苷酸的(包括相同物质为1，不同物质为O的值)一元(unary) 比较矩阵的GCG时，如ktiwartz和Dayhoff主编的”多肽序列及结构图谱(Atlas of Polypeptide Sequence and Structure) ” (国立生物医学研究财团，353-358 页，1979 年) 所记载的Gribskov及Burgess (Nucl. Acids Res. ,14 =6745,1986)的加权氨基酸比对矩阵； 或其它可比对的比对矩阵；(2)氨基酸的各空位罚分30，各空位中的各记号追加1罚分；此外，核苷酸序列的各空位罚分50，各空位中的各记号追加3罚分；(3)末端空位不罚分；以及(4)长空位没有最大罚分。技术人员使用的其它序列比较程序中，可使用例如美国国立医学图书馆的网站http://www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/bl2seq/bls. html 提供的版本 2. 2. 7的BLASTN程序、或UW-BLAST2. O算法。关于UW-BLAST2. O标准默认参数的设定，以下网站http://blast, wustl. edu中有记载。而且，BLAST算法使用BL0SUM62氨基酸得分矩阵，可使用的选择参数如下(A)包含具有低组成复杂性的提问序列片断(由Wootton及Federhen 的 SEG 程序(Computers and Chemistry, 1993)确定；参考 Wootton 及 Federhen， 1996“序列数据库中组成偏移区域的分析(Analysis of compositionally biased regions in sequence databases) ” Methods Enzymol.，洸6 :544-71)，或用于掩蔽短周期性内部重复形成的片段(由 Claverie 及 Mates (Computers and Chemistry, 1993)的 XNU 程序确定)的滤器，以及(B)用于报告数据库序列匹配的有统计学意义的阈值，或根据E-得分 (Karlin和Altschul，1990)统计学模型得到的单纯偶然发现匹配的期待几率；某种匹配引起的有统计学意义的差值大于E-得分阈值时，不能报告该匹配；优选的E-得分阈值的数值为0. 5，此外按照优选度增大的顺序依次为0. 25,0. 1,0. 05,0. 01,0. 001,0. 0001、le_5、 le-10、le-15、le-20、le-25、le-30、le-40、le-50、le-75、le_100。
此外，TM2的变体还可以是由包含在严格条件下与SEQ ID NO 1的碱基序列的互补链杂交的碱基序列的核酸编码的、具有与TM2等同的生物素结合活性的蛋白质。
此处，“严格条件下”是指在中度或高度的严格条件下进行杂交。具体来说，关于中度严格条件，根据例如DNA长度，掌握常规技术的该领域技术人员能够容易地确定。基本条件如 Sambrook 等，Molecular Cloning :A Laboratory Manual,第 3 版，第 6 章，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001 所示，例如包括下述条件的使用5 X SSC、0. 5 % SDS, 1. OmM EDTA (pH8. 0)的预洗涤溶液、约42°C的约50 %的甲酰胺、2 X SSC-6 X SSC优选 5-6XSSC.0. 5% SDS(或约42°C、约50%甲酰胺中的Mark’ s溶液等其它类似的杂交液) 的杂交条件，以及例如在约50°C -68°C、0. 1-6XSSC、0. 1% SDS的洗涤条件。优选的中度严格条件包括约5(rC、6XSSC、0.5% SDS的杂交条件(及洗涤条件)。关于高度严格条件，根据例如DNA长度，本领域技术人员能够容易地确定。
通常，这样的条件包括较中度严格条件更高温度和/或更低盐浓度的杂交(例如含0. 5%左右的SDS、约65°C，6XSSC 0. 2XSSC，优选6XSSC、更优选2XSSC、更优选0. 2X SSC或者0. 1 X SSC的杂交)和/或洗涤，例如可定义为上述杂交条件以及伴随大约65°C -68°C、0. 2 0. 1XSSC、0. 1% SDS的洗涤。关于杂交及洗涤的缓冲液，可以使用 SSPE (IX SSPE 为 0. 15M NaClUOmMNaH2PO4 以及 1. 25mM EDTA, ρΗ7· 4)代替 SSC (IX SSC 为 0. 15Μ NaCl以及15mM柠檬酸钠)，在杂交结束后15分钟 1小时左右进行洗涤。
此外，也可使用探针中不使用放射性物质的市售杂交试剂盒。具体可以列举出使用 ECL direct labeling & detection system(Amersham 公司制)进行的杂交等。严格杂交条件的例子为，向试剂盒的杂交缓冲液中加入5% (w/v)的封闭试剂，使NaCl达到0.5M， 在42°C进行4小时杂交，关于洗涤，在0. 4% SDS,0. 5xSSC中，55°C条件下洗涤两次，每次20 分钟，在hSSC中，室温条件下，洗涤一次5分钟。
TM2的变体的生物素结合活性可以采用任何公知方法来测定。例如，可以像Kada 等(Biochim. Biophys. Acta. ,1427 :44-48(1999))所描述的那样，采用使用了荧光生物素的方法来测定。该方法是利用以下性质的测定系统在生物素结合蛋白的生物素结合位点上结合荧光生物素时，荧光生物素的荧光强度消失。或者，可以使用基于表面等离子体共振原理的生物传感器等能够测定蛋白与生物素间的结合的传感器，来评价变体蛋白的生物素结合活性。
在本发明的修饰tamavidin中，希望不进行修饰的氨基酸残基如后述。
本发明的修饰型TM2的特征是在包含SEQ ID NO :2所述的氨基酸序列、或在该序列中具有一个 数个氨基酸突变的氨基酸序列、或与该序列具有80%以上的同一性的氨基酸序列，并显示生物素结合活性的蛋白质(野生型TM2以及突变型TM2)中，选自下组中的一个或多个残基被取代成酸性氨基酸残基或中性氨基酸残基 1) SEQ ID NO 2的104位的精氨酸残基； 2) SEQ ID NO 2的141位的赖氨酸残基； 3) SEQ ID NO 2的洸位的赖氨酸残基；以及 4) SEQ ID NO 2的73位的赖氨酸残基。
野生型TM2的等电点(pi)，由其一级结构计算得到的值是约7. 4，实测值为 8. 2-8. 6左右，是中性 弱碱性的蛋白质。TM2的非特异性结合程度远比抗生物素蛋白少， 与作为中性蛋白质的链霉菌抗生物素蛋白基本上等同。
本发明人等对进一步减少TM2的非特异性结合进行了研究。即，本发明人认为，即使是TM2这样的中性 弱碱性蛋白质，通过降低pl，也可能进一步降低非特异性结合，从而将TM2所具有的碱性氨基酸残基修饰成酸性氨基酸或中性氨基酸，并进行了实验。
这里，对于链霉菌抗生物素蛋白或抗生物素蛋白而言，已知有些情况下一个或数个氨基酸的取代会导致其对生物素的结合亲和力降低，因此，在实验中，不仅是降低等电点，还对如何不损害作为TM2的优良特征的高生物素结合能力进行了如后述的研究，来进行氨基酸残基的修饰。
深入研究的结果，本发明人等发现满足这样的条件的本发明的低Pl修饰型TM2 是包含选自下组中的一个或多个残基的突变的修饰TM2蛋白质，从而想到了本发明 DSEQ ID NO 2 的 104 位的精氨酸残基(R104)； 2) SEQ ID NO 2 的 141 位的赖氨酸残基(K141)； 3) SEQ ID NO 2的沈位的赖氨酸残基(以6)；以及 4) SEQ ID NO 2 的 73 位的赖氨酸残基(K73)。
突变后的氨基酸是酸性氨基酸残基(天冬氨酸、谷氨酸)或中性氨基酸残基(天冬酰胺、丝氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、甘氨酸、酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、 苯丙氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)。
此外，非极性的氨基酸存在具有基于疏水性相互作用的非特异性结合的可能性，因而优选疏水性指数为2以下的酸性氨基酸残基或中性氨基酸残基。疏水性指数 (hydropathy inde 是指例如Kyte and Doolittle，J. Mol. Biol.，157，105-132 (1982)中记载的将各氨基酸残基的疏水性程度数值化而得到的指数，其是本领域技术人员公知的。“疏水性指数为2以下的酸性氨基酸残基或中性氨基酸残基”是作为酸性氨基酸残基的天冬氨酸和谷氨酸，以及作为中性氨基酸残基的天冬酰胺、丝氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、甘氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸和丙氨酸。
更优选，1)SEQ ID NO :2的104位的精氨酸残基、和/或、2) SEQ ID NO :2的141位的赖氨酸残基被取代成酸性氨基酸残基或中性氨基酸残基。更优选，1)SEQ ID NO :2的104 位的精氨酸残基、和/或、2)SEQ ID NO :2的141位的赖氨酸残基被取代成酸性氨基酸残基。
K26的位置上更优选A (丙氨酸)、K73的位置上更优选Q (谷氨酰胺)、R104的位置上更优选E (谷氨酸)或D (天冬氨酸)、K141的位置上更优选E (谷氨酸)或D (天冬氨酸)；而R104的位置上更优选E，K141的位置上更优选E。
本发明的低pi型修饰TM2与野生型TM2相比，显示显著低的等电点。具体地，可以明确在实施例1的1-8)中导入了突变的修饰型TM2的等电点，均较野生型的TM2降低了 1以上。
由此性质，与野生型或突变型TM2蛋白质相比，本发明的修饰型TM2蛋白质显示对核酸和/或蛋白质的低的非特异性结合。具体地，在实施例1的1-11)中显示了针对DNA 的非特异性结合降低。而且，实施例1的1-9)中显示血清蛋白质的非特异吸附性降低。在 K26、K73、K141的位置上发生突变，均减少至野生型ΤΜ2的6成左右；而R104-K141 (R104和 Κ141这两个位置发生突变)甚至减少至ΤΜ2的2成多。与此相对，对于抗生物素蛋白的碱性氨基酸变体，虽然有报告称对DNA或细胞的非特异性结合降低(Marttila等，Q000)FEBS， 467，p. 31-36)，但对血清蛋白质的非特异性结合的这样的大幅降低还未见报告。
此外，对于本发明的低pi型修饰TM2，考察了与纤连蛋白之间的结合性，发现其大幅降低。纤连蛋白是存在于细胞外基质中的细胞粘附分子，特别是在对血浆、血清中的蛋白质进行检测时，其会成为噪声的原因之一。因此，希望与纤连蛋白之间的结合少。如实施例 1的1-10)所示，与TM2相比，任何一种变体的纤连蛋白结合量均减少。特别是，就K141、 R104-K141而言，结合量显著减少至野生型TM2结合量的1成 2成。而，pi值与纤连蛋白结合能力之间的关系是此前未知的，实际上未发现Pl值与纤连蛋白减少程度明确相关。考虑到这一点，K141、R104-K141的变体的纤连蛋白结合量的减少非常之大，达到了意料不到的显著。
纤连蛋白结合减少的本发明的优选修饰TM2的一例是，将TM2氨基酸序列的141 位的赖氨酸残基修饰成酸性氨基酸或中性氨基酸而得到的修饰TM2。更优选修饰成疏水性指数为2以下的酸性氨基酸或中性氨基酸而得到的修饰TM2。更优选E (谷氨酸)或D (天冬氨酸)，其中最优选E。
或者，纤连蛋白结合减少的其它修饰TM2是，将R104和K141这两个氨基酸残基同时修饰成酸性氨基酸或中性氨基酸而得到的修饰TM2。更优选修饰成疏水性指数为2以下的酸性氨基酸或中性氨基酸而得到的修饰TM2，更优选E (谷氨酸)或D (天冬氨酸)，其中最优选E。
生物素结合能力提高的修饰tamavidin TM2与生物素之间的结合速度常数(ka)是9. 19X IO5(MH，解离速度常数(kd) 是6. 83X10—6(s—1)，解离常数(KD)是7.43X10_12(M)，TM2非常强烈地结合生物素。针对作为其它生物素结合性蛋白质的链霉菌抗生物素蛋白进行了同样的测定，结果ka是 2. 28 X IO6 (MY1)，kd 是 2. 52 X IO"6 (s"1)，KD 是 1. 11 X 1(T12 (M)。即，与链霉菌抗生物素蛋白相比，ΤΜ2与生物素之间的结合力处于同一数量级，但稍弱(W02008/081938A1)。在希望生物素结合蛋白与生物素更快结合或更多结合的情况下，需要具有更高的生物素结合能力。
发明人等对ΤΜ2的氨基酸残基进行修饰，成功制作了针对原本就具有高生物素结合能力的野生型ΤΜ2进一步提高了生物素结合能力的高亲和性型修饰ΤΜ2。本发明的高亲和性型ΤΜ2是在ΤΜ2的SEQ ID NO 2的氨基酸序列中、至少40位的天冬氨酸残基(D40)发生突变而得到的。突变后的氨基酸优选为N (天冬酰胺)。
D40的修饰可以与前述的用于降低非特异性结合的R104、K141、D6和/或K73的修饰组合进行(实施方式6)，或者也可以单独进行(实施方式11)。如实施例2和3所示， 与野生型TM2相比，D40经修饰的修饰TM2显示显著地高的生物素结合能力。
非特异t牛结合降低,、H.牛物素结合能力提高的修饰tamavidin 制作将上述的“非特异性结合降低的修饰tamavidin”和“生物素结合能力提高的修饰tamavidin”中的氨基酸突变组合而成的修饰tamavidin时，得到了非特异性结合降低、生物素结合能力提高的修饰tamavidin。这样的修饰tamavidin是包含TM2氨基酸序列的K26、K73、R104、K141中的至少一个氨基酸残基的突变、且D40的氨基酸残基突变成N而得到的修饰TM2蛋白质(实施方式6)。
K26、K73、R104、K141突变后的氨基酸是酸性氨基酸或中性氨基酸，优选疏水性指数(hydropathy index =Kyte and Doolittle，J. Mol. Biol.，157，105-132 (1982))为 2 以下的酸性氨基酸或中性氨基酸。以6的位置上更优选A(丙氨酸)、K73的位置上更优选Q (谷氨酰胺)、R104的位置上更优选E (谷氨酸)或D (天冬氨酸)、Κ141的位置上更优选E (谷氨酸)或D (天冬氨酸)；而R104的位置上更优选Ε，Κ141的位置上更优选Ε。
对于同时进行了 R104与D40的修饰而得到的修饰tamavidin，可见亲和性提高和蛋白质非特异性结合的降低(实施例3的3-7)和3-9))。
此外，对于同时修饰了 R104、K141、D40而得到的修饰tamavidin，观察到了等电点的降低、亲和性提高、蛋白质非特异性结合的降低、纤连蛋白结合性的降低以及核酸非特异性结合的降低(实施例3的3-6)、3-7)、3-9)、3-10)和3_11)。而且，令人惊讶的是，蛋白质结构的热稳定性大幅提高(实施例3的3-8))。
因此，优选同时对D40和R104氨基酸残基进行修饰，更优选同时对D40、R104和 K141进行修饰。
如以上，优选本发明的修饰型TM2可以选自下组，但不限于此 在SEQ ID NO :2中，40位的天冬氨酸残基被取代成天冬酰胺残基、且104位的精氨酸残基被取代成谷氨酸残基的修饰型生物素结合蛋白(D40N-R104E)； 在SEQ ID NO :2中，40位的天冬氨酸残基被取代成天冬酰胺残基、且141位的赖氨酸残基被取代成谷氨酸残基的修饰型生物素结合蛋白(D40N-K141E)；以及 在SEQ ID NO :2中，40位的天冬氨酸残基被取代成天冬酰胺残基、104位的精氨酸残基被取代成谷氨酸残基、且141位的赖氨酸残基被取代成谷氨酸残基的修饰型生物素结合蛋白(D40N-R104E-K141E)。
本发明的修饰TM2蛋白质的优选实施方式具有例如SEQ ID NO :8、10、16、20、22、 24以及25中的任何一个氨基酸序列。
更优选D40N-R104E、D40N-K141E 或 D40N-R104E-K141E，最优选 D40N-R104E-K141E。
本申请发明的修饰型TM2蛋白质优选满足以下性质中的一个直至全部 i)与由SEQ ID NO 2所述的氨基酸序列组成的蛋白质相比，具有低的等电点； ii)与由SEQ ID NO :2所述的氨基酸序列组成的蛋白质相比，显示对核酸和/或蛋白质的低的非特异性结合； iii)与由SEQ ID NO :2所述的氨基酸序列组成的蛋白质相比，显示低的纤连蛋白结合性； iv)与由SEQ ID NO :2所述的氨基酸序列组成的蛋白质相比，显示高的生物素结合性。
关于i)，野生型TM2的等电点是约8. 5-8. 8。本发明的修饰TM2的等电点优选是 8.0以下，更优选是7. 7以下。
关于iii)，设野生型TM2对纤连蛋白的结合性为1. 3 1. 4的情况下，本发明的修饰TM2的纤连蛋白结合性优选是1. 0以下、更优选0. 7以下、0. 25以下、0. 15以下。
胃軸絲日月_誠2 Φ絲某_某 关于本发明的修饰TM2中的氨基酸残基的修饰，需要不影响生物素结合能力。另一方面，作为生物素结合蛋白之一的链霉菌抗生物素蛋白的生物素口袋(pocket)已经阐明。该链霉菌抗生物素蛋白与TM2之间的氨基酸序列同源性仅为50%左右，但发明人等为了获得关于TM2的生物素口袋的认识，将TM2与链霉菌抗生物素蛋白的氨基酸序列进行了并列比较。于是发现形成链霉菌抗生物素蛋白的生物素口袋的氨基酸中的、与生物素直接相互作用的残基 N23、S27、Y43、S45、N49、W79、S88、T90、W92、W108、W120、D128 (Weber 等，(1989) Science 243 :85-88, Livnah 等，(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 90 5076-5080)，在 ΤΜ2 中分别相当于 Ν14、S18、Υ34、S36、D40、W69、S76、Τ78、W80、W96、W108、 D116，是非常保守的。
唯一的例外是，链霉菌抗生物素蛋白的49位的Ν(天冬酰胺)在ΤΜ2中是40位的D (天冬氨酸)，正如所述，将其修饰成与链霉菌抗生物素蛋白相同的天冬酰胺而得到的 D40N ΤΜ2的生物素结合能力提高。由这些结果可以认为，ΤΜ2与链霉菌抗生物素蛋白的生物素结合口袋具有非常相似的结构，这些氨基酸残基在很大程度上参与了生物素结合。
特别是，4个色氨酸残基(W69、W80、W96、W108)被认为对生物素口袋的结构起着重要的作用，因而希望不进行修饰。另一方面，被认为参与与生物素的结合的其它氨基酸，即被认为在TM2中与生物素直接相互作用的氨基酸残基(N14、S18、Y34、S36、S76、T78、D116)， 也希望不进行修饰。或者，在对这些氨基酸进行修饰时，希望修饰成性质或者结构类似的氨基酸，以能够维持与生物素的结合。例如，对于天冬酰胺(N14)，希望修饰成谷氨酰胺⑴)、 天冬氨酸(D)，优选天冬氨酸；对于天冬氨酸(D40)，希望修饰成天冬酰胺(N)；对于丝氨酸 (S18、S36、S76)，希望修饰成苏氨酸(T)或者酪氨酸(Y)，优选苏氨酸；对于酪氨酸(Y34)， 希望修饰成丝氨酸(S)、苏氨酸(T)或者苯丙氨酸(F)，优选苯丙氨酸；对于苏氨酸(T78)， 希望修饰成丝氨酸( 、酪氨酸(Y)，优选丝氨酸；对于天冬氨酸(Dl 16)，希望修饰成谷氨酸 (E)、天冬酰胺(N)，优选天冬酰胺。
氨基酸的修饰方法 用于对TM2的氨基酸进行修饰来获得本发明的修饰TM2的方法，可以采用公知的对氨基酸序列实施突变的方法，对其没有特殊限制。优选对编码TM2的核酸的碱基序列实施修饰，来进行修饰。
例如，为了对氨基酸序列的特定位置的氨基酸进行修饰，可以列举出例如利用PCR 的方法(Higuchi等(1988)，Ho等(1989))。即，通过利用包含目标突变的错配密码子的引物进行PCR，制作编码目的变体的DNA并使之表达，能够得到目的变体。
另外，氨基酸缺失、取代、插入和/或添加而成的变体可以通过对编码野生型蛋白质的DNA实施例如作为公知技术的定点诱变(例如参见Nucleic Acid Research，Vol. 10，No. 20，p. 6487-6500，1982，通过引用将其全文引入到本说明书中)而产生。就定点诱变方法而言，例如，除希望的变异即特定的不一致之外，还可以使用与要突变的单链噬菌体DNA 互补的合成寡核苷酸引物按如下方式进行。即，使用上述合成寡核苷酸作为引物合成与噬菌体互补的链，用得到的双链DNA转化宿主细胞。将转化后的细菌的培养物铺在琼脂上，由含噬菌体的单个细胞形成噬菌斑。这样，理论上有50%的新菌落含有单链形式的具有突变的噬菌体，其余的50%携带原序列。在下述温度下，使获得的噬菌斑与通过激酶处理而标记的合成探针杂交，所述温度下所述探针与和带有目的突变的DNA完全一致的噬菌斑杂交， 而不与携带原有链的噬菌斑杂交。然后，收集与该探针杂交的噬菌斑，进行培养，回收DNA。
编码修饰tamavidin 2 (TM2)蛋白质的核酸 本发明提供编码本发明的修饰型TM2的核酸。这样的核酸的碱基序列是将TM2的碱基序列(SEQ ID NO :1)修饰成编码修饰型TM2蛋白质的修饰氨基酸的碱基序列而得到的。被修饰的碱基序列只要是编码修饰后氨基酸的碱基序列即可，对其没有限制。例如包括为了对由SEQ ID NO 1的碱基序列组成的核酸，或与其互补链在严格条件下杂交、且编码具有生物素结合活性的蛋白质的核酸(以下称作“TM2基因”)实施本发明的修饰，而对碱基序列进行修饰而得到的。
本发明的核酸优选编码SEQ ID NO :8、10、16、20、22、24以及25中的任何一个氨基酸序列。更优选编码氨基酸序列22或M。本发明的核酸优选由SEQ ID NO :7、9、15、19、21 以及23的核酸序列组成。更优选由SEQID NO 21或23的核酸序列组成。
包含发明的核酸的载体 此外，本发明提供包含编码修饰TM2蛋白质的核酸的载体。优选用于表达修饰TM2 蛋白质的表达载体。
编码本发明的修饰TM2蛋白质的核酸如上述“编码修饰tamavidin蛋白质的核酸” 中所述，没有特殊限制。
而且，编码修饰TM2蛋白质的核酸的一端或两端可以具有限制酶识别位点或 aatBl、aatB2、aatB3等Gateway系统(Invitrogen公司)中使用的序列等，此外修饰TM2 蛋白质编码核酸的上游可以配置在希望的宿主中发挥功能的启动子，或者其下游可以配置终止子。
而且，对于限制酶识别位点的种类没有特殊限制，但优选在表达载体中其是唯一的识别位点。对识别位点的数量没有特殊限制，可以是1个或2个以上，优选10个以下。
而且，限制酶位点、aatB序列与修饰TM2核酸的碱基序列之间可以配置编码1个氨基酸以上、优选5个氨基酸以上、更优选10个氨基酸以上、更优选25个氨基酸以上且50 个氨基酸以下的接头氨基酸序列(对其没有特殊限制，可以是富含甘氨酸、丝氨酸的序列等本领域技术人员通常使用的序列)的核酸序列，此外，并非特殊限制，还可以配置例如编码诸如肠激酶、i^Ctori(a等蛋白酶的识别位点的序列。
此外，在将例如scFv、Fab等抗体基因插入该表达载体的情况下，在细胞质内部这样的还原条件不适合融合蛋白质的表达时，在启动子与由用于插入编码修饰tamavidin的核酸序列构成的单元之间，可以包含编码诸如信号肽、分泌信号等前导肽的核酸序列。
本发明的载体优选是表达载体。表达载体除了具有这样的表达单元之外，还可以具有用于能够在希望的宿主中进行复制的单元例如具有复制起点，或者还可以具有用于选择希望的宿主细胞的药物抗性标记基因。对于宿主没有特殊限制，优选是大肠杆菌。此外， 该表达载体中还可以组合入例如大肠杆菌中的乳糖阻遏物系统这样的合适的表达调控系统。
固定化有修饰tamavidin的载体 本发明提供固定化有本发明的修饰TM2蛋白质的载体。
构成的载体的材料可以使用公知材料。包括例如纤维素、特氟隆、硝酸纤维素、琼脂糖、葡聚糖、壳聚糖、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚酯、聚碳酸酯、聚酰胺、聚丙烯、尼龙、聚偏二氟乙烯、胶乳、二氧化硅、玻璃、玻璃纤维、金、钼、银、铜、铁、不锈钢、铁氧体、硅晶片、聚乙烯、聚乙烯亚胺、聚乳酸、树脂、多糖类、蛋白质(白蛋白等)、碳或它们的组合，但不限于此。 此外，优选具有一定强度、组成稳定、且非特异性结合少的载体。
固体载体的形状包括但不限于珠子、磁珠、薄膜、微细管、滤膜、平板、微量板、碳纳米管、传感器芯片等。正如本技术领域公知的那样，薄膜或平板等平坦的固体载体上可以设置凹坑、沟槽、滤膜底部等。
在本发明的一类实施方式中，珠子可以具有约25nm 约Imm范围的球体直径。在优选的实施方式中，珠子具有约50nm 约IOym范围的直径。磁珠的尺寸可以根据特定的用途来进行选择。数种细菌孢子具有约1 μ m数量级的尺寸，因此用于捕捉这些孢子的优选珠子具有大于Iym的直径。
对于蛋白质针对载体的结合没有特殊限制，可以使用使蛋白质结合于载体的公知方法。具体的结合方法，本领域技术人员可以根据载体的种类等适宜选择。
发明的效果 根据本发明，能够提供在保持tamavidin的生物素结合能力高的特性的同时，性能提升的修饰型生物素结合蛋白，所述性能提升是指非特异性结合性降低和/或进一步的生物素结合提高。通过利用这些修饰tamavidin，能够在利用了抗生物素蛋白-生物素结合的用于测定检测对象的检测方法例如免疫测定、核酸杂交测定中，谋求降低背景、提高灵敏度、保持恶劣环境(高温、变性剂、酶存在下等)中的生物素结合性。


图1显示了本发明的低pi型修饰TM2蛋白质对于血清蛋白质固定化磁珠的非特异性结合性。**Ρ < 0. 01对TM2 图2显示了本发明的低pi型修饰TM2蛋白质对于纤连蛋白的非特异性结合性。*p < 0. 01 对 TM2 图3显示了本发明的低pi型修饰TM2蛋白质对DNA的非特异性结合性。
图4中考察了血清蛋白质针对固定化有本发明的低非特异性结合-高亲和性型 TM2蛋白质的磁珠的非特异吸附性。*p < 0. 1对TM2 图5显示了本发明的低非特异性结合-高亲和性型TM2蛋白质对纤连蛋白的非特异性结合性。*p < 0. 01对TM2 图6显示了本发明的低非特异性结合-高亲和性型TM2蛋白质对DNA的非特异性结合性。图6的上、中、下分别显示了野生型TM2、TI\CR104EK141E、TM2D40NR104EK141E的结^ ο实施例 以下，通过实施例对本发明进行具体说明，但这些并不是对本发明的技术范围的限定。本领域技术人员可以基于本说明书的记载容易地对本发明加以修饰、变更，这些也包含在本发明的技术范围内。
实施例1低Dl型TM2的构津与分析 1-1)低Dl型TM2的构津 以降低TM2的等电点为目的，将TM2中的碱性氨基酸残基取代成中性氨基酸或酸性氨基酸，构建了以下的7个修饰体。
(1)将沈位的赖氨酸取代成丙氨酸的TM2 (以下称作“ΤΜ^^6Α”，碱基序列SEQ ID NO :3，氨基酸序列 SEQ ID NO 4)； (2)将73位的赖氨酸取代成谷氨酰胺的ΤΜ2(以下称作“TMI73Q”，碱基序列为 SEQ ID NO :5，氨基酸序列为 SEQ ID NO 6)； (3)将104位的精氨酸取代成谷氨酸的ΤΜ2(以下称作“TM2R104E”，碱基序列为 SEQ ID NO :7，氨基酸序列为 SEQ ID NO 8)； (4) 141位的赖氨酸突变成谷氨酸的ΤΜ2(以下称作“ΤΜΙ141Ε”，碱基序列为SEQ ID NO :9，氨基酸序列为 SEQ ID NO 10)； (5)具有33位的赖氨酸一苏氨酸的取代和37位的赖氨酸一丙氨酸的取代的 ΤΜ2(以下称作“ΤΜ2Κ33ΤΚ37Α”，碱基序列为SEQ ID NO 11，氨基酸序列为SEQ ID NO 12)； (6)具有33位的赖氨酸一苏氨酸的取代、37位的赖氨酸一丙氨酸的取代以及104 位的精氨酸一谷氨酸的取代的ΤΜ2(以下称作“TMI33TK37AR104E”，碱基序列为SEQ ID NO 13，氨基酸序列为SEQ IDNO 14)；以及 (7)具有104位的精氨酸一谷氨酸的取代和141位的赖氨酸一谷氨酸的取代的 ΤΜ2(以下称作“TI\CR104EK141E”，碱基序列为SEQ ID NO :15，氨基酸序列为SEQ ID NO: 16)。
(8)将19位的赖氨酸取代成苏氨酸的TM2 (以下称作“TMI19T”，碱基序列为SEQ ID NO: 17，氨基酸序列为 SEQ ID NO 18)； R104E的Ε、K33TK37A的T和A是通过TM2与链霉菌抗生物素蛋白的氨基酸序列比较，参考链霉菌抗生物素蛋白序列上的该部分的氨基酸确定的。此外，K141E的E是参考 tamavidin 1序列上的该部分的氨基酸确定的。
首先，为了构建低pi型TM2，设计了用于导入各突变的引物。设计了由TM2基因的 5’部分及在其上游编码Pci I限制酶切割位点(ACATGT)的序列构成的引物Tm2NtermPCi、 以及由TM2基因的3’部分及在其下游编码BamH I限制酶切割位点(GGATCC)的序列构成的引物Tm2CtermBam。针对各变体的包含错配密码子的一系列有义引物和反义引物分别如下(SEQ IDNO 26-37)。
表1低pi型TM2构建用引物 [表1]
权利要求
1.一种修饰型生物素结合蛋白，其是在包含SEQ ID NO :2所述的氨基酸序列、或在该序列中具有一个 数个氨基酸突变的氨基酸序列、或与该序列具有80%以上的同一性的氨基酸序列且显示生物素结合活性的蛋白质中，选自下组中的一个或多个残基被取代成酸性氨基酸残基或中性氨基酸残基而成的1)SEQID NO 2的104位的精氨酸残基；2)SEQ ID NO 2的141位的赖氨酸残基；3)SEQ ID NO 2的沈位的赖氨酸残基；以及4)SEQ ID NO 2的73位的赖氨酸残基。
2.根据权利要求1所述的修饰型生物素结合蛋白，其中，选自1) 4)中的氨基酸残基被取代成疏水性指数为2以下的氨基酸残基。
3.根据权利要求1所述的修饰型生物素结合蛋白，其中，1)SEQID NO :2的104位的精氨酸残基，和/或^SEQ ID NO :2的141位的赖氨酸残基被取代成酸性氨基酸残基或中性氨基酸残基。
4.根据权利要求3所述的修饰型生物素结合蛋白，其中，1)SEQID NO :2的104位的精氨酸残基，和/或^SEQ ID NO 2的141位的赖氨酸残基被取代成酸性氨基酸残基。
5.根据权利要求3或4所述的修饰型生物素结合蛋白，其中，1)SEQIDNO :2的104位的精氨酸残基、和/或^SEQ ID NO 2的141位的赖氨酸残基被取代成谷氨酸残基。
6.根据权利要求1 5中任一项所述的修饰型生物素结合蛋白，其中，进一步SEQID NO :2的40位的天冬氨酸残基被取代成天冬酰胺残基。
7.根据权利要求1 6中任一项所述的修饰型生物素结合蛋白，其选自下组在SEQ ID NO 2中104位的精氨酸残基被取代成谷氨酸残基、且141位的赖氨酸残基被取代成谷氨酸残基的修饰型生物素结合蛋白(R104E-K141E)；在SEQ ID NO :2中40位的天冬氨酸残基被取代成天冬酰胺残基、且104位的精氨酸残基被取代成谷氨酸残基的修饰型生物素结合蛋白(D40N-R104E)；在SEQ ID NO :2中40位的天冬氨酸残基被取代成天冬酰胺残基、且141位的赖氨酸残基被取代成谷氨酸残基的修饰型生物素结合蛋白(D40N-K141E)；以及在SEQ ID NO :2中，40位的天冬氨酸残基被取代成天冬酰胺残基、104位的精氨酸残基被取代成谷氨酸残基、且141位的赖氨酸残基被取代成谷氨酸残基的修饰型生物素结合蛋白(D40N-R104E-K141E)。
8.根据权利要求1 7中任一项所述的修饰型生物素结合蛋白，其满足以下a)-l)中的一个至全部条件a)SEQ ID NO :2的14位的天冬酰胺残基未被修饰、或者被取代成谷氨酰胺或天冬氨酸；b)SEQID NO 2的18位的丝氨酸残基未被修饰、或者被取代成苏氨酸或酪氨酸；c)SEQ ID NO :2的34位的酪氨酸残基未被修饰、或者被取代成丝氨酸、苏氨酸或苯丙氨酸；d)SEQID NO 2的36位的丝氨酸残基未被修饰、或者被取代成苏氨酸或酪氨酸；e)SEQID NO 2的40位的天冬氨酸残基未被修饰、或者被取代成天冬酰胺；f)SEQ ID NO 2的69位的色氨酸残基未被修饰；g)SEQID NO 2的76位的丝氨酸残基未被修饰、或者被取代成苏氨酸或酪氨酸；h)SEQID NO 2的78位的苏氨酸残基未被修饰、或者被取代成丝氨酸或酪氨酸；i)SEQID NO 2的80位的色氨酸残基未被修饰； j) SEQ ID NO 2的96位的色氨酸残基未被修饰；k) SEQ ID NO 2的108位的色氨酸残基未被修饰；以及DSEQ ID NO :2的116位的天冬氨酸残基未被修饰、或者被取代成谷氨酸或天冬酰胺。
9.根据权利要求1所述的修饰型生物素结合蛋白，其包含与SEQIDNO :2所述的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸序列。
10.根据权利要求1 9中任一项所述的修饰型生物素结合蛋白，其满足以下的一个至全部性质i)与由SEQID NO :2所述的氨基酸序列组成的蛋白质相比，具有更低的等电点；ii)与由SEQID NO :2所述的氨基酸序列组成的蛋白质相比，显示对核酸和/或蛋白质的更低的非特异性结合；iii)与由SEQID NO :2所述的氨基酸序列组成的蛋白质相比，显示更低的纤连蛋白结合性；iv)与由SEQID NO :2所述的氨基酸序列组成的蛋白质相比，显示更高的生物素结合性。
11.在包含SEQID NO :2所述的氨基酸序列、或在该序列中具有一个 数个氨基酸突变的氨基酸序列、或与该序列具有80%以上的同一性的氨基酸序列，且显示生物素结合活性的蛋白质中，SEQ ID NO :2的40位的天冬氨酸残基被取代成天冬酰胺残基的修饰型生物素结合蛋白ο
12.根据权利要求11所述的修饰型生物素结合蛋白，该修饰型生物素结合蛋白与由 SEQ ID NO :2所述的氨基酸序列组成的蛋白质相比，显示更高的生物素结合性。
13.编码权利要求1 12中任一项所述的蛋白质的核酸。
14.包含权利要求13所述的核酸的载体。
15.固定化有权利要求1 14中任一项所述的蛋白质的载体。
全文摘要
本发明涉及修饰型生物素结合蛋白。本发明的修饰型生物素结合蛋白是在包含SEQ ID NO2所述的氨基酸序列、或在该序列中具有一个～数个氨基酸突变的氨基酸序列、或与该序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列且显示生物素结合活性的蛋白质中，选自下组中的一个或多个残基被取代成酸性氨基酸残基或中性氨基酸残基而成的1)SEQ ID NO2的104位的精氨酸残基；2)SEQ ID NO2的141位的赖氨酸残基；3)SEQ ID NO2的26位的赖氨酸残基；以及4)SEQ ID NO2的73位的赖氨酸残基。
文档编号C07K14/375GK102186976SQ200980140630
公开日2011年9月14日 申请日期2009年8月13日 优先权日2008年8月13日
发明者高仓由光, 市川雅子 申请人:日本烟草产业株式会社