的双重pcr方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子标记辅助育种技术领域，特别是涉及一种同时检测番茄抗病基因 Ty-3a和Tm-2a的双重PCR方法。
【背景技术】
[0002] 番前（Lycopersicon esculentum)是一种世界性蔬菜，营养丰富，适应性广、产量 高，深受消费者的喜爱。番茄黄化曲叶病毒病（TYLCVD)和番茄烟草花叶病毒病（ToMVD)是 番茄生产上的重要病害，分布广，危害重。选育抗番茄黄化曲叶病毒病和烟草花叶病毒病等 病害的多抗性品种，是国内外番茄研宄的重要内容。
[0003] 随着分子生物学技术的发展，利用分子标记辅助选择技术（MAS)选择抗病材料已 越来越多的应用于番茄育种中。分子标记辅助选择与传统人工接种鉴定相比，具有效率高、 速度快、结果准确等优点，因此建立抗病基因的高效分子标记选择体系，现代育种技术的一 项重要内容。
[0004] Ty_3a是番前黄化曲叶病毒病的主效抗病基因，Tm_2a是烟草花叶病毒病的主效抗 病基因，目前，这两个抗病基因已分别建立自己的分子标记辅助选择体系，但尚未建立两个 抗病基因同时检测的分子标记辅助检测体系。建立双重PCR检测体系，可以节省人力、物 力、节约时间，提高材料的鉴定和选择效率。
【发明内容】
[0005] 针对上述存在的技术问题，本发明提供一种同时检测番茄抗病基因 Ty-3a和Tm-2a 的双重PCR方法。该方法通过引物设计、基因组DNA的提取、双重PCR反应体系的建立、反 应产物的凝胶成像检测等步骤，实现利用同一个分子标记选择体系同时检测Ty-3a和Tm-2 a 两个抗病基因的方法，为番茄抗病材料的选择和抗病育种奠定基础。
[0006] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0007] 本发明一种同时检测番茄抗病基因 Ty_3a和Tm_2a的双重PCR方法，该方法通过 引物设计、基因组DNA的提取、双重PCR反应体系的建立、反应产物的凝胶成像检测步骤，确 定番茄育种试材对这两个抗病基因的抗性情况，以选择抗病材料和选育抗病品种，具体两 个抗病基因的双重PCR鉴定方法包括下列步骤：
[0008] (1)根据Ty_3a* Tm-2W个抗病基因分子标记的引物序列设计引物，引物序列如 下表：
[0009]
[0010] ⑵利用CTAB法提取基因组DNA ;
[0011] (3)将两对引物放入同一 PCR反应体系中，进行PCR扩增；
[0012] (4)将PCR产物进行1. 5%琼脂糖凝胶电泳，再用Bio-RAD凝胶系统成像；
[0013] (5)对扩增片段进行分析：扩增出650bp片段为含有抗病基因 Ty-3a的抗病纯合 材料，扩增出650bp和320bp片段为含有抗病基因 Ty-3a的抗病杂合材料，扩增出320bp片 段为不含抗病基因 Ty-3a的纯合感病材料，扩增出472bp片段为含有抗病基因 Tm-2a的抗 病材料。
[0014] 进一步地，所述双重PCR反应总体系为25 μ L溶液体系，其组分和含量为：模板 DNA 2 μ L，两对引物各 1.5 μ L, 10 X Buffer 2.5 μ L，Mgcl2 1.5 μ L，dNTP 0.4 μ L，Taq 酶 0. 4 μ L，补充超纯水至25 μ L ;
[0015] 本发明所述PCR反应体系按照如下程序进行双重PCR反应：94°C预变性5min ;然 后94°C变性30s，58. 5°C复性30s，72°C延伸I. 30min，进行30个循环；最后72°C延伸lOmin。
[0016] 本发明的有益效果为：
[0017] 1.本发明在一个PCR反应体系中同时检测两个抗病基因，所用时间只是分别检测 两个抗病基因的一半，提尚基因的检测效率。
[0018] 2.本发明能够节约抗病基因检测所需要的药品，降低了试验成本。
【附图说明】
[0019] 图1为本发明实施例T y_3a基因引物扩增产物。
[0020] 图2为本发明实施例Tm-2a基因引物扩增产物。
[0021] 图3为本发明实施例Ty-3和Tm_2a基因的双基因扩增产物。
[0022] 图4为本发明实施例利用Ty_3a和Tm_2aS因的引物对19份番茄的双重PCR结 果。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明。
[0024] 实施例：本发明为一种同时检测番茄抗病基因 Ty_3a和Tm_2a的双重PCR方法，该 方法通过引物设计、基因组DNA的提取、双重PCR反应体系的建立、反应产物的凝胶成像检 测步骤，实现利用同一个分子标记体系同时检测Ty-3a和Tm-2 a两个抗病基因的方法，确定 番茄育种试材对这两个抗病基因的抗性情况，以选择抗病材料和选育抗病品种，具体两个 抗病基因的双重PCR鉴定方法包括下列步骤：
[0025] (1)根据Ty_3a* Tm_2W个抗病基因分子标记的引物序列设计引物，引物序列如 下表：
[0026]
[0027] (2)利用CTAB法提取基因组DNA ;
[0028] (3)将两对引物放入同一 PCR (聚合酶链式反应）反应体系中，进行PCR扩增；
[0029] 所述双重PCR反应总体系为25 μ L溶液体系，其组分和含量为：番茄模板DNA 2 μ L，两对引物各1. 5 μ L，10 XBuffer (缓冲液，外购，主要成分是KCL和Tris-HCL) 2. 5 μ L， Mgcl2 L 5 μ L，dNTP (脱氧核糖核苷三磷酸）0· 4 μ L，Taq酶（DNA聚合酶）0· 4 μ L，补充超纯 水至25 μ L ;
[0030] 所述PCR反应体系按照如下程序进行双重PCR反应：94°C预变性5min ;然后94°C 变性3〇8,58.5°0复性3〇8,72°0延伸1.3〇11^11，进行30个循环；最后72°0延伸1〇1^11。
[0031] (4)将PCR产物进行1. 5 %琼脂糖凝胶电泳（Goldview染色），再用Bio-RAD凝胶 系统成像；
[0032] (5)对扩增片段进行分析：扩增出650bp片段为含有抗病基因 Ty_3a的抗病纯合 材料，扩增出650bp和320bp片段为含有抗病基因 Ty-3a的抗病杂合材料，扩增出320bp片 段为不含抗病基因 Ty-3a的纯合感病材料，扩增出472bp片段为含有抗病基因 Tm-2a的抗 病材料。
[0033] 以下具体说明本发明的检测过程：
[0034] 1.番茄材料：本例所用的番茄材料共29份，均为辽宁省农科院蔬菜所提供。其 中10份材料用于Ty-3a和1'111-2 3两个抗病基因的单基因 PCR检测和双重PCR检测，编号为 1-10 ;另19份材料为未知抗病性的番茄材料，用双重PCR检测方法检测其抗病性。
[0035] 2.引物设计
[0036] 鉴定Ty_3a和Tm-2^t性基因所使用的引物序列如下表，引物由上海生物工程技 术公司合成。
[0037]
[0038] 3.番茄基因组DNA的提取
[0039] 采用改良CTAB法提取基因组DNA，具体步骤如下：
[0040] (1)取番茄顶端幼嫩叶片0. 5g于2mL离心管中，液氮冰冻，研磨至粉状；
[0041] (2)立即加入65°C预热的CTAB裂解液800 yL，混勾，65°C水浴Ih ;
[0042] (3)水浴结束后，向离心管中加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1)，混勾，1000 Orpm 离心15min ;
[0043] (4)吸取上清液于另一 2mL离心管，向其内加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1)，混 匀，1000 Orpm 离心 IOmin ;
[0044] (5)吸取上清于2mL离心管，向其内加入420 μ L异丙醇，60 μ L醋酸钠，上下颠倒 混匀。置于-20°C 60min;
[0045] (6)取静置结束的离心管离心，1000 Orpm离心10min，温度为4度最好。
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