As-str基因座荧光标记复合扩增体系及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及检测人体基因组中具有多态性的遗传标记，尤其涉及连锁的AS-STR 基因座荧光标记复合扩增体系及应用。
【背景技术】
[0002] 亲缘鉴定是法医学鉴定上的难点。无名人员身份识别、失散人员认亲、意外或交通 事故死亡人员认领，甚至是大灾难性事件受害人的身源鉴定都会涉及亲缘鉴定。对于一些 没有父母参与的亲缘鉴定来说，除了 Y染色体和线粒体DNA遗传标记可以排除父系或母系 亲缘关系之外，应用常染色体上非连锁的遗传标记时，由于被鉴定的个体之间无法直接观 察等位基因的遗传情况，也就无法直接排除亲缘关系，只能通过比较亲属与无关个体共有 等位基因的概率来评估亲缘关系。由于STR的遗传背景，表现为很多STR的等位基因频率 大于0. 125或更高的0. 25,此值大于三级亲属具有12. 5%或二级亲属有25%相同等位基因 的值，因而无法区分三级亲缘关系或无关个体关系，亲缘关系在二级或三级亲属的鉴定上 遇上了瓶颈。显然，用常染色体非连锁的STR只是对一级亲属（全同胞）鉴定有较好的效 果，而无法将二级亲属、三级亲属或是无关个体区分开，故无法进行亲缘关系鉴别。
[0003] 人类基因组中，存在着一类紧密连锁的STR基因座，连锁的STR构成单体型 (haplotye)从亲代遗传给后代，紧密连锁STR单体型具有高度多态性。在无关个体之间具 有相同单体型的概率非常小，可克服常规非连锁STR多态性不高和遗传背景的干扰，突破 目前不能鉴定二级以上亲缘关系和区别不同亲缘关系的难题。如果某紧密连锁STR组单体 型的多态性是无限地高，那么无关个体之间具有相同单体型的概率就会非常非常小，只有 具有亲缘关系的个体才会有相同的单体型，这样就能将有亲缘关系和没有亲缘关系的个体 区分开来。
[0004] 然而，除X染色体STR基因座外，现有的应用于法医学鉴定的STR都不是紧密连锁 的STR，能够应用于实际亲缘鉴定的紧密连锁STR复合扩增体系迄今国内外仍未有报道。因 此，本发明从3号、4号、17号常染色体上筛选出有高度多态性的紧密连锁STR基因座，建 立复合扩增体系。本发明开发的紧密连锁STR复合扩增试剂盒不仅仅适用于亲缘鉴定，还 可以用于染色体异常的产前诊断，市场应用前景广阔。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种适合于中国人群的，可以快速、 方便针对非紧密连锁的常染色体STR、Y-STR、X-STR无法将二级亲属、三级亲属或是无关个 体区分开，故无法进行亲缘关系鉴别进行鉴定的AS-STR基因座荧光标记复合扩增体系及 应用。
[0006] 本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的：
[0007] AS-STR基因座荧光标记复合扩增体系，该复合扩增体系共包含15个基因座：D3S 2402, D3S2452, D3S1766, D3S4554, D3S2388, D3S4551、D3S2422、D3S3051, D3S3053, D4S2364, D4S2404，AC001348A，AC001348B，D17S975 和 D17S1294 ;所述 15 个基因座引物分别用 FAM、 HEX、TAM 或 ROX 四种荧光素标记；FAM 荧光素标记 D17S1294、D3S4551、D4S2404 和 D3S3053， HEX 荧光素标记 AC001348B、AC001348A、D3S2422 和 D3S4554, TAMRA 荧光素标记 D3S2388、 D3S2452、D3S1766 和 D17S975, ROX 荧光素标记 D4S2364、D3S3051 和 D3S2402 ;其中扩增引 物对分别为：
[0008] D3S2402 引物对：
[0009] F:CCTGGGCAACATAATGAGAT，
[0010] R:TGGACAAAGCATTTTATAATCTG ;
[0011] D3S2452 引物对：
[0012] F:GCTTGCAGATAGCAGATCGT，
[0013] R:TATAAGATTAGTCAGGGCTCGC ;
[0014] D3S1766 引物对：
[0015] F:ACCACATGAGCCAATTCTGT,
[0016] R:ACCCAATTATGGTGTTGTTACC ;
[0017] D3S4554 引物对：
[0018] F:CAATACGGGCTGATGATAGG,
[0019] R:TGGAAATGCTCCCATAGATT ;
[0020] D3S2388 引物对：
[0021] F:TCCACTCAGTACAAGTCTGGG,
[0022] R:GATCCTGTGGTTTGTCGATC ;
[0023] D3S4551 引物对：
[0024] F:AGTCATTGTCAGGCATTGGT，
[0025] RiATATGACCTTGGGCAACAAA ；
[0026] D3S2422 引物对：
[0027] F:ACTGAGAAAGTCTTTCTGTGCC,
[0028] R:GTTCACCATCTACAGTGGGC ;
[0029] D3S3051 引物对：
[0030] F:GGCAATTAGTTATGTAGCAATCG，
[0031] R:TGAGTCAATTGTGCTGGCTA ;
[0032] D3S3053 引物对：
[0033] F:TCTTTGCTCTCATGAATAGATCAGT,
[0034] R: GTTTGTGATAATGAACCCACTCAG ;D4S2364 引物对：
[0035] F:AACAAAACTAGGAGATCATGTGG，
[0036] RiACCTTGACTTTGATGTGGGA ；
[0037] D4S2404 引物对：
[0038] F:ATATATATGATGCATGTCAAAATGG，
[0039] R:CTGGGCAAACTCATTTCAAC ;
[0040] ACOOlM8A 引物对：
[0041] F:CAACCATCAGTGATTTGATGGTTTA，
[0042] RiCTGTTCTTCTTAATCCTTAACCAGT ；
[0043] AC001348B 引物对：
[0044] F:TCTCAGTCCTGATTTCTTGATTTTG，
[0045] R:CCAGAGCTAACACCACATTCA ;
[0046] D17S975 引物对：
[0047] F:AGTAATGGGACTTCTCGGCT，
[0048] RiTAGGATCCCAAGTGTGCAGT ；
[0049] D17S1294 引物对：
[0050] F:TGGCATGCAATTGTAGTCTC，
[0051] R:TTCTTTCCTTACTAAGTTGAGAACG ;
[0052] 在上述AS-STR基因座荧光标记复合扩增体系中，所述15个AS-STR基因 座组建 7 个连锁群，分别是：I :D3S2402-D3S2452-D3S1766 ; II :D3S4554-D3S2388 ; III ：D3S4551-D3S2422 ； IV ：D3S305 1-D3S3053 ； V ：D4S2364-D4S2404 ； VI ： AC001348A-AC001348B;VE :D17S975-D17S1294。
[0053] 上述AS-STR基因座荧光标记复合扩增体系在制备认定亲缘关系检案试剂中的应 用。
[0054] 上述AS-STR基因座荧光标记复合扩增体系在制备对常染色体相关性遗传病进行 产前诊断的检测试剂中的应用。
[0055] -种试剂盒，包括上述的AS-STR基因座荧光标记复合扩增体系中的扩增引物对 的混合物。
[0056] -、本发明复合扩增体系中15个基因座的选择
[0057] (1)紧密连锁：
[0058] 从基因组中筛选位于同一染色体上紧密连锁STR基因座，紧密连锁STR组成的连 锁对或连锁组（linkage group)按单体型稳定遗传，每个连锁组内的STR基因座遗传距离 <3cM。根据文献（Inturri S，et al. Forensic Sci IntGenet. 2011 ;5:152-4)的标准，遗 传距离< 3cM可以认为呈紧密连锁。不同STR连锁组位于不同的染色体上，或者多个连锁 组虽在同一染色体上但相距很远，可以自由重组，应用多个连锁组的STR基因座构建复合 扩增体系。应用这些体系检测样本进行亲缘推断时，既考虑联合应用连锁基因座（一个连 锁组可看作是一个基因座）来提高遗传标记的多态性；又考虑连锁STR组与组之间的自由 重组，使组与组之间能够应乘积规则（product rule)进行法医遗传学的统计。
[0059] 本发明的15个基因座分布于3号、4号和17号染色体上紧密连锁的， 15 个 AS-STR 基因座可以组建7 个连锁群（I :D3S2402-D3S2452-D3S1766 ; II : D3S4554-D3S2388 ； III：D3S4551-D3S2422 ； IV ：D3S3051-D3S3053 ； V ： D4S2364-D4S2404 ； VI :AC001348A-AC001348B ;W :D17S975-D17S1294)。紧密连锁的基因座构成单倍型，在亲 缘鉴定中有利于分析亲代与子代之间的遗传关系。
[0060] (2)易于扩增：
[0061] 除上述15个基因座外，实验初期发明人还选择了另外一些位于3号染色体上的 基因座，如D3S1764、D3S2435等连锁的基因座；4号染色体上的基因座D4S3334、D4S1644、 D4S2426、D4S2368、D4S2414等连锁的基因座。但单基因座扩增结果发现，这些基因座的 扩增存在着一些问题，有的扩增的产物量少，显带过浅，甚至有时很难得到扩增产物，如 D4S2368 ;有的很容易出现非特异带（如影子带），如D4S2414 ;而上述15个基因座易于扩增 稳定性好，结果清晰，非特异性带很少。
[0062] 因此最后选择了 D3S2402，D3S2452，D3S1766，D3S4554，D3S2388，D3S4551、 D3S2422、D3S3051,D3S30