和染色形态 进行结果判定，检测抗体强度W(+~++++)计为阳性，抗体强度（±)和（-)计为阴性。如 表2结果显示M2-PK-1和M2-PK-2单克隆抗体与固定在玻片上M2-PK抗原特异性结合，与 其他黄病毒属成员，M1-PK抗原和L-PK抗原均无交叉反应。 阳074] 表2M2-PK单克隆抗体的免疫巧光检测结果 阳0巧]
[0076] (3)免疫印迹分析法进行单克隆抗体特异性分析 阳077] 将重组的M2-PK蛋白，用2XSDS加样缓冲液稀释一倍，将样品加到10%SDS-聚丙 締酷胺凝胶中，电泳分离蛋白质，通过电洗脱使在凝胶上分离出来的蛋白质转印到硝酸纤 维膜上，转印膜用含7%脱脂奶和3%654的1〇1111?85于4°(：封闭6小时，将转印膜装在专 口的反应板中，分别加入杂交瘤细胞培养上清中，4°C反应过夜，用含有0. 5%Twe
[0078]en20的lOmMPBS洗涂膜后，加入1 : 500倍稀释的HRP标记羊抗鼠IgG，室溫反 应1小时，用同样的洗涂液洗涂膜后，DAB显色后，用去离子水终止显色。 阳0巧]本发明采用Western bolt方法验证2株单克隆抗体与重组M2-PK蛋白特异性 结合，结合蛋白相对分子质量为72KD(千道尔顿）。特异性蛋白质结合带与预测分子量为 72KD(千道尔顿）相一致。说明获得的单克隆抗体能够特异性识别重组的M2-PK抗原。免 疫印迹结果如图3所示，其中曲线1为1号小鼠，曲线2为2号小鼠，曲线3为3号小鼠，曲 线4为为免疫小鼠。
[0080] h.抗体的生产
[0081]①直接大量培养阳性克隆株细胞，收集上清液；
[0082] ②将所收集的上清液离屯、（lOOOOg，lOmin的离屯、后，取上清液；
[0083] ③将所得上清液经0. 22 μ m的滤网过滤后，存于-20°C冰箱，W备纯化。
[0084] i.抗体的纯化
[00化]W上所产生的抗体经化TrapproteinG柱亲和层析纯化，SDS-PAGE电泳测定抗 体纯度，Bra壯ord法测定抗体浓度，并将抗体浓度调至Img/ml，4°C保存、备用。
[0086] 似量子点巧光探针M2-PK-QD605的制备 阳087] ①量子点活化
[0088] 取100ml已配置好的QD605,分别加入0.Imol/L1-乙基-碳酷二亚胺盐酸盐 (邸C)和O.Olmol/LN-径基硫代班巧酷亚胺（N服），摇动反应20min，超滤后即为量子点活 化液。取100μΙ量子点活化液，分别加入不同量（2ml、4ml、8ml、16ml)的M2-PK，摇动反应 90min后，10000巧m离屯、3min，上清液即为偶联产物M2-PK-QD605。量子点与抗体蛋白摩 尔比为1 : 20,1 : 40,1 : 80,1 : 160,条件进行偶联，反应产物经0.5%琼脂糖凝胶电泳 检测，通过电泳带分析。
[0089]②M2-PK与QD605 的偶联：
[0090] 本发明的M2-PK通过非共价偶联的方式与QD 605结合，构建为M2-PK-QD 605的 巧光探针。首先将CdSeTe/ZnS的量子点与链酶亲和素结合构建为QD-链酶亲和素的标记 分子；然后，再将QD-链酶亲和素的标记分子与M2-PK抗体连接构成巧光探针。由于量子点 本身的特性和优点，是一种新型的巧光染料，巧光强度高，发射光是普通巧光染料的10~ 20倍，稳定性强100倍W上，标记后巧光稳定时间较长，适合用于对样本的实时监测及检验 项目。
[0091] ③M2-PK-QD605的巧光特性
[0092]a.分别取400μ1M2-PK-QD605溶液和游离量子点QD605,利用巧光分光光度计 扫描各自的激发光谱。
[0093] b.取400μ1M2-PK-QD605溶液置于巧光分光光度计样品室内，用488皿的激发 光持续照射1小时，通过分析巧光强度的变化，考察M2-PK-QD605抗光漂白能力。
[0094] ④M2-PK-QD605对大肠癌(XL187细胞的特异性及免疫巧光成像
[0095] 取盖玻片的对大肠癌(XL187细胞，PBS漂洗3次；4%多聚甲醒室溫固定15min， PBS漂洗3次；加入M2-PK-QD605,37°C湿盒浮育1小时，PBS漂洗3次；DAPI避光染色 5min，PBS漂洗3次；共聚焦巧光显微镜下观察细胞的巧光图像。WPBS和游离QD605替 代M2-PK-QD605浮育（XL187细胞为空白对照，用M2-PK-QD605浮育的人宫颈HeLa细胞 为阴性对照。
[0096] 本发明的另外一个方面，设及一种试剂盒，包括包被捕获抗体的微孔反应板、样品 处理液、标记有标记物的检测抗体、阳性对照、阴性对照和缓冲液，所述捕获抗体为单克隆 抗体33. 26,所述的检测抗体为单克隆抗体31. 3。
[0097] 所述标记物可W为量子点、链霉亲和素、胶体金和缓冲液中的一种。具体实施时所 述标记物为量子点和链霉亲和素；所述链霉亲和素结合有生物素化抗体，该链霉亲和素与 M2-PK抗体的比例为1 : 40,是获得最佳的偶联条件，提高实验检测的灵敏度和特异性。
[0098] 根据上述说明书的掲示和教导，本发明所属领域的技术人员还可W对上述实施方 式进行变更和修改。因此，本发明并不局限于上面掲示和描述的【具体实施方式】，对本发明的 一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用 了一些特定的术语，但运些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。
【主权项】
1. 一种基于量子点标记的结直肠癌细胞的检测方法，其特征在于，包括步骤： A:制备抗人M2型丙酮酸激酶的单克隆抗体过程 小鼠免疫：以基因重组M2型丙酮酸激酶蛋白为抗原结合等体积的弗氏完全佐剂对第 一小鼠和第二小鼠进行免疫； 杂交瘤细胞株生成：取血清抗体效价达1X106以上的小鼠，无菌取小鼠脾脏制成细胞 悬液与对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株混合形成组合液，将聚乙二醇溶液加入所述组合 液，产生抗人M2型丙酮酸激酶的单克隆抗体的杂交瘤细胞并选取强阳性杂交瘤细胞进行 克隆化，获得一株M2丙酮酸激酶33. 26的杂交瘤细胞株和一株M2丙酮酸激酶31. 1的杂交 瘤细胞株； 单克隆抗体生成：在第一小鼠体内接种M2丙酮酸激酶33. 26的杂交瘤细胞株制备腹水 获得单克隆抗体33. 26,在第二小鼠体内接种M2丙酮酸激酶31. 1的杂交瘤细胞株制备腹水 获得得到单克隆抗体31. 3 ; B:量子点荧光探针的制备过程 对QD605溶液进行量子点活化； 经过量子点活化的QD605的溶液与抗人M2型丙酮酸激酶的单克隆抗体通过非共价偶 联形成量子点荧光探针； C:往结直肠癌细胞加入量子点荧光探针，并在共聚焦荧光显微镜下观察结直肠癌细胞 的荧光图像或者通过计算机分析荧光图像以判断结果。2. 如权利要求1所述的基于量子点标记的结直肠癌细胞的检测方法，其特征在于：所 述基因重组M2型丙酮酸激酶蛋白由携带M2丙酮酸激酶蛋白基因的大肠杆菌的工程菌株制 配制而得。3. 如权利要求1所述的基于量子点标记的结直肠癌细胞的检测方法，其特征在于：小 鼠免疫过程中，所述第一小鼠和第二小鼠为4-6周的雌性小鼠，对第一小鼠和第二小鼠进 行第一次注射免疫时，采用弗氏完全佐剂与等体积M2丙酮酸激酶抗原混匀乳化，每只小鼠 皮下多点注射30μg;以后每10天以弗氏不完全佐剂与等体积M2丙酮酸激酶抗原混匀乳 化后对第一小鼠和第二小鼠进行注射免疫，一共注射免疫4次后，于融合前的3天，对第一 小鼠和第二小鼠的腹腔注射M2丙酮酸激酶抗原100μg进行加强免疫。4. 如权利要求1所述的基于量子点标记的结直肠癌细胞的检测方法，其特征在于：单 克隆抗体生成过程中，腹水的制备是分别在第一小鼠和第二小鼠腹腔内注射0. 5ml弗氏不 完全佐剂，使杂交瘤细胞能以腹水瘤形式在腹腔内生长；大约1~2周后，将2X106个杂交 瘤细胞悬浮于无血清RPMI1640培养基中，注入小鼠腹腔内制得。5. 如权利要求1所述的基于量子点标记的结直肠癌细胞的检测方法，其特征在于：所 述强阳性杂交瘤细胞为阳性率达到100%的杂交瘤细胞。6. -种试剂盒，包括包被捕获抗体的微孔反应板、样品处理液、标记有标记物的检测抗 体、阳性对照、阴性对照和缓冲液，其特征在于：所述捕获抗体为权利要求1之5之一单克隆 抗体33. 26,所述的检测抗体为权利要求1-5之一单克隆抗体31. 3。7. 如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述标记物为量子点、链霉亲和素、胶体 金和缓冲液中的一种。8. 如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述标记物为量子点和链霉亲和素。
【专利摘要】本发明公开了一种基于量子点标记的结直肠癌细胞的检测方法及试剂盒，其包括步骤：制备抗人M2型丙酮酸激酶的单克隆抗体过程、量子点荧光探针的制备过程和往结直肠癌细胞加入量子点荧光探针，并在共聚焦荧光显微镜下观察结直肠癌细胞的荧光图像；通过量子点标记抗人M2型丙酮酸激酶的单克隆抗体可组成液态芯片或免疫荧光检测结直肠癌细胞或蛋白免疫诊断试剂盒，该试剂盒具有灵敏度高和特异性好的优点，并且能快速、准确检测及能检测分泌物包括粪便和血清能够极大的提高结直肠癌的检测准确度。
【IPC分类】G01N33/577
【公开号】CN105277707
【申请号】CN201510017323
【发明人】何凤屏
【申请人】深圳市森塔医疗器械有限公司
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2015年1月12日