基于番茄黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-3的CAPS分子标记的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于农业生物技术工程领域，特别涉及一种基于番茄黄化曲叶病毒病抗病 基因 Ty-3的CAPS标记及扩增该分子标记的引物、利用分子标记的检测方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 番前(Solanum lycopersicum L.)属于前科(Solanaceae)，为一年生草本前科植 物。番茄起源于南美西部地区，是世界范围内广泛栽培的重要蔬菜作物之一，深受广大消费 者的喜爱。随着番茄栽培面积的逐年扩大，栽培方式的多样化，番茄病虫害问题日趋严重， 近年来，番茄黄化曲叶病毒病在世界各地保护地番茄种植上普遍发生，给番茄生产带来巨 大经济损失。
[0003] 近年来，番茄黄化曲叶病毒病抗病育种取得长足进步，截止目前，已发现了7-1、丁7_ 2、丁7-3、了7-3&、了7-4、了 7-5等多个抗性基因，其中了7-1、了7-2、了7-3作为番茄抗了￥^^的主效 抗性基因在生产中得以应用(Liedl，et al. ,2013)。
[0004] 近年来，分子标记尤其是以PCR为基础的DNA分子标记技术在番茄育种中广泛应 用，大大加快了育种的进程和效率。目前，已有诸如REX_l(de Castro et al.，2007)、 TG0302(Garcia et al.,2007)、P6-25(Ji ve ark.,2008)和UF_TY3-P23(Verlaan,et al·， 2013)等多个与番茄黄化曲叶病毒病抗病基因紧密的连锁标记被陆续开发出来，并逐步在 育种实践中加以应用。但这些标记均与抗病基因间存在一定的遗传距离，故筛选时会出现 一定比例的假阳性。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种基于番茄黄化曲叶病毒病抗病基因 Ty-3的CAPS标记， 该标记与Ty-3基因完全连锁。
[0006] 本发明的另一目的在于提供该分子标记在番茄黄化曲叶病毒病抗性基因 Ty-3检 测以及标记辅助育种中的应用。
[0007] 为了实现本发明目的，本发明提供了一种基于番茄黄化曲叶病毒病抗病基因 Ty-3 的CAPS标记，该分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
[0008] 本发明还提供了一种扩增基于番茄黄化曲叶病毒病抗性基因 Ty-3的CAPS标记的 弓丨物对，该引物对序列如下：
[0009] 正向引物序列：5' -TTGCCACATTAAGCAGAACG-3' ；
[0010] 反向引物序列：5'-TGATGGTCATTGAATGTGCT-3'。
[0011] 本发明还提供了一种基于番茄黄化曲叶病毒病抗性基因 Ty-3的CAPS标记的检测 方法，该方法以抗感番茄黄化卷叶病毒的番茄基因组DNA为模板经PCR扩增，扩增产物经 BamHI酶切后得到能同时鉴定抗病亲本、感病亲本及其杂合体的基因型的特异谱带，该特异 谱带为携带抗性基因的植株谱带和不携带抗性基因的植株谱带，所述携带抗性基因 Ty-3的 植株谱带为核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示的分子标记。
[0012] 上述方法中，能同时鉴定抗病亲本、感病亲本及其杂合体的基因型的特异谱带分 别为 332bp，21 lbp/121bp，332bp/21 lbp/121bp。
[0013] 上述方法中，不携带抗性基因 Ty-3的植株PCR扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0014] 上述方法中，PCR反应体系（20yL)为：包括正、反向引物各0.8μΜ，1.2πιΜ dNTPs， 2 · 5mMMgCl2，2μ1 10 X buf f er，0 · 5uni ts Taq聚合酶，DNA模板30-50ng，ddH20补至20yL。 [0015] 上述方法中，PCR扩增的程序均为：94°C预变性5min;94°C变性30s，58°C退火45s， 72°(：延伸458,35个循环;72°(：延伸1〇1^11 ;保存温度4°(：。
[0016] 上述方法中，PCR产物酶切反应体系：15yL反应体系包括PCR产物5.0yL，CutSmart Buffer 1.5yL，BamHI 0.3yL，ddH2〇补至 15yL。
[0017] 本发明还提供了上述分子标记和检测方法在番茄黄化曲叶病毒病抗性基因 Ty-3 检测或标记辅助育种中的应用。
[0018] 本发明有益效果：
[0019] 番茄黄化曲叶病毒病是目前我国番茄生产上威胁最为严重的病害之一。本发明从 抗病基因 Ty-3(S〇lyc06g051190)直接入手，开发抗病基因（Ty-3)特异CAPS标记，该标记为 共显性标记，可直接应用于标记辅助选择。
[0020] 该标记是一个基于PCR技术的共显性标记，跟RFLP、AFLP等标记相比，可显著降低 成本，节省劳力。另外，该标记完全基于抗病基因 Ty-3，与Ty-3基因共分离，用其检测不存在 假阳性问题。将该标记应用于苗期选择，不仅可以减少工作量，而且能够避免因接种不充分 难以准确筛选出具有抗病基因的个体植株，从而加速育种进程。
【附图说明】
[0021] 本发明有如下附图：
[0022]图1为CAPS标记(Ty-3-CAPS)在感病材料和抗病材料中的部分DNA序列 [0023] (A39中存在BamM酶切位点，A45中无 BamM酶切位点）；
[0024] 图2为CAPS标记Ty-3-CAPS在亲本间及F1中的酶切结果
[0025] (1:100bp ladder;2_3:感病亲本A39;4_5:抗病亲本A45;6_7:Fi单株）
[0026] 图3为CAPS标记Ty-3-CAPS在F2群体中的验证
[0027] (M:D2000; 1-48 :F2 代单株）；
[0028] 图4为CAPS标记Ty-3-CAPS在回交群体中的应用
[0029] (M:D2000; 1-48 :BCi 代单株）。
【具体实施方式】
[0030] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神 和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范 围。
[0031] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0032] 实施例1基于Ty-3基因的CAPS标记的开发及验证
[0033] 1.供试材料
[0034]本试验所用的抗病自交系A45和感病自交系A39经已知分子标记P6-25检测，A45为 抗病纯合体(Ty-3/Ty_3)，而A39为感病纯合体(丨7-3八7-3)<^45为母本439为父本配制杂 交组合，得到F1后，再自交得到F2分离群体。
[0035] 2.接种鉴定
[0036]抗性鉴定采用烟粉虱接种鉴定法，具体参照杨晓慧(2012)的方法。于幼苗2-3片真 叶期，将其放置于放有带毒烟粉虱的生长室内，两周后杀死带毒的烟粉虱，之后将苗子移栽 到日光温室或大田中，观察病情结果。
[0037] 3. CAPS分子标记的开发及验证 [0038] A、CAPS标记的开发
[0039] Verlaan等（2013)报道Ty-3基因即为Solyc06g051190。登陆SGN(Sol Genomics Network)网站( http://solgenomics.net/)，获得Solyc06g051190序列，利用在线引物设计 软件Primer 3plus，分段设计引物(表1)。本试验中所用到的番前材料A45和A39的基因组 DNA从2-3周幼苗的叶片中用CTAB法提取(Fulton et al. ,1995)。根据设计的引物，对样品 A45和A39的DNA进行PCR扩增。PCR扩增体系:扩增反应的总体积为50yL，5. OyL模板DNA，5.0μ L 10XPCR Buffer(含Mg2+)，4.0yL High Pure dNTPs(2.5mM)，10yM的上下游引物各l.OyL， 0.3yL EasyTaq DNAPolymerase(5U · μΓ1)，(ΗΗ2〇33·7μΙ^ΡΟ?反应程序为：94°C 预变性 51^11;94°(：变性11^11，55°(：退火458,72°(：延伸1111丨11，35个循环 ；72°(：延伸1〇111丨11;保存温度4 °C。取PCR扩增产物约10yL，在1 %琼脂糖凝胶电泳上检测PCR扩增结果，Bio-RAD自动凝胶成 像系统观察照相，记录电泳结果。琼脂糖凝胶电泳检测成功后，PCR产物使用胶回收试剂盒 (Z