一种用于胃病检测的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本申请设及生物检测领域，具体设及胃病的检测。
【背景技术】
[0002]胃蛋白酶原II(简称PGII)来源于全胃腺和远端十二指肠化unner氏腺，胃粘 膜合成的PGII约为总量的25%，PGII大部分进入消化道，少量进入血液循环，因此被称为 "反映胃部状态和功能的指针"。
[000引国内外临床研究指出，PGII与胃底粘膜病变的相关性较大，其升高与胃底腺管萎 缩、肠上皮化生或假幽口腺化生、异型增生有关。测定PGII含量有助检测出十二指肠溃瘍、 萎缩性胃炎、胃炎、胃癌等其他消化道疾病，供临床检测和体检筛查需求。在人群胃病筛查 中，每个人做胃镜是不现实的，可通过非侵入性血清PG检测将浅表性胃炎、糜烂性胃炎、胃 溃瘍、十二指肠溃瘍、胃癌等高危人群筛查出来，再进行胃镜检查是一种切实可行的方案。 现有技术已知采用时间分辨巧光测量技术，组建的PGII的TRFIIA试剂盒是目前PGII检测 方法中最灵敏、测量范围最宽的方法之一，但是价格昂贵不利于大规模推广。
[0004]系统进化指数富集技术（SELEX技术）是20世纪90年代初发展起来的一种新的 组合化学技术，其运用大容量的随机寡核巧酸文库，结合体外PCR扩增技术，W指数富集 与祀分子特异结合的寡核巧酸，经过多轮筛选，获得亲和力高、特异性强的寡核巧酸适配子 (aptamers)。该技术己成功运用于许多祀分子的筛选，包括金属离子、有机染料、药物、蛋白 质、氨基酸W及各种细胞因子等。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是通过系统进化指数富集技术（SELEX技术）筛选胃蛋白酶原II的 寡核巧酸适配子来替代抗体，提供一种简洁快速、高灵敏度、高特异性的胃蛋白酶原II早 期检测及分离纯化方法。
[0006] 本发明的技术方案： 本发明中用于系统进化指数富集技术筛选的单链DNA随机文库及引物，由美 国invitrogen公司合成，两端为固定序列，中间为42个碱基的随机序列：5'-TACGACATGAACCGTGATAA(M2)CAGTGAAACCTGATGATCGA -3'，库容量为1〇14W上； 引物 1:5' -TACGACATGAACCGTGATAA- 3' ； 引物 2:5' -TCGATCAGCAGGTTTCACTG-3'。
[0007] 人胃蛋白酶原II根据CN103387971A中公开的重组人胃蛋白酶原II同工酶嵌合 蛋白的方法制备获得； GelRed核酸染料购于Biotium公司； 硝酸纤维素滤膜购于美国密理博（Milli化re)公司； 寡聚核巧酸的纯化试剂购于北京天为时代公司； PCR试剂盒和T载体购于美国普洛麦格（ftOmega)公司。
[0008] -种亲和人胃蛋白酶原II核酸适配子，其特征在于核巧酸序列为：SEQIDNO: 1-17任一所示的DM分子。
[0009] 一种上述亲和人胃蛋白酶原II核酸适配子，其特征在于：具有相同功能的寡核巧 酸适配子同源序列占60%W上。
[0010] 一种上述亲和人胃蛋白酶原II核酸适配子，其特征在于：衍生的RNA序列具有相 同的功能。
[0011] 一种上述亲和人胃蛋白酶原II核酸适配子，其特征在于：为能与DNA序列进行杂 交的寡核巧酸序列。
[0012] 一种上述亲和人胃蛋白酶原II核酸适配子，其特征在于：在核酸适配子的任何位 置删除或增加部分寡核巧酸残基所得到的寡核巧酸适配子序列具有相同的功能。
[0013] 一种上述亲和人胃蛋白酶原II核酸适配子，其特征在于：在核酸适配子的任何位 置进行核巧酸种类和稀有碱基的置换后，得到的寡核巧酸适配子序列具有相同的功能。
[0014] 一种上述亲和人胃蛋白酶原II核酸适配子，其特征在于：在核酸适配子的任何位 置进行憐酸化、甲基化、氨基、琉基、同位素、生物素、地高辛、巧光物质、纳米发光材料或酶 标记修饰后，得到的寡核巧酸适配子序列具有相同的功能。
[0015] 一种上述亲和人胃蛋白酶原II核酸适配子，其特征在于：用于人胃蛋白酶原II的 检测和分离纯化，从而用于脑疾病的检测。
[0016] 一种上述亲和人胃蛋白酶原II核酸适配子的制备方法，按W下步骤进行：1)单链 DNA随机寡核巧酸文库的合成；2)利用系统进化指数富集方法对寡核巧酸文库进行筛选； 3)扩增与人白蛋白特异结合的寡核巧酸；4)进行下一轮筛选，经过12轮W上筛选后获得目 的寡核巧酸序列；5)克隆测序。
[0017] 本发明的优点是：具有简便、快速、经济等特点，与其他组合化学库如随机肤库、 抗体库和隧菌体表面展示文库相比，从寡核巧酸文库中筛选出的适配子具许多优势：1)本 身是寡核巧酸，分子量较小，可W化学合成，节约成本；2)具有比抗体更高的亲和性和特异 性；3)便于标记且可W在不同部位有选择性的标记；4)重复性和稳定性好，且易于保存，即 对高溫和剧烈条件不敏感。因此，系统进化指数富集技术具有良好的应用前景。
【具体实施方式】
[001引实施例1人胃蛋白酶原II的制备 根据CN103387971A中公开的重组人胃蛋白酶原II同工酶嵌合蛋白的方法制备获得 人胃蛋白酶原II，蛋白浓度为lOOmg/mL。
[0019] 实施例2合成随机单链DM文库和引物 随机单链DNA(ssDNA)文库：5' -TA0GAQVIGM00GTGATM(M2)Q\GTGMA0CrGATGAT0GA-3'，构建了长度 为82nt的随机ssDNA文库，两端为固定引物序列，中间为42个纏的随机序列，库容量为防1?上;弓I 物 1请-TA0GACMM00GTGATM-3' ；引物 2请-TOGATQ\GQ\GGTTTCACTG-3' ；将随机ssDNA文库和 两种引物均用TE缓冲液配制成100μmol/L胆存液_20°C胆存备用。
[0020] 将单链DNA文库扩增为双链DNA，产物经2%琼脂糖凝胶电泳并切胶回收纯化；W 回收的双链DNA为模板，体外转录出单链RNA随机文库，转录产物经PAGE纯化。75μgRNA 文库经硝酸纤维素膜反筛去除与膜结合的RNA分子，然后与化g人胃蛋白酶原II蛋白， 37°C解育30min，反应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涂滤膜；然后将滤膜剪碎，置于洗脱缓冲 液（6mol/L尿素，0. 55mol/L醋酸锭，1.5mmol/L邸ΤΑ,Ο. 15%SD巧中煮沸 5min，离屯、，取 上清，无水乙醇沉淀RNA，并重新溶解于20μ1DEPC水中；WRNA为模板RT-PCR扩增双链 DNA，体外转录出RNA文库用于下一轮筛选；每轮筛选过程中RT-PCR得到双链DNA文库，W 该双链DNA为模板体外转录出RNA适配子库，筛选共进行10轮。得到了 14个适配子，其序 列分别为SEQIDNO: 1-14所示。具体序列如下所示：
实施例3蛋白结合适配子的性能测定 将适配子分别取2.0yg，用牛小肠碱性憐酸酶（CIP) 37°C消化化，纯化回收去憐酸 化的RNA;通过T4多核巧酸激酶标记[丫 -32P]ATP于去憐酸化的RNA分子末端。lOnmol放 射性标记的适配子分别与不同浓度（l-200nM)的人胃蛋白酶原II37°C解育30min，各组 反应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涂滤膜，干燥滤膜，液闪计数仪测定滤膜上残留的放射量， 同一样品平行做两次测定。计算各个适配子与目的蛋白的解离常数。结果如下：
实施例4所述适配子特异性分析W及稳定性分析 分别采用人血白蛋白，免疫血清球蛋白，pgl20蛋白，大肠杆菌外膜蛋白A，胃蛋白酶原II，与14条适配子进行特异性检测，经过结合试验发现，运些适配子都不与运些蛋白相结 合，而只与人蛋白结合保持较高的特异性。
[0021] 将所述的适配子，取0.化g，分别置于常溫的血清、水溶液中，放置四周。通过 RT-PCR检测，发现四周的放置其结构稳定，没有被降解。
[0022] 实施例5所述适配子疾病的诊断 取9个胃溃瘍患者和4个正常人的血液，使用生理盐水稀释，获得目标样本。
[0023] 将14个偶联有标记的适配子分别与9个患者W及4个正常人的样本混合40min， 通过生物素分离，定量分析其中的人胃蛋白酶原II的含量，通过分析发现，9个患者中胃蛋 白酶原II的含量显著增加，超过了规定的阔值。达到了相应胃病病的诊断标准。由此可见， 其诊断效果较好。
[0024] W上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人 员来说，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本 发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种用于胃病检测的试剂盒，其含有能与胃蛋白酶原II特异性结合的核酸适体。2. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述核酸适体序列如SEQIDNo:1-14任 一所示。3. -种检测胃病的方法，其特征在于利用权利要求1-2任一项所述的试剂盒。
【专利摘要】本发明涉及一种胃病检测试剂盒，属于体外试剂诊断技术领域。通过SELEX技术筛选得到能够特异性结合胃蛋白酶原II的核酸适配子，从而利用该适配子来特异性筛选或检测血液中的胃蛋白酶原II，并通过将所述适配子制备成为检测试剂盒可以达到血液不需要稀释直接反应检测减轻工作量的目的；同时获得宽的测量范围，便于临床使用。本发明的积极意义在于：试剂盒灵敏度高、特异性好、测量范围宽、操作简单，利于大规模推广应用，有广阔的市场前景。
【IPC分类】G01N33/573
【公开号】CN105277698
【申请号】CN201510849189
【发明人】卢美珍
【申请人】卢美珍
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2015年11月29日