一种与武夷菌素生物合成相关的蛋白及其编码基因与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种与武夷菌素生物合成相关的蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的蛋白质，是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与武夷菌素生物合成相关的由序列1衍生的蛋白质。实验证明，本发明所提供的WysR蛋白及其编码基因对于培育武夷菌素产量提高的菌株新品种具有重要的理论和实际意义。本发明在生物农药领域具有广阔的应用前景。
【专利说明】一种与武夷菌素生物合成相关的蛋白及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及一种与武夷菌素生物合成相关的蛋白及其编码基因与应用。
【背景技术】
[0002]生物农药是农作物病虫害绿色防控和农产品安全的主要技术支撑。其中，抗生素类杀菌剂是生物农药产业化发展最快的产品之一，具有高效、易分解、与环境相溶性好等优点，被认为是减少或代替化学农药的主要技术，也是植物病虫害生物防治研究的热点。
[0003]武夷菌素是由不吸水链霉菌武夷变种(Streptomyces ahygroscopicus var.miyiensis)产生的一种高效广谱低毒新型农用抗生素，是由中国农业科学院植物保护研究所研制一种具有自主知识产权的生物农药，具有高效、广谱、低毒的特点，在生态农业和绿色食品生产中得到了广泛的应用。2000年荣获得国家五部委颁发的“国家重点新产品”认证。自2001年以来,连续多年被列入蔬菜病虫害安全防治技术规范(国家标准),指定用于防治茄果类、瓜类、绿叶类蔬菜白粉病、灰霉病、叶霉病等多种病害。2010年武夷菌素产品获得国家有机产品认证(C0FCC-R-0903-0070)。目前，武夷菌素已经成为我国无公害蔬菜和有机蔬菜生产中防治真菌病害的高效生物农药。
[0004]武夷菌素的生产是利用培养不吸水链霉菌武夷变种，通过生物深层发酵产生的微生物的次生代谢产物。工厂化发酵生产过程中所使用产生菌产素能力的高低以及培养基配方的优劣是决定抗生素生产成本、 防效的关键因素。因此，通过遗传育种技术选育高产生产菌株、优化发酵培养基的营养成分以及营养成分的配比，对于降低武夷菌素的生产成本、能耗，提高防治农作物病害的效果，加快我国自主研发的农用抗生素产业化发展具有重要意义。
[0005]传统的农用抗生素菌株改良主要是通过自然选育及诱变育种来实现，由于突变的随机性及突变的累积使得在获得高产的同时，菌株在生活能力和产孢量等方面会明显减弱，使得传统育种受到了极大的限制。近年来，随着分子生物学的不断进步，可利用基因工程育种方法进行定向育种，在一定范围内克服了传统育种技术的随机性和盲目性，为创制高产、稳定的新菌株提供了有利的保障。将抗生素合成基因用于菌种的改良，成为重要的育种手段。
[0006]研究武夷菌素的合成基因，对于基因工程育种提供了重要的理论基础，对于提高我国农用抗生素新菌株的开发与创制水平，提高具有自主知识产权的新微生物农药产业化程度具有重要的作用。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种与武夷菌素生物合成相关的蛋白及其编码基因与应用。
[0008]本发明所提供的蛋白，名称为WysR,来源于不吸水链霉菌武夷变种(Streptomycesahygroscopicus var.wuyiensis) CK-15，具体可为如下(a)或(b):[0009](a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0010](b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与武夷菌素生物合成相关的由序列I衍生的蛋白质。
[0011]上述(b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变。
[0012]其中，序列表中序列I由193个氨基酸残基组成。
[0013]编码所述WysR蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。
[0014]所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA ;所述核酸分子也可以是 RNA，如 mRNA、hnRNA 或 tRNA 等。
[0015]在本发明的一个实施例中，所述核酸分子是编码所述WysR蛋白的基因(命名为wysR基因)；所述wysR基因具体可为如下I)至4)中任一所述的DNA分子:
[0016]1)编码序列为序列表中序列2所示的DNA分子；
[0017]2)序列表中序列7所示的DNA分子；
[0018]3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA分子杂交且编码所述WysR蛋白的DNA分子;
[0019]4)与I)或2)或3)限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码所述WysR蛋白的DNA分子。
[0020]上述严格条件可为用6XSSC，0.5%SDS的溶液，在65°C下杂交，然后用2XSSC，0.1%SDS 和 I X SSC, 0.1%SDS 各洗膜一次。
[0021]其中，序列2由582个核苷酸组成，整个序列2即为编码序列，编码序列表中序列I所示的WysR蛋白。序列7由632个核苷酸组成，其中第50-632位为序列2。
[0022]含有所述核酸分子的重组载体、表达盒或重组菌也属于本发明的保护范围。
[0023]所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。
[0024]在本发明的实施例中，所述重组表达载体中启动所述wysR基因转录的启动子具体为Psfi4启动子。
[0025]更为具体的，所述重组表达载体为在pSETC载体的多克隆位点(如BamH I和SpeI)之间插入所述wysR基因后得到的重组质粒(命名为psf-wysR)。
[0026]所述表达盒由能够启动所述wysR基因表达的启动子,所述wysR基因，以及转录终止序列组成。
[0027]在本发明的一个实施例中，所述重组菌具体为携带有所述wysR基因的重组链霉菌；所述链霉菌具体为不吸水链霉菌武夷变种(Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis) CK-15。
[0028]所述WysR蛋白，或所述核酸分子，或所述重组表达载体、表达盒或重组菌在如下al) _a3)任一中的应用也属于本发明的保护范围:
[0029]al)调控菌株中武夷菌素产量；
[0030]a2)选育武夷菌素产量提高的菌株；
[0031]a3)制备用于抑制武夷菌素敏感菌株的产品。
[0032]在本发明的一个实施例中，所述调控菌株中武夷菌素产量具体为提高菌株中武夷菌素产量。
[0033]所述选育武夷菌素产量提高的菌株的方法，具体为选育所述WysR蛋白表达量提高的菌株。
[0034]本发明的另一个目的是提供一种获得转基因菌株的方法。
[0035]本发明所提供的获得转基因菌株的方法，具体可包括如下bl)和b2)的步骤:
[0036]bl)将编码所述WysR蛋白的基因导入目的菌株中，得到转基因菌株；
[0037]b2)从步骤bl)所得的转基因菌株中得到与所述目的菌株相比，具有如下性状中至少一种的转基因菌株:武夷菌素产量提高、对武夷菌素敏感菌株的抑制作用增强。
[0038]所述WysR蛋白在所述转基因菌株中的表达量高于所述目的菌株；编码所述WysR蛋白的基因(即wysR基因)是所述基因是如下I)至4)中任一所述的DNA分子:
[0039]I)编码序列为序列表中序列2所示的DNA分子；
[0040]2)序列表中序列7所示的DNA分子；
[0041]3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA分子杂交且编码所述WysR蛋白的DNA分子;
[0042]4)与1)或2)或3)限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码所述WySR蛋白的DNA分子。
[0043]上述严格条件可为用6XSSC，0.5%SDS的溶液，在65°C下杂交，然后用2XSSC，0.1%SDS 和 I X SSC, 0.1%SDS 各洗膜一次。
[0044]所述wysR基因具体可通过以上所述重组表达载体导入所述目的菌株中，得到所述转基因菌株。
[0045]在上述应用或方法中，所述菌株为能产生武夷菌素的菌株；进一步，所述能产生武夷菌素的菌株具体可为不吸水链霉菌武夷变种(Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis) CK-15。
[0046]在本发明的一个实施例中，所述菌株具体为不吸水链霉菌武夷变种(Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis) CK-15。
[0047]在上述应用或方法中，所述武夷菌素敏感菌株具体可为深红酵母AS2.282(Rhodotorula rubra)。
[0048]利于所述方法获得的转基因菌株也属于本发明的保护范围。
[0049]实验证明，本发明所提供的WysR蛋白及其编码基因对于培育武夷菌素高产新菌株具有重要的理论和实际意义。本发明在生物农药领域具有广阔的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0050]图1为AwysR缺失突变株的PCR鉴定结果。其中，泳道M为DNA分子量标准200bpDNA Ladder (购自天根)；泳道I为作为对照的出发菌株CK-15 ;泳道2和3分别为Λ wysR缺失突变株Λ wysR271和Λ wysR293。
[0051]图2为wysR基因互补菌株的PCR验证结果。其中，泳道M为DNA分子量标准IKbPlus DNA Ladder (购自北京全式金生物技术有限公司)；泳道I为对照的菌株CK-15 ;泳道2为作为对照的突变株Λ wysR271 ;泳道3和4分别为互补菌株com-Rl和com_R2。
[0052]图3为wysR转基因菌株的PCR验证结果。其中，泳道M为DNA分子量标准IKbPlusDNA Ladder (购自北京全式金生物技术有限公司);泳道I为对照的出发菌株CK-15 ;泳道2为wysR转基因菌株ooR7 ;泳道3为wysR转基因菌株ooR12。
[0053]图4为武夷菌素标准品和各菌株发酵液的HPLC检测结果。其中，A为武夷菌素标准品的HPLC图谱；B为出发菌株CK-15的HPLC图谱；C为wysR转基因菌株(ooR7)的HPLC图谱；D为Λ wySR缺失突变株(Λ wysR271)的HPLC图谱；E为wysR基因互补菌株(com-Rl)的HPLC图谱。
[0054]图5为各菌株发酵液的抑菌活性鉴定结果。其中，A为wysR转基因菌株(ooR7)的抑菌圈；B、E为原始菌株CK-15的抑菌圈；C、G为空载体CK-15/pSETC的抑菌圈；D SAwysR缺失突变株(AwysR271)的抑菌圈；FSwysR基因互补菌株(com-Rl)的抑菌圈；HSAwysR缺失突变株(AwysR293)的抑菌圈。
【具体实施方式】
[0055]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0056]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0057]不吸水链霉菌武夷变种(Streptomycesahygroscopicus var.wuyiensis)CK_15:记载于“王万群，武夷菌素产生菌CK-15细菌人工染色体(BAC)文库构建，2008.6.1” 一文中。
[0058]E.coli ET12567/pUZ8002:记载于“Kieser TBM, Buttner MJ, Chater KF, HopwoodDA(2000)Practical Streptomyces Genetics.The John Innes Foundation, Norwich，，一文
中。`
[0059]pKCll39载体:记载于“Bierman M, Logan R, O’Brien K, Seno ET, Rao RN, SchonerBE (1992)Plasmid cloning vectors for the conjugal transfer of DNA fromEscherichia coli to Streptomyces spp.Gene 116:43 - 49，，一文中。pKC1139 为温度敏感型质粒,带有一个来自s.ghanaensis的温度敏感型复制子，当培养温度超过34°C时该游离质粒在链霉圃中不能自我复制。
[0060]pSET152载体:记载于“Bierman M, Logan R, O’Brien K, Seno ET, Rao RN, SchonerBE(1992)Plasmid cloning vectors for the conjugal transfer of DNA fromEscherichia coli to Streptomyces spp.Gene 116:43 - 49，，一文中。
[0061]pSETC 载体:记载于 “Keqiang Fan, Guohui Pan, Xiaojing Peng, JiantingZheng,Wubin Gao,Juan Wang,Weishan Wang,Yue Li, and Keqian Yang.(2012)Identification of JadG as the B Ring Opening Oxygenase Catalyzingthe Oxidative C-C Bond Cleavage Reaction in Jadomycin Biosynthesis.Chemi stry&Bio logy 19, 1381 - 1390”一文中。
[0062]pBBRlMCS-5载体:记载于“刘钰莹.脱氮关键酶基因的克隆、鉴定及高效脱氮菌株的构建.中国农业科学院,2010年硕士论文”一文中。
[0063]pEASY-Tlsimple载体:全式金生物试剂公司。
[0064]深红酵母AS2.282 (Rhodotorula rubra):武夷菌素生物效价测定用指示菌，载于“曾洪梅林德忻石义萍，农抗武夷菌素产生菌原生质体诱变育种.中国生物防治，1996年01期，48-49.”一文中。[0065]实施例1、与武夷菌素生物合成相关的wysR基因的获得
[0066]以不吸水链霉菌武夷变种(Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis)CK-15为出发菌株，通过筛选CK-15基因组fosmid文库中的阳性单克隆，并进行测序，得到一段约50kb的序列，利用生物信息学分析及开放阅读框的比对，得到一个GC含量非常高，符合链霉菌基因特征的基因，将该基因命名为wysR。wysR基因的核昔酸序列如序列表中序列2所示。
[0067]提取不吸水链霉菌武夷变种(Streptomycesahygroscopicus var.wuyiensis)CK-15的基因组DNA，以其为模板，采用引物I和引物2进行PCR扩增。
[0068]引物1:5’ -ATGGCCTCCCTCGAC-3’(序列 2 的第 1-15 位)；
[0069]引物2:5’ -TCACTTGATGAAGTCGTCC-3’(序列 2 的第 564-582 位的反向互补序列)。
[0070]反应结束后，对PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示经PCR扩增获得了长度约为580bp的目的片段。回收并纯化PCR产物，进行测序。结果表明，该片段的长度为582bp，核苷酸序列如序列表中序列2所示，整个序列2即为wysR基因的编码区序列，编码序列表中序列I所不的蛋白质，将该蛋白命名为WysR。
[0071]实施例2、wysR基因缺失突变株的构建及鉴定
[0072]一、同源重组质粒pKC-WG的构建
[0073]将不吸水链霉菌武夷变种(Streptomycesahygroscopicus var.wuyiensis)CK-15的基因组DNA中的wysR基因的上、下游片段分别扩增出来，得到两个同源臂，接着在两个同源臂之间连入抗性标记基因庆大霉素基因(Gm)，再将其插入到PKC1139载体骨架中，得到用于构建wysR基因缺失突变株的同源重组质粒pKC-WG。具体操作如下:
[0074]1、用于扩增两个同源臂的引物的设计
[0075]根据不吸水链霉菌武夷变种(Streptomycesahygroscopicus var.wuyiensis)CK-15基因组DNA中wysR基因及其上下游序列(序列3)设计引物，用于扩增两个同源臂。
[0076]用于扩增上游同源臂(简称ArmA)的引物如下:
[0077]ArmA-F:5’ -AAGCTTAGCACCGACGAACCTGG-3，(下划线部分为 Hind III 的识别序列，其后为序列3的第1-17位)；
[0078]ArmA-R:5’ -TCTAGAACTGCGGCGGAACTCCT-3’ (下划线部分为 Xba I 的识别序列，其后为序列3的第1030-1046位的反向互补序列)。
[0079]用于扩增下游同源臂(简称ArmB)的引物如下:
[0080]ArmB-F:5’ -TCTAGAATGGGCATCCTCAACG-3’ (下划线部分为 Xba I 的识别序列，其后为序列3的第1509-1524位)；
[0081]ArmB-R:5’ -GGATCCGCGAGATGCCGTTGG-3’ (下划线部分为 BamH I 的识别序列，其后为序列3的第2785-2799位的反向互补序列)。
[0082]2、PCR扩增获得两个同源臂
[0083]以不吸水链霉菌武夷变种(Streptomycesahygroscopicus var.wuyiensis)CK-15基因组DNA为模板，采用引物对ArmA-F/ArmA-R进行PCR扩增，扩增产物大小约为1046bp，测序后其核苷酸序列为序列表中序列3的第1-1046位。
[0084]以不吸水链霉菌武夷变种(Streptomycesahygroscopicus var.wuyiensis)CK-15基因组DNA为模板，采用引物对ArmB-F/ArmB-R进行PCR扩增，扩增产物大小约为1291bp，测序后其核苷酸序列为序列表中序列3的第1509-2799位。
[0085]3、重组质粒pEASY-W的构建
[0086]用Hind III和Xba I双酶切上游同源臂，回收酶切产物，与经过同样双酶切的pEASY-Tlsimple载体骨架大片段相连，得到中间载体；用Xba I和BamH I双酶切下游同源臂，回收酶切产物，与经过同样双酶切的中间载体骨架大片段相连，得到重组质粒。将经测序表明在pEASY-Tlsimple载体的Hind III和BamH I之间插入“序列3的第1-1046位+TCTAGA+序列3的第1509-2799位”的重组质粒命名为pEASY_W。
[0087]4、重组质粒pEASY-WG的构建
[0088]以pBBRlMCS-5载体为模板，采用引物Gm-F和Gm-R进行PCR扩增，获得抗性基因庆大霉素基因(Gm)。其中，引物GM-F和GM-R的序列如下:
[0089]Gm-F:5，-TCTAGAGACGCACACCGTGGAAA-3，(下划线部分为 Xba I 的识别序列，其后为序列4的第1-17位)；
[0090]Gm-R:5’ -TCTAGAGCGGCGTTGTGACAATTT-3’ (下划线部分为 Xba I 的识别序列，其后为序列4的第838-855位的反向互补序列)；
[0091]将经过上述PCR扩增所得产物一抗性基因庆大霉素基因(Gm)进行序列测定，其核苷酸序列为“ TCTAGA+序列4+TCTAGA”。
[0092]将所得PCR产物用Xba I单酶切，回收酶切产物，与经过同样酶切的pEASY_TIsimple载体骨架大片段相连，得到重组质粒，将其命名为pEASY_TGM。
[0093]用Xba I单酶切重组 质粒pEASY-TGM，与经过同样酶切的重组质粒pEASY-W的骨架大片段相连，得到重组质粒pEASY-WG。
[0094]重组质粒pEASY-WG的结构描述为:在pEASY-Tlsimple载体的Hind III和BamH I之间插入序列5后得到的重组质粒。
[0095]5、同源重组质粒pKC-WG的构建
[0096]用Hind III和BamH I双酶切重组质粒pEASY_WG，回收大小约为3200bp的目的片段，将其与经过同样双酶切的PKC1139载体的骨架大片段相连，得到重组质粒。将酶切鉴定正确的质粒送样测序。将经测序表明在PKC1139载体的酶切位点Hind III和BamH I之间插入序列表中序列5所示DNA片段后的质粒命名为pKC-WG。
[0097]二、wysR基因缺失突变株的构建
[0098]将步骤一构建的同源重组质粒pKC-WG通过电击法转入E.coli ET12567/pUZ8002中，得到的重组菌命名为ETpKC-WG。再通过接合转移的方法，将ETpKC-WG导入不吸水链霉菌武夷变种(Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis) CK-15 中，具体操作参见“杨振娟，孙蕾，武哲等.不吸水链霉菌武夷变种CK-15遗传转化体系的探索及初建.生物技术通报，2012，(10): 193-198” 一文，如下:取作为出发菌株的不吸水链霉菌武夷变种(Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis) CK-15 的成熟抱子做成抱子悬浮液，将重组菌ETpKC-WG做成感受态，与CK-15孢子悬浮液等体积混合后涂MS平板，于30°C培养16小时后，覆盖含25 μ g/ml的萘唳酮酸(抑制大肠杆菌生长)以及50 μ g/ml的安普霉素(PKC1139载体携带安普霉素抗性基因)和50 μ g/ml的庆大霉素的Iml无菌水中，继续放37°C培养箱恒温培养至长出接合转移子。长出的菌落可能为重组质粒pKC-WG整合到链霉菌CK-15染色体上的重组菌株，再挑取单菌落分别在含有庆大霉素和安普霉素的MS平板上划线，选取在庆大霉素抗性平板上生长，而在安普霉素抗性平板上不生长的菌株，得到wysR基因缺失突变株，将其命名为AwySR缺失突变株。
[0099]三、wysR基因缺失突变株的鉴定
[0100]挑取步骤二构建的Λ wysR缺失突变株的单菌落，进行液体培养，提取菌株的基因组DNA，以其为模板，采用如下引物对进行PCR扩增，通过PCR产物大小及序列对Λ wysR缺失突变株进行分子鉴定。同时以作为出发菌株的不吸水链霉菌武夷变种(Streptomycesahygroscopicus var.wuyiensis) CK-15 作为对照。
[0101]上游引物:5’-TCAAGGAAACCTCAAGCG-3’(序列 5 的第 589-606 位，序列 3 的第589-606 位)；
[0102]下游引物:5’ -GCGTAACACGGGAATGG-3’(序列5的第2108-2124位的反向互补序列，序列3的第1703-1719位的反向互补序列)。
[0103]理论上，在AwysR缺失突变株中，由于庆大基因Gm (855bp)代替了原来目的基因wysR (582bp),而且重组质粒左右臂中各包含了 wysR基因上游和下游60bp的碱基序列，同时在庆大基因Gm (855bp)的上下游各加入了一个Xba I的识别序列(6bp),发生同源重组双交换的突变株比出发菌株序列长405bp (855-582+60+60+6+6=405)。采用以上引物对进行PCR扩增的片段大小应为1536bp (序列5的第589-2124位)；而作为对照的出发菌株CK-15的PCR产物大小应为1131bp (序列3的第589-1719位)。
[0104]将AwysR缺失突变株和出发菌株CK-15的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示。从图中可以看出， AwysR缺失突变株的PCR产物大小约为1536bp，而出发菌株CK-15的PCR产物大小约为1131bp，与预期结果一致。进一步，将Λ wysR缺失突变株的PCR产物送样测序，其核苷酸序列正为序列5的第589-2124位；将出发菌株CK-15的PCR产物送样测序，其核苷酸序列正为序列3的第589-1719位。可见，步骤二所得到的Λ wysR缺失突变株为阳性，从中选取两株鉴定阳性的菌株分别命名为Λ wysR271和Λ wysR2930
[0105]实施例3、wysR基因互补菌株的构建及鉴定
[0106]为了证明缺失突变株丧失产生武夷菌素的能力是由wysR基因的缺失引起的，而不是极性效应导致的其他基因的失活，本发明的发明人将带有启动子区域的wysR基因重新导入实施例2制备的AwysR缺失突变株，观察对产生武夷菌素的影响。将wysR基因克隆至整合性穿梭质粒载体pSET152上,构建重组质粒p-wysR。通过接合转移实验,导入实施例2制备的AwysR缺失突变株，并利用PCR验证回复株中包含完整的wysR基因。具体如下:
[0107]—、重组质粒p-wysR的构建
[0108]根据不吸水链霉菌武夷变种(Streptomycesahygroscopicus var.wuyiensis)CK-15基因组DNA中wysR基因及其上游包含其自身启动子的序列(序列8)设计引物com-F和com-R，用于扩增完整的wysR基因。
[0109]com-F:5’ -TCTAGA CGGAAGCGGCGGTAGT-3’(下划线部分为 Xba I 的识别序列，其后为序列8的第1-16位)；
[0110]Com-R:5，-GGATCC CGGTCGGCGTCACTT-3’(下划线部分为 BamH I 的识别序列，其后为序列8的第959-973位的反向互补序列)。
[0111]PCR扩增得到完整的wysR基因序列，将所得PCR产物用Xba I和BamH I双酶切，回收酶切产物，与经过同样酶切的PSET152载体相连，得到重组质粒，将其命名为p-wysR。将酶切鉴定正确的质粒送样测序。测序结果表明与序列8吻合。[0112]重组质粒p-wysR的结构描述为:在pSET152载体的Xba I和BamH I之间插入序列8后得到的重组质粒。
[0113]二、wysR基因互补菌株的构建
[0114]将上述步骤一构建的重组质粒p-wysR通过电击法转入E.coli ET12567/pUZ8002中，得到的重组菌命名为ETp-wysR。再通过接合转移的方法，将ETp-wysR导入实施例2制备的AwysR缺失突变株Λ wySR271中，具体操作参见“杨振娟，孙蕾，武哲等.不吸水链霉菌武夷变种CK-15遗传转化体系的探索及初建.生物技术通报，2012, (10): 193-198”一文，如下:取实施例2制备的Λ wysR缺失突变株Λ wysR271的成熟孢子做成孢子悬浮液，将重组菌ETp-wysR做成感受态,与Λ wysR271孢子悬浮液等体积混合后涂MS平板,于30°C培养16小时后，覆盖含25 μ g/ml的萘啶酮酸(抑制大肠杆菌生长)以及50 μ g/ml的安普霉素(PSET152载体携带安普霉素抗性基因)Iml无菌水中，继续放30°C培养箱恒温培养至长出接合转移子。挑取单菌落，获得wysR基因互补菌株，从中选取两株分别命名为com-Rl和com-R2。
[0115]三、wysR基因互补菌株的鉴定
[0116]挑取步骤二构建的wysR基因互补菌株com-Rl和com-R2的单菌落，进行液体培养，提取菌株的基因组DNA，以其为模板，采用如下引物对进行PCR扩增，通过PCR产物大小及序列对wysR基因互补菌株进行分子鉴定。由于pSET152载体携带安普霉素抗性基因,若扩增出安普霉素抗性基因，则说明获得的菌株确为wysR基因互补菌株。同时以不吸水链霉菌武夷变种(Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis) CK-15 和实施例 2 制备的Δ wysR缺失突变株Λ wysR271作为对照。
[0117]引物3:5’ -GTGCAATACGAATGGCGAA-3’(序列 6 的第 1-19 位)；
[0118]引物4:5’ -GCATTCTTCGCATCCCGCCT-3’(序列 6 的第 731-750 位的反向互补序列)。
[0119]理论上,在wysR基因互补菌株中，由于重组表达载体p_wysR中有安普霉素抗性基因，以其基因组DNA为模板，采用以上引物对进行PCR扩增，会得到与安普霉素抗性基因序列大小吻合的扩增片段(750bp，序列6的第1-750位)；而作为对照的不吸水链霉菌武夷变种(Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis)CK_15 和实施例 2 制备的AwysR 缺失突变株AwysR271由于不含有安普霉素抗性基因，因而采用以上引物对进行PCR扩增，不会得到目的条带。
[0120]通过验证，将得到的wysR基因互补菌株和实施例2制备的AwysR缺失突变株AwysR271的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示。从图中可以看出，泳道3和4为互补菌株com-Rl和com-R2的PCR产物大小约为750bp，而菌株CK-15 (泳道I)和突变株AwysR271 (泳道2)无扩增条带,与预期结果一致。进一步,将互补菌株的PCR产物送样测序，其核苷酸序列正为序列6的第1-750位。可见，得到的互补菌株com-Rl和com-R2为阳性。
[0121]实施例4、wysR转基因菌株的构建及鉴定
[0122]一、重组表达载体psf-wysR的构建
[0123]提取不吸水链霉菌武夷变种(Streptomycesahygroscopicus var.wuyiensis)CK-15的基因组DNA，以其为模板，采用引物wysR-F和wysR-R进行PCR扩增，获得包含wysR基因的核糖体结合位点(RBS)的区域序列。
[0124]wvsR-F:5’ -GGATCC TGATATCCGCGCAGACCGCTCC-3’ (下划线部分为 BamH I 的识别序列，其后的序列为序列?的第1-22位)；
[0125]wvsR-R:5’ -ACTAGT TCACTTGATGAAGTCGTCC-3’ (下划线部分为 Spe I 的识别序列，其后的序列为序列7的第614-632位的反向互补序列)。
[0126]反应结束后，对PCR扩增产物进行纯化，用限制性内切酶BamH I和Spe I对纯化产物进行双酶切，回收目的片段，与经过同样双酶切的pSETC载体骨架大片段相连，得到重组质粒。将酶切鉴定正确的重组质粒送样测序。将经测序表明在PSETC载体的酶切位点BamHI和Spe I之间插入序列表中序列7所示DNA片段后的质粒命名为psf-wysR。
[0127]在重组表达载体psf-wysR中，启动序列2所示的wysR基因转录的启动子为Psfi4启动子。
[0128]二、wysR转基因菌株的构建
[0129]将步骤一构建的重组表达载体psf-wysR通过电击法转入E.coli ET12567/PUZ8002，得到的重组菌命名为ETpKC-wysR。再通过接合转移的方法，将ETpKC-wysR导入不吸水链霉菌武夷变种(Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis)CK_15 中，具体操作参见“杨振娟，孙蕾，武哲等.不吸水链霉菌武夷变种CK-15遗传转化体系的探索及初建.生物技术通报，2012，(10): 193-198”一文，如下:取作为出发菌株的不吸水链霉菌武夷变种(Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis)CK_15 的成熟抱子做成抱子悬浮液，将重组菌ETpKC-wysR做成感受态，与CK-15孢子悬浮液等体积混合后涂MS平板，于30°C培养16小时后，覆盖含25 μ g/ml的萘啶酮酸以及50 μ g/ml的安普霉素(pSETC载体携带安普霉素抗性基因)的Iml无菌水中，继续培养至长出接合转移子，得到wysR转基因菌株，从中选取2个菌株分别命名为ooR7、和ooR12。
[0130]同时设置向出发菌株CK-15中转入pSETC空载体的对照，所得重组菌株命名为CK-15/pSETC。
[0131]三、wysR转基因菌株的鉴定
[0132]挑取步骤二构建的wysR转基因菌株ooR7、和ooR12的单菌落，进行液体培养，提取菌株的基因组DNA，以其为模板，采用如下引物进行PCR扩增，通过PCR产物大小及测序结果对wysR转基因菌株进行分子鉴定。同时以作为出发菌株的不吸水链霉菌武夷变种(Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis) CK-15 作为对照。
[0133]引物3:5’ -GTGCAATACGAATGGCGAA-3’(序列 6 的第 1-19 位)；
[0134]引物4:5’ -GCATTCTTCGCATCCCGCCT-3’(序列 6 的第 731-750 位的反向互补序列)。
[0135]理论上,在wysR转基因菌株中，由于重组表达载体psf-wysR中有安普霉素抗性基因，以其基因组DNA为模板，采用以上引物对进行PCR扩增，会得到与安普霉素抗性基因序列大小吻合的扩增片段(750bp，序列6的第1-750位)；而作为对照的出发菌株CK-15由于不含有安普霉素抗性基因，因而采用以上引物对进行PCR扩增，不会得到目的条带。
[0136]将wysR转基因菌株和出发菌株CK-15的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示。从图中可以看出，wysR转基因菌株ooR7 (泳道2)和ooR12 (泳道3)的PCR产物大小约为750bp,而出发菌株CK-15 (泳道I)无扩增条带,与预期结果一致。进一步,将wysR转基因菌株ooR7和ooR12的PCR产物送样测序，其核苷酸序列正为序列6的第1-750位。可见，步骤二所得到的wysR转基因菌株ooR7和ooR12为阳性。
[0137]实施例5、AwysR缺失突变株、wysR基因互补菌株和wysR转基因菌株发酵产物的HPLC分析
[0138]一、Λ wysR缺失突变株、wysR基因互补菌株和wysR转基因菌株的发酵培养
[0139]以实施例2获得的Λ wysR缺失突变株Λ wysR271和Λ wysR293,实施例3获得的wysR基因互补菌株com-Rl和com_R2,实施例4获得的wysR转基因菌株ooR7和ooR12,转入pSETC空载体的对照菌株CK-15/pSETC，以及作为出发菌株的不吸水链霉菌武夷变种(Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis) CK-15 为实验材料。
[0140]取各实验材料新鲜成熟的斜面孢子制成孢子悬浮液，测其OD值，让其OD值在同一水平，各取5ml分别接种于IOOmL发酵培养基中，振荡培养(28°C，220r/min)64h，过滤收集发酵液。
[0141]其中，发酵培养基配方如下:每100ml发酵培养基中含玉米粉3g，黄豆饼粉2g，葡萄糖2g,硫酸铵400mg,碳酸韩300mg, pH约为7.0。
[0142]二、发酵液中武夷菌素含量的HPLC分析
[0143]采用型号为Agilend 1100的高效液相色谱仪进行HPLC分析各菌株发酵液中武夷菌素的含量。具体如下:
[0144]1、标准曲线制作
[0145]取武夷菌素标准品，用纯水配制系列浓度的溶液。将系列浓度的武夷菌素标准品溶液按照如下条件进行高效液相色谱检测。以武夷菌素标准品溶液的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，制作标准曲线。
[0146]其中，高效液相色谱条件如下:
[0147]色谱柱:Z0RBAXSB-AQ (4.6mmX 250mm, 5 μ m);流动相:浓度为 1.4g/L 的三氯乙酸水溶液；流速:lmL/min ;柱温:25°C ;检测波长:254nm ;进样量20 μ L。
[0148]具体参见“王立东，张克诚，石义萍，崔增杰，高效液相色谱法测定发酵液中的武夷菌素，农药，第47卷第11期，816-817,2008年11月” 一文。
[0149]2、待测发酵液中的武夷菌素含量测定
[0150]将步骤一所得的各菌株发酵液也分别按照如上条件进行高效液相色谱检测，将与武夷菌素标准品保留时间一致的色谱峰的峰面积代入步骤I所得标准曲线，从而计算得到待测发酵液中的武夷菌素的含量。实验重复三次，结果取平均值。
[0151]3、结果
[0152]武夷菌素标准品的HPLC图谱如图4中A所示，从图中可以看出武夷菌素标准品的出峰时间为21min。出发菌株CK-15的HPLC图谱如图4中B所示，wysR转基因菌株(ooR7)的HPLC图谱如图4中C所示，Δ wysR缺失突变株(Λ wysR271)的HPLC图谱如图4中D所示。从图中可以看出，与出发菌株CK-15的目的色谱峰相比，wysR转基因菌株的目的色谱峰峰面积增大，而Λ wysR缺失突变株未检测到目的色谱峰。
[0153]另外，wy SR基因互补菌株(com-Rl)的HPLC图谱如图4中E所示，结果表明wy SR基因互补菌株可重新产生武夷菌素，而且产量与原始出发菌株CK-15相比没有太大差别。可见，wysR基因的回复实验排除了极性效应的影响，确定了 wysR基因可以正调控武夷菌素的生物合成。
[0154]进一步，各菌株发酵液中武夷菌素含量的检测结果具体如表1所示。
[0155]表1各菌株发酵液中武夷菌素含量的检测结果(单位:μ g/ml)
[0156]
【权利要求】
1.蛋白质，是如下(a)或(b): Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与武夷菌素生物合成相关的由序列I衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于:所述核酸分子是编码权利要求1所述蛋白质的基因；所述基因是如下I)至4)中任一所述的DNA分子: 1)编码序列为序列表中序列2所示的DNA分子； 2)序列表中序列7所示的DNA分子； 3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子; 4)与I)或2)或3)限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。
4.含有权利要 求2或3所述核酸分子的重组载体、表达盒或重组菌。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于:所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体。
6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于:所述重组表达载体中启动所述基因转录的启动子为Psm启动子。
7.权利要求1所述的蛋白质，或权利要求2或3所述的核酸分子，或权利要求4或5或6所述的重组表达载体、表达盒或重组菌在如下al) _a3)任一中的应用: al)调控菌株中武夷菌素产量； a2)选育武夷菌素广量提闻的菌株； a3)制备用于抑制武夷菌素敏感菌株的产品。
8.一种获得转基因菌株的方法，包括如下bl)和b2)的步骤: bl)将编码权利要求1所述蛋白质的基因导入目的菌株中，得到转基因菌株； b2)从步骤bl)所得的转基因菌株中得到与所述目的菌株相比，具有如下性状中至少一种的转基因菌株:武夷菌素产量提高、对武夷菌素敏感菌株的抑制作用增强。
9.根据权利要求7所述的应用，或权利要求8所述的方法，其特征在于:所述菌株为能产生武夷菌素的菌株； 所述能产生武夷菌素的菌株具体为不吸水链霉菌武夷变种(Streptomycesahygroscopicus var.wuyiensis)。
10.利用权利要求8或9所述方法获得的转基因菌株。
【文档编号】C12R1/465GK103626855SQ201310566436
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年11月14日 优先权日:2013年11月14日
【发明者】刘彦彦, 葛蓓孛, 孙蕾, 张克诚 申请人:中国农业科学院植物保护研究所