一种检测猪附红细胞体病的引物、试剂盒及方法
【技术领域】
[0001 ]本发明属于分子生物学技术领域，更具体地，本发明涉及一种检测猪附红细胞体 病的引物、试剂盒及方法。
【背景技术】
[0002] 猪附红细胞体病(Porcine Eperythrozoonosis，PE)是由猪附红细胞体(也称为猪 嗜血支原体，Eperythrozoon Suis,Mycoplasma suis)寄生于红细胞表面或游离于血衆及 骨髓内引起的以发热、贫血、黄疸、新生仔猪或断奶仔猪虚弱，育肥猪生长迟缓，母猪繁殖性 能下降、不孕、流产、死胎等症状为特征的人兽共患传染病。
[0003] 目前对猪附红细胞体病的诊断方法主要有形态学诊断法、免疫学方法以及分子生 物学方法。分子生物学方法主要有DNA探针杂交法、PCR扩增法等。PCR扩增法敏感性高、特异 性强，主要用于种原确定。
[0004] 目前报道的关于猪附红细胞体病PCR检测方法都是基于16S rRNA基因（王妍，张守 发等.猪附红细胞体PCR检测方法的建立.中国农业科学2005，38( 10);张浩吉，谢明权等.猪 附红细胞体PCR检测方法的建立和初步应用.中国兽医学报.2005(06))。由于附红细胞体 16s RNA基因在不同物种之间具有高度同源性，特异性不强，还需要对扩增PCR产物进行进 一步测序来确定种原特异性。
【发明内容】
[0005] 基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种猪附红细胞体病的检 测方法，以及该检测方法所使用的引物，该引物可特异性扩增猪附红细胞体，快速对临床样 品进行检测。
[0006] 为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：
[0007] 一种检测猪附红细胞体病的引物，所述引物如SEQ ID No:l和SEQ ID No:2所示。
[0008] 上述引物在制备检测猪附红细胞体病的试剂盒中的应用。
[0009] -种检测猪附红细胞体病的试剂盒，所述试剂盒包括上述检测猪附红细胞体病的 引物。
[0010] -种检测猪附红细胞体病的方法，采用上述引物，包括以下步骤：
[0011] 以待检猪样本基因组DNA为模板，进行PCR扩增反应，电泳鉴定;所述PCR扩增反应 的反应体系为：
[0012]
[0013] 所述PCR扩增反应的反应程序为：94°C 5min进行预变性；然后94°C 30s，52°C 30s，72 °C30s，35次循环；最后72°C延伸lOmin。
[0014] 与现有技术相比，本发明具有以下显著效果：
[0015] 1、本发明的检测猪附红细胞体病的引物可以特异性地扩增猪附红细胞体，对其他 常见病原如猪丹毒杆菌、猪肺炎支原体、猪多杀性巴氏杆菌、猪链球菌、猪胸膜肺炎放线杆 菌、副猪嗜血杆菌等无反应，无需对扩增PCR产物进行进一步测序就可确定种原特异性；
[0016] 2、本发明的检测猪附红细胞体病的方法具有很高的灵敏性，灵敏度可达0.18ng左 右，可以方便、快捷的对各种临床猪血样的猪附红细胞体进彳丁检测，有利于快速制定针对性 的防控措施，操作简单、实用。
【附图说明】
[0017] 图1为本发明实施例1中猪附红细胞体病临床样品检测图谱，其中：泳道1为猪附红 细胞体阳性对照，泳道2为猪附红细胞体阴性对照，泳道3、4、5、6为临床血样；
[0018] 图2为本发明试验例1中猪附红细胞体的PCR检测方法的特异性的电泳图谱，其中： 泳道1为猪附红细胞体阳性样品，泳道2为猪附红细胞体阴性样品，泳道3-8分别为猪丹毒杆 菌、猪肺炎支原体、猪多杀性巴氏杆菌、猪链球菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌样 品；
[0019] 图3为本发明试验例2中猪附红细胞体病的PCR检测方法的灵敏度的电泳图谱，其 中泳道1、2、3、4、5、6、7的0嫩浓度分别为0.17848、0.0178以8、1.78即、0.178叫、0.0178即、 1·78pg、0·178pg。
【具体实施方式】
[0020] 以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。
[0021] 以下实施例中涉及的实验材料如无特殊说明，均来源于市售，以下实施例中所采 用的操作均为本领域技术人员所熟知的常规操作。
[0022] 实施例1检测猪附红细胞体病的引物和方法
[0023] 1、引物设计
[0024] 根据NCBI登录的猪附红细胞体基因组序列（登录号：CP002525，FQ790233)进行比 对，设计了特异性扩增猪附红细胞体的引物，分别为FI，R1。
[0025] F1：ATTTGGATCTGTTAACCATAAGGGAG(SEQ ID N0:1)
[0026] R1：CAATATAACAGGAGGATCATAAGCC(SEQ ID NO:2)
[0027] 2、检测方法
[0028] 包括以下步骤：
[0029] (1)待检猪样本基因组DNA提取
[0030] 采用天根生化（北京）有限公司血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，目录号 DP304。
[0031]取200μ1新鲜、冷冻或加入各种抗凝剂的不同猪场猪血液样品4份(编号为3,4,5， 6)，不足200μ1可加缓冲液GA补足；颠倒混匀，室温放置5min，期间再颠倒混匀几次； lOOOOrpm(~11，500 X g)离心lmin，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200μ1缓冲液GA，振荡至 彻底混匀；加入20μ1 Proteinase Κ溶液，混匀;加入200μ1缓冲液GB，充分颠倒混匀，70°C放 置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠;加入200μ1无水乙醇，充分振荡 混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠;将上一步所得溶 液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12，000rpm(~13，400 Xg) 离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；向吸附柱CB3中加入500μ1缓冲液GD，12， 000印111(~13,400\8)离心3〇86(3，倒掉废液，将吸附柱033放入收集管中 ；向吸附柱033中加 入600μ1漂洗液PW，12，000rpm(~13,400 Xg)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集 管中；重复漂洗一次;将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm(~13,400\ 8)离心211^11，倒掉 废液;将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液;将吸附柱 CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μ1洗脱缓冲液TE，室温 放置2-5min，12,000rpm(~13,400\ 8)离心21^11，将溶液收集到离心管。收集的溶液即为基 因组DNA模板。
[0032] (2)、PCR 扩增
[0033] 将PCR反应液加入PCR反应管混合均匀后，加入基因组DNA模板，将PCR管置于PCR仪 上进行循环扩增反应；
[0034] PCR反应体系如下，其中Premix EX Taq是PCR反应用的DNA Polymerase、Buffer、 dNTP Mixture的2倍浓度的混合物，包含DNA Polymerase 1.25U/25yL、Buffer(Tris-HCl, ρΗ8·3 20mM，KCl 100mM，MgCl2 3mM)、dNTP Mixture各0.4mM:
[0035]
[0036] 所述PCR扩增反应的反应程序为:94 °C5min进行预变性;然后94 °C 30s，52 °C 30s，72 °C30s，35次循环；最后72°C延伸10min。
[0037] (3)、电泳鉴定
[0038] PCR扩增后取5yL反应产物，在1 % (质量比）的琼脂糖凝胶上进行电泳鉴定，PCR产 物出现292bp条带，即为猪附红细胞体阳性，无条带出现的为阴性，本实施例的猪血液样品 检测结果见图1，猪血液样品3、6检测为阳性;猪血液样品4、5检测为阴性。
[0039]试验例1特异性试验
[0040] 以猪丹毒杆菌、猪肺炎支原体、猪多杀性巴氏杆菌、猪链球菌、猪胸膜肺炎放线杆 菌、副猪嗜血杆菌样品进行特异性检测。使用实施例1中所提供的方法和引物进行检测，结 果显示，除阳性对照组外均没有扩增曲线，扩增结果见图2。
[0041] 试验例2灵敏度试验
[0042] 用实施例1中制备的基因组模板用灭菌蒸馏水做10倍的梯度稀释，基因组DNA含量 分别为〇 · 178yg、0 · 0178yg、1 · 78ng、0 · 178ng、0 · 0178ng、1 · 78pg、0 · 178pg。
[0043] 每个稀释度各取lyL作为模板，按实施例1方法进行检测，观察阳性条带，以出现阳 性预期条带所用模板量的最高稀释度计算其敏感性，结果表明最小检出量为〇.178ng，见图 3〇
[0044] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并 不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保 护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【主权项】
1. 一种检测猪附红细胞体病的引物，其特征在于，所述引物如SEQ ID No: 1和SEQ ID No: 2所示。2. 权利要求1所述的引物在制备检测猪附红细胞体病的试剂盒中的应用。3. -种检测猪附红细胞体病的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的 检测猪附红细胞体病的引物。4. 一种检测猪附红细胞体病的方法，其特征在于，采用如SEQ ID N〇:l和SEQ ID N〇:2 所示的引物，包括以下步骤： 以待检猪样本基因组DNA为模板，进行PCR扩增反应，电泳鉴定;所述PCR扩增反应的反 应体系为： Premix EX Taq 12 5μL SEQ ID No: i ΙμL SEQ ID No:2 lpL 模板 l^L 灭菌蒸馏水 加至25pL; 所述PCR扩增反应的反应程序为：94°C5min进行预变性;然后94°C 30s，52 °C 30s，72 °C 30s，35次循环；最后72°C延伸lOmin。
【专利摘要】本发明公开了一种检测猪附红细胞体病的引物、试剂盒及方法，所述引物如SEQ？ID？No:1和SEQ？ID？No:2所示，所述方法是以待检猪样本的基因组DNA为模板，进行PCR扩增反应，电泳鉴定。本发明的检测猪附红细胞体病的引物可以特异性地扩增猪附红细胞体，对其他常见病原无反应；方法具有很高的灵敏性，可以方便、快捷的对各种临床猪血样的猪附红细胞体进行检测，有利于快速制定针对性的防控措施，操作简单、实用。
【IPC分类】C12Q1/04, C12N15/11, C12Q1/68, C12R1/35
【公开号】CN105624326
【申请号】CN201610209860
【发明人】欧阳海平, 潘永飞, 宋爽, 王东东, 宋延华
【申请人】广东温氏食品集团股份有限公司
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2016年4月6日