基于量子点标记的结直肠癌细胞的检测方法和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及结直肠癌细胞的检测方法技术领域，尤其是设及基于量子点标记的结 直肠癌细胞的检测方法。
[0002] 本发明还设及结直肠癌的检测试剂盒技术，尤其是包含有单克隆抗体33. 26和单 克隆抗体31. 3的试剂盒。
【背景技术】
[0003] 结直肠癌是世界上常见的Ξ大恶性肿瘤之一，其死亡率排第Ξ位，近年来，随着人 们生活水平的提高W及饮食结构的改变，其发病率呈明显上升趋势。但是，目前国内外对 结直肠癌的早期诊断仍处于较低水平，约半数的患者明确诊断时已进入中期和晚期结直肠 癌。因此，提高结直肠癌的早期诊断是目前国内外迫切需要解决的关键问题。目前早期诊 断结直肠癌有W下几种的常用技术：
[0004] (1)大便隐血试验是结肠癌常用的筛查方法，操作简便、无创，主要缺点是灵敏度 低、特异性差。
[0005] (2)电子结肠镜（简称内镜）是发现及诊断结直肠癌最有效的手段，也是目前早期 诊断结直肠癌的主要方法，尤其是在高危人群的检查具有重要的临床价值。因其为创伤性 检查伴有出血、肠穿孔等危险的副作用、且需要一定的设备和仪器，对操作人员的专业水平 要求较高，故在大范围人群的检查存在着很大的局限性。
[0006] 做电化学发光技术检测常用肿瘤标记物姻CEA、CA199、CA242、CA50,因其阳性 率低，缺乏特异性化6. 7% )，不合适用于结直肠癌的早期诊断。
[0007] (4)采用PCR技术检测患者血清或粪便内的DNA和检测微小RNA的浓度对结直肠 癌治疗监测和预后评价有一定的价值，但它们在应用于结直肠癌的早期诊断方面还有待 于进一步研究。
[0008] 近年来，国内外学者开始致力于寻找敏感、特异、可靠、有效的结直肠癌新生物标 记物W及建立无创伤性检查和实验方法来提高早期诊断结直肠癌的诊断率。
[0009] 近年来有研究显示，M2型丙酬酸激酶（M2-PK)在胃肠肿瘤的发生、发展和代谢中发 挥重要的作用。与正常组织相比，胃癌组织中M2-PK表达升高，与患者低生存率相关。国外 学者认为肿瘤M2-PK在血浆、粪便检测其灵敏度巧0. 7% )和特异性巧6. 3% )较高，且与 疾病分期和淋己结转移相关，有望成为结直肠癌新型肿瘤标记物，尤其是在粪便的检测其 临床价值更大。M2-PK主要W两种形式存在，即前者主要存在于分化的组织和正常增殖的细 胞中，而后者常存在于肿瘤细胞中，与底物亲和力低，促使肿瘤细胞内糖代谢中间体如憐酸 締醇类物质等积累，对肿瘤细胞的增殖具有重要作用。当肿瘤发生时往往伴随二聚体形式 的Mz-PK含量增加。
[0010] 随着技术的发展，量子概念也浸入了医学领域。量子点如antumdots,QDs)又称 半导体纳米微晶体（Semicon化ctornanoCTystals)，是半径小于或接近于激子玻尔半径的 一类半导体纳米粒子。量子点具有一般纳米微粒的基本性质如表面效应、体积效应和量子 尺寸效应，具有宽的激发光谱、窄的发射光谱、可精确调谐的发射波长、可忽略的光漂白等 优越的巧光特性。正是基于量子点独特的光学性质使得它在生物化学、分子生物学、细胞生 物学、基因组学W及蛋白质组学等研究中有着极大的应用前景。量子点纳米标记巧光不仅 能特异性祀向肿瘤部位，还能通过巧光强弱反映出其活跃程度，可应用于肿瘤的早期诊断 和监测疗效。
[0011] 由于结直肠癌在遗传学上是多步骤、多阶段、多基因改变的过程，多基因联合检测 对提高检出率及检测敏感性更有重要意义。结直肠癌是一种多基因性疾病，在发生发展过 程中设及到相关基因的改变如：K-ras、APC等基因突变。国外学者报道K-ras基因突变与 结直肠癌密切相关，是结直肠癌的早期分子事件。APC基因突变与早期结直肠癌和腺瘤的诊 断有较大的临床价值，尤其是在高危人群早期诊断具有重要意义。近年来我国学者提出富 含亮氨酸重复测序G蛋白禪联受体5 (LGR5)，是一种干细胞分子标记物，也是Wnt信号通路 的祀基因之一，其表达量的增加能够促进胃肠黏膜的自我更新，LGR5在结直肠癌组织中呈 高水平的表达。目前有研究提出AKT和PI3K基因突变可作为肿瘤的早期诊断、确定肿瘤的 浸润范围W及判断预后的重要指标。近年来，有研究表明MXRAS有可能成为对大肠癌前病 变早期诊断的有实用价值的肿瘤标记物。
[0012] 因此急需一种能够是实现与肿瘤细胞紧密结合的巧光探测技术，尤其是能够利用 量子点技术，能够准确实现对结直肠癌的检测的技术。
【发明内容】
[0013] 本发明为了克服现有技术的不足，提出一种能够实现对M2丙酬酸激酶进行准测 检测的方法W及提供一种用于检测结直肠癌细胞的试剂盒。
[0014] 为了解决上述的技术问题，本发明提出的基本技术方案的一个方面为：一种基于 量子点标记的结直肠癌细胞的检测方法，包括步骤：
[0015] A:制备抗人M2型丙酬酸激酶的单克隆抗体过程
[0016] 小鼠免疫：W基因重组M2型丙酬酸激酶蛋白为抗原结合等体积的弗氏完全佐剂 对第一小鼠和第二小鼠进行免疫；
[0017] 杂交瘤细胞株生成：取血清抗体效价达1X106W上的小鼠，无菌取小鼠脾脏制成 细胞悬液与对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株混合形成组合液，将聚乙二醇溶液加入所述组 合液，产生抗人M2型丙酬酸激酶的单克隆抗体的杂交瘤细胞并选取强阳性杂交瘤细胞进 行克隆化，获得一株M2丙酬酸激酶33. 26的杂交瘤细胞株和一株M2丙酬酸激酶31. 1的杂 交瘤细胞株；
[0018] 单克隆抗体生成：在第一小鼠体内接种M2丙酬酸激酶33. 26的杂交瘤细胞株制 备腹水获得单克隆抗体33. 26,在第二小鼠体内接种M2丙酬酸激酶31. 1的杂交瘤细胞株制 备腹水获得得到单克隆抗体31. 3 ;
[0019] B:量子点巧光探针的制备过程
[0020] 对QD605溶液进行量子点活化；
[0021] 经过量子点活化的QD 605的溶液与抗人M2型丙酬酸激酶的单克隆抗体通过非共 价偶联形成量子点巧光探针；
[0022] C:往结直肠癌细胞加入量子点巧光探针，并在共聚焦巧光显微镜下观察结直肠癌 细胞的巧光图像或者通过计算机分析巧光图像w判断结果。
[0023] 本所述的基于量子点标记的结直肠癌细胞的检测方法中，所述基因重组M2型丙 酬酸激酶蛋白由携带M2丙酬酸激酶蛋白基因的大肠杆菌的工程菌株制配制而得。
[0024] 本所述的基于量子点标记的结直肠癌细胞的检测方法中，小鼠免疫过程中，所 述第一小鼠和第二小鼠为4-6周的雌性小鼠，对第一小鼠和第二小鼠进行第一次注射免 疫时，采用弗氏完全佐剂与等体积M2丙酬酸激酶抗原混匀乳化，每只小鼠皮下多点注射 30 后每10天W弗氏不完全佐剂与等体积M2丙酬酸激酶抗原混匀乳化后对第一小鼠 和第二小鼠进行注射免疫，一共注射免疫4次后，于融合前的3天，对第一小鼠和第二小鼠 的腹腔注射M2丙酬酸激酶抗原100 μ g进行加强免疫。
[00巧]本所述的基于量子点标记的结直肠癌细胞的检测方法中，单克隆抗体生成过程 中，腹水的制备是分别在第一小鼠和第二小鼠腹腔内注射0.5ml弗氏不完全佐剂，使杂交 瘤细胞能W腹水瘤形式在腹腔内生长；大约1~2周后，将2X1〇6个杂交瘤细胞悬浮于无 血清RPMI1640培养基中，注入小鼠腹腔内制得。
[00%] 本所述的基于量子点标记的结直肠癌细胞的检测方法中，所述强阳性杂交瘤细胞 为阳性率达到100%的杂交瘤细胞。
[0027] 本发明的另一方面设计到一种试剂盒，包括包被捕获抗体的微孔反应板、样品处 理液、标记有标记物的检测抗体、阳性对照、阴性对照和缓冲液，所述捕获抗体为单克隆抗 体33. 26,所述的检测抗体为单克隆抗体31. 3。
[0028] 本发明所述的试剂盒中，所述标记物为量子点、链霉亲和素、胶体金和缓冲液中的 一种。
[0029] 本发明所述的试剂盒中，所述标记物为量子点和链霉亲和素。
[0030] 本发明所述的试剂盒中，所述链霉亲和素结合有生物素化抗体受体，该链霉亲和 素与生物素化抗体的比例为1 : 40。
[0031] 本发明的有益效果是：
[0032] 本发明所述的基于量子点标记的结直肠癌细胞的检测方法，所述单克隆抗体 33. 26和单克隆抗体31. 3,能特异性结合M2丙酬酸激酶蛋白的不同位点，可W实现准确、快 速地检测出M2丙酬酸激酶含量，而与其它肿瘤如卵巢癌、前列腺癌和口腔癌无交叉反应， 能够极大的提高结直肠癌的检测准确度。更进一步地，由本发明所述的试剂盒通过单克 隆抗体33. 26和单克隆抗体31. 3所组成的试剂盒检测M2丙酬酸激酶蛋白的灵敏度可达 30pg/ml，检测M2丙酬酸激酶特异性抗原的灵敏度为6. 1P即/0. 1ml，而且快速、准确检测及 能检测分泌物包括粪便和血清。
【附图说明】
[0033] 图1为本发明所述的基于量子点标记的结直肠癌细胞的检测方法原理流程图；
[0034] 图2为本发明所述的M2丙酬酸激酶的蛋白浓度曲线图；
[0035]图3为本发明所述的免疫消暑的血清效价分析的曲线图。
【具体实施方式】
[0036] W下将结合附图1和附图3对本发明做进一步的说明，但不应W此来限制本发明 的保护范围。
[0037] 为了方便说明，将本发明设及的有关名词做一下规定：
[0038] M2丙酬