酸激酶（M2-PK)
[0039] M2 丙酬酸激酶 33. 26 (M2-PK-03)
[0040] M2 丙酬酸激酶31.3 (M2-PK-〇6)
[0041] 量子点巧光探针（M2-PK-QD605)
[0042] 一种基于量子点标记的结直肠癌细胞的检测方法，包括步骤：
[0043] A:制备抗人M2型丙酬酸激酶的单克隆抗体过程
[0044] 小鼠免疫：W基因重组M2型丙酬酸激酶蛋白为抗原结合等体积的弗氏完全佐剂 对第一小鼠和第二小鼠进行免疫；
[0045] 杂交瘤细胞株生成：取血清抗体效价达1X106W上的小鼠，无菌取小鼠脾脏制成 细胞悬液与对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株混合形成组合液，将聚乙二醇溶液加入所述组 合液，产生抗人M2型丙酬酸激酶的单克隆抗体的杂交瘤细胞并选取强阳性杂交瘤细胞进 行克隆化，获得一株M2丙酬酸激酶33. 26的杂交瘤细胞株和一株M2丙酬酸激酶31. 1的杂 交瘤细胞株；
[0046] 单克隆抗体生成：在第一小鼠体内接种M2丙酬酸激酶33. 26的杂交瘤细胞株制备 腹水获得单克隆抗体33. 26,在第二小鼠体内接种M2丙酬酸激酶31. 1的杂交瘤细胞株制备 腹水获得得到单克隆抗体31. 3 ;
[0047] B:量子点巧光探针的制备过程
[0048] 对QD605溶液进行量子点活化；
[0049] 经过量子点活化的QD605的溶液与抗人M2型丙酬酸激酶的单克隆抗体通过非共 价偶联形成量子点巧光探针；
[0050] C:往结直肠癌细胞加入量子点巧光探针，并在共聚焦巧光显微镜下观察结直肠癌 细胞的巧光图像。
[0051] 具体实施时 阳05引 （1)制备抗人M2型丙酬酸激酶的单克隆抗体
[0053] a.免疫抗原的制备
[0054] 本发明用于制备单克隆抗体的免疫原为基因重组M2丙酬酸激酶蛋白。基因重组 M2丙酬酸激酶蛋白是用携带M2丙酬酸激酶蛋白基因的一种大肠杆菌的工程菌株制备的， 其制备按常规方法进行，详细的制备方法可参照使用手册。将M2丙酬酸激酶蛋白纯化后， W考马斯亮蓝（Coomassie)蛋白分析试剂（PIERCE,化t，No.ED62976)定量，免疫原鉴定结 果见图1。 阳化5] b.免疫小鼠
[0056] 取5周龄雌性BALB/c小鼠，第一次采用弗氏完全佐剂与等体积M2丙酬酸激酶抗 原混匀乳化，每只小鼠皮下多点注射30μg，W后每10天W弗氏不完全佐剂与等体积M2丙 酬酸激酶抗原混匀乳化后免疫，共4次后，于融合前3天每只小鼠腹腔注射M2丙酬酸激酶 抗原100μg进行加强免疫。 阳057]C.免疫血清抗体效价测定 阳化引建立间接化ISA法测定免疫血清抗体效价。配制1μg/ml重组M2-PK蛋白的50mM pH9. 6碳酸盐缓冲液，包被聚苯乙締微96孔板，100μ1/孔，4°C过夜。次日，用含0. 25%酪 蛋白（Sigma)的封闭液300μ1/孔4°C过夜，弃液并拍干后真空干燥2~12小时，用侣膜袋 真空包装4°C保存，用于鼠免疫血清抗体效价测定。于第四次免疫后10天眼眶采血，鼠免 疫血清用含0. 1 %BSAlOmMPBSW1〇3~10 6倍稀释，加入96孔板，100μ1/孔37°C30分 钟，lOmMPBS含0. 1 %Tween-20洗涂液洗板五次后，加入1 : 1000倍稀释辣根过氧化物酶 (HR巧标记羊抗小鼠IgG(Sigma，INC.)，100μ1/孔37°C30分钟，同上洗板后，加入TMB显色 液，100μ1/孔，室溫避光显色10分钟，加100μ1/孔1MH2SO4终止反应，测450nm吸光值， W免疫前小鼠血清作为阴性对照，W测定值与对照值之比>2.1为阳性来判断免疫血清的 抗体效价，见图2,图中的直线线满足W下数学式：y= 1324.X-2. 7978。
[0059] d.杂交瘤制备和筛选
[0060] 选择血清抗体效价达1X1〇6的小鼠，于融合前3天腹腔注射M2丙酬酸激酶抗 原100μg。无菌取小鼠脾脏，制成脾细胞悬液与对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株NS-1按 10 : 1的比例混合，45%聚乙二醇（PEG,MW4000,Sigma)作用下进行融合。按下述步骤将 聚乙二醇溶液加入细胞。在37°C水浴中，在Imin内缓慢加入1.0ml阳G，边加边轻轻摇匀， 分别于lmin、2min、3min、4min、5min内加lml、2ml、3ml、4ml、5ml无血清RPMI-1640 培养基 终止融合，最后加入10ml含15%胎牛血清的RPMI-1640培养基，室溫80化pm离屯、5min，弃 上清，用60ml含15%胎牛血清的RPMI-1640培养基轻轻悬起细胞。将此细胞悬液加入6块 96孔培养板上，在二氧化碳培养箱中溫度为37°C、5%C02的培养箱中。次日于每孔加入 100μ1含次黄嚷岭、氨基噪岭、胸腺喀晚脱氧核巧（HAT，Sigma)筛选培养基。W后每3天 用此筛选培养基给培养物换液一次，直到细胞克隆形成。
[0061] 为检测产生抗体克隆的存在，用上述间接化ISA法检测细胞培养上清液。选择强 阳性杂交瘤细胞进行了克隆化，用有限稀释法连续克隆化2~3次，共获得两株稳定分泌抗 体的杂交瘤细胞株，分别是为M2-PK-03和M2-PK-06的杂交瘤细胞株。将克隆化后阳性率 达100%的细胞扩增培养后液氮冻存。e.抗M2-PK蛋白单克隆抗体腹水的制备和抗体纯化
[0062] 采用体内诱生法制备本发明中单克隆抗体33. 26和单克隆抗体31. 1，即在小鼠体 内接种杂交瘤细胞M2-PK-03制备腹水获得单克隆抗体33. 26,或者在小鼠体内接种杂交瘤 细胞M2-PK-06制备腹水获得单克隆抗体31. 1。具体制备方法简述如下：
[0063] 每只小鼠腹腔内注射0.5ml弗氏不完全佐剂（Sigma公司），使瘤细胞能W腹水瘤 形式在腹腔内生长。大约2周后，将2X106个杂交瘤细胞悬浮于无血清RPMI1640培养基 中，注入小鼠腹腔。注射杂交瘤细胞大约1周后，用9号针头放腹水，可反复收集数次。腹 水经离屯、澄清后4°C存放备用。
[0064] 腹水抗体的纯化采用辛酸-硫酸锭沉淀法，腹水用60mM、p册.0醋酸缓冲液稀释2 倍，用0.1N盐酸调抑值至4. 8,液体由清亮变混浊，室溫下于30分钟内边揽拌边逐滴缓慢 加入辛酸，为每毫升稀释前腹水加33 μ 1辛酸，出现大量沉淀，4°C静置2小时，lOOOOg，4°C 离屯、30分钟，取上清，加入1/10体积的抑7. 4 lOOmM憐酸盐缓冲液，并用0.1 N氨氧化钢 调抑值至7. 4,冰浴揽拌下缓慢加入硫酸锭，为每毫升液体加入0. 277硫酸锭即为45%饱 和度，4°C静置过夜，lOOOOg，4°C离屯、30分钟，弃上清，沉淀溶于适量lOmM憐酸盐缓冲液，用 同样的液体，4°C透析过夜，换液Ξ次。W考马斯亮蓝（Coomassie)蛋白分析试剂（PIERCE， 化t，No.ED62976)定量。测定浓度后的抗体加入终浓度50%的甘油于-80°C保存。 阳ο化]f.抗Μ2-ΡΚ蛋白单克隆抗体亚类鉴定
[0066] 用上述的间接化ISA法检测在本项目中获得的阳性克隆W确定其产生的抗体亚 类。即M2-PK抗原包被微孔板，封闭后与杂交瘤细胞培养上清解育，再分别与为1 : 1000 倍稀释HRP标记的兔抗小鼠不同亚类特异性免疫球蛋白，运些抗体包括兔抗小鼠IgGl(美 国ZYMEDLABORATORIES，INC，目录号 61-0120)，兔抗小鼠IgG2a(同上，目录号 61-0220)， 兔抗小鼠IgG化（同上，目录号61-0320)，兔抗小鼠IgG3 (同上，目录号61-0420)，兔抗小鼠 IgM(同上，目录号61-6820)。检测结果显示，杂交瘤细胞株M2-PKTU1分泌的单克隆抗体 33. 26和杂交瘤细胞株M2-PKTU2分泌的单克隆抗体31. 1均为IgGl阳性。
[0067] g.鉴定M2-PK蛋白单克隆抗体的特异性 W側 （1)间接ELISA法进行单克隆抗体特异性分析 W例分别用四个血清型重组M2-PK抗原、M1-PK抗原和kPK抗原、天然M2-PK抗原和 天然M1-PK抗原包被微孔板，按照常规的间接化ISA法进行检测。即在包被的微孔板中加 入1 μ g/ml的单克隆抗体33. 26和31. 1，37°C解育比，加入1:1000稀释辣根过氧化物酶 标记羊抗小鼠IgG(Sigma，Inc)，100 μ 1/孔37°C解育30min，加TMB显色液室溫避光显色 lOmin，加1MH2SO4终止反应，测450nm吸光值（A4日。），见表1。
[0070] 表1M2-PK单克隆抗体与重组的M2-PK抗原间接ELISA反应结果
[0071]
[0072] (2)间接免疫巧光法进行单克隆抗体特异性分析 阳07引分别用M2-PK感染的BHK21细胞，M1-PK抗原和kPK抗原感染C6/36细胞，当有 2/3细胞出现病变时，收集细胞，用预冷的1XPBS洗细胞二遍，然后将细胞滴于无菌干燥 的玻片上，干燥后，制备成涂片，充分干燥，用冷丙酬固定10分钟后吹干，将本项目的单克 隆抗体M2-PK-03和M2-PK-06按10μg/ml的浓度滴在不同的抗原孔中，每孔10μ1，同时 设阴性和阳性对照，置37°C水浴箱中，解育45分钟后，取出将抗原片放于染色缸中用lOmM pH7. 2PBS洗3次，吹干，加入巧光标记羊抗小鼠IgG抗体，置37°C水浴箱中，解育45分钟 后，取出将抗原片洗涂4次，吹干，巧光显微镜下观察巧光图像，W巧光的强度