专利名称：一种荧光定量pcr技术筛选低富集镉花生品种的方法
技术领域：
本发明是涉及一种筛选低富集镉花生品种的方法，具体是涉及一种荧光定量PCR 技术筛选低富集镉花生品种的方法。
背景技术：
花生是世界四大油料作物之一，也是我国单产、总产最高的油料作物和经济作物， 种植面积超过500万公顷，其产量占油料作物总产量的1/2，占世界花生总产量的45%，已 达1450万吨以上。多年来，花生一直是我国出口创汇额最高的油料作物。目前，我国花生生 产面临的主要挑战是黄曲霉毒素污染、农药残留(主要是丁酰肼污染)和籽粒镉(Cd)含量 偏高等问题。Cd以其高毒性、高生物迁移性而备受关注。据2003年我国北方产区花生普查 结果显示，花生Cd含量平均为0. 2 0. 3mg/kg，其中山东产区花生Cd含量一般在0. 2mg/ kg以下，而山东以北地区花生Cd含量多在0. 2mg/kg以上。在广西进行市场抽检发现，花 生籽粒Cd含量范围为0. 07 0. 79mg/kg，平均0. 21mg/kg。市场上的花生Cd含量水平基 本符合国家新近颁布的0. 5mg/kg限量标准(GB2762-2005)，但多数超过国家无公害食品Cd 含量要求(Cd《0. 05mg/kg)，半数以上高于WAO/WHO规定的限量标准(Cd《0. lmg/kg)，甚 至达不到《国际卫生法典》规定的0. 2mg/kg的花生Cd限量标准，已威胁到食品安全和人体 健康，控制和降低花生籽仁镉污染亟待解决。 针对当前花生田土壤以及籽仁中重金属镉污染的日益严重的现状，国内外开展了 大量有关花生镉低积累品种筛选和农艺栽培技术研究。土壤中能够被植物所吸收的镉(有 效态镉)是影响花生镉吸收与积累的重要因素。因此，通过农艺栽培技术措施降低花生田 土壤有效态镉含量来降低花生镉积累是有其理论基础的，比如施用石灰提高土壤的PH，降
低花生田土壤有效态镉含量，但该技术也存在极大弊端，在土壤ra提高的同时，土壤中有
效态铁、锌、锰、铜镍等金属矿质营养元素含量下降，影响花生生长和产量。花生镉积累存在 极显著的品种间差异是花生镉低积累品种筛选的本质和基础。然常规的筛选方法有通过盆 栽镉处理收获花生饱果，进行原子吸收测定籽仁镉含量和测定不同花生品种对镉胁迫生理 响应的差异来进行筛选，但品种繁多，生长周期长，操作繁琐，成本高，分析处理烦等问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种荧光定量PCR技术筛选低富集镉花生品种的方法，它利 用营养液培养花生幼苗，利用幼苗叶片AhMT2a基因序列，应用荧光定量PCR技术检测该基 因表达差异的方法进行镉敏感品种的筛选；检测方法简单，不需要设计探针，成本低，通用 性好，且能够进行融解曲线分析检测扩增反应的特异性。 为了解决背景技术所存在的问题，本发明是是采用以下技术方案1、利用营养液 培养花生幼苗花生种子先经75%乙醇处理1分钟，再用0. 1%的氯化汞进行消毒处理15 分钟，最后用去离子水反复冲洗3-4遍备用。恒温箱25t:浸种12h，将吸胀后的种子，摆放于 小的塑料盆中的尼龙网上，每盆20粒，用含CcT(CdCl2 2.51120溶液)的Hongland营养液在25t:室温无菌培养室下培养，每天光照14小时。试验采用完全随机排列，对照用无CcT 的Hongland营养液培养。每两天换一次营养液。花生营养液培养6天后，幼苗长出第一真 叶，随机取不同镉处理水平幼苗，提取RNA，重复3次，反转录为cDNA，以其为模板进行罗氏 荧光定量PCR分析。 2、设计特定的不同镉处理水平对照、低镉处理水平10iiM和高镉处理水平 200iiM。 3、花生AhMT2a基因表达差异检测与分析方法依据荧光定量PCR引物设计原则对
基因进行引物设计，以恒定表达基因Actin作为内参基因对同一样品cDNA模板利用Roche
荧光定量PCR仪进行定量分析。引物设计如下AhMT2a-F:5' -GAAGGTGCTGAAATGGGTGT—3'AhMT2a-R:5' -CAATTGGATTTGCCTGAGGT-3，Actin-F:5' -GTCCATCAGGCAACTCGTAGC-3'Actin-R:5' -GCCCTCGACTATGAGCAAGAG-3， Roche荧光定量PCR仪染料法检测程序如下 第一步预变性95t:变性2分钟； 第二步荧光收集95°C 15秒_58°C 15秒_72°C 20秒本步结束时进行荧光信号收 集40个循环； 第三步融解曲线分析65°C 30秒逐步升至95t:，每隔0. 2。C收集一次荧光。
结果分析利用罗氏定量PCR仪自带的lightcycler4.05版软件进行分析。
4、筛选依据1、花生籽仁中镉的容纳能力与AhMT2a基因的表达量相关；不同条件 下，表达量的高低是筛选镉低积累品种的主要依据。2、镉低积累花生在对照(无镉离子处 理)下，该基因与内参基因actin的表达差异不显著，而镉高积累花生则表达差异大。3、镉 低积累花生在低镉处理水平(10i!M)下，该基因表达量与对照比小量增加，但增加不显著， 而镉高积累花生该基因表达量与对照比则极显著增加。4、镉低积累花生在高镉处理水平 (200iiM)下，该基因表达量与对照比小幅降低，但不显著；而镉高积累花生该基因表达量 与对照比则极显著增加。 本发明具有以下有益效果利用营养液培养花生幼苗，大大縮短生长周期；利用 幼苗叶片AhMT2a基因序列，应用荧光定量PCR技术检测该基因表达差异的方法进行镉敏感 品种的筛选，检测方法简单，不需要设计探针，成本低，通用性好，且能够进行融解曲线分析 检测扩增反应的特异性。
图1是本发明不同处理水平目的基因与内参基因的相对表达量的示意图；
图2是本发明不同镉处理水平与对照目的基因的相对表达量的示意图。
具体实施例方式
本具体实施方式
采用以下技术方案花生品种镉高积累品种XA004和镉低积累 品种XD011。 试验材料处理花生种子先经75%乙醇处理1分钟，再用0. 1 %的氯化汞进行消毒处理15分钟，最后用去离子水反复冲洗3-4遍备用。恒温箱25t:浸种12h，将吸胀后的种
子，摆放于小的塑料盆中的尼龙网上，每盆20粒，分别用含CcT(CdCl2 2. 51120溶液)低镉
处理水平10和高镉处理水平200 ii M的Hongland营养液在25。C室温无菌培养室下培养，每
天光照14小时。试验采用完全随机排列，对照用无CcT的Hongland营养液培养。每两天
换一次营养液。花生营养液培养6天后，幼苗长出第一真叶，随机取不同镉处理水平幼苗，
提取RNA，重复3次，反转录为cDNA，以其为模板进行罗氏荧光定量PCR分析。 花生AhMT2a基因表达差异检测过程依据荧光定量PCR引物设计原则对基因进行
引物设计，以恒定表达基因Actin作为内参基因对同一样品cDNA模板利用Roche荧光定量
PCR仪进行定量分析。引物设计如下AhMT2a-F:5' -GAAGGTGCTGAAATGGGTGT-3'AhMT2a-R:5' -CAATTGGATTTGCCTGAGGT-3，Actin-F:5' -GTCCATCAGGCAACTCGTAGC-3'Actin-R:5' -GCCCTCGACTATGAGCAAGAG-3， Roche荧光定量PCR仪染料法检测程序如下 第一步预变性95t:变性2分钟； 第二步荧光收集95°C 15秒_58°C 15秒_72°C 20秒本步结束时进行荧光信号收 集40个循环； 第三步融解曲线分析65°C 30秒逐步升至95t:，每隔0. 2。C收集一次荧光。
结果分析利用罗氏定量PCR仪自带的lightcycler4. 05版软件进行分析。
实验结果与分析由图1可知，镉低积累花生XD011在对照(无镉离子处理)下， 目的基因与内参基因actin的相对表达量为1. 07，而镉高积累花生XA004则高达27. 85，极 显著大于XD011(P < 0. 01);而且不同镉处理水平下，镉高积累花生XA004相对表达量均极 显著大于XD011(P < 0. 01)。 由图2可知，镉低积累花生XD011在低镉处理水平(10iiM)下，目的基因表达量与 对照比小量增加，而镉高积累花生XA004该基因表达量与对照比则增加2倍多，增量极显著 的大于镉低积累花生XD011 (P < 0. 01);当镉处理水平达到200 ii M，镉低积累花生XD011目 的基因表达量与对照比小幅降低，但不显著；而镉高积累花生XA004表达量与对照比则极 显著增加。
权利要求
一种荧光定量PCR技术筛选低富集镉花生品种的方法，其特征是由1、利用营养液培养花生幼苗、2、设计特定的不同镉处理水平、3、花生AhMT2a基因表达差异检测与分析方法、4、筛选依据四个步骤实现的。
2. 根据权利要求1所述的一种荧光定量PCR技术筛选低富集镉花生品种的方法， 其特征在于所述的利用营养液培养花生幼苗是将花生种子先经75%乙醇处理1分钟， 再用0. 1 %的氯化汞进行消毒处理15分钟，最后用去离子水反复冲洗3-4遍备用；恒温 箱25t:浸种12h，将吸胀后的种子，摆放于小的塑料盆中的尼龙网上，每盆20粒，用含 Cd2+(CdCl2 2. 5H20溶液)的Hongland营养液在25。C室温无菌培养室下培养，每天光照14 小时；试验采用完全随机排列，对照用无Cd2+的Hongland营养液培养；每两天换一次营养 液，花生营养液培养6天后，幼苗长出第一真叶，随机取不同镉处理水平幼苗，提取RNA，重 复3次，反转录为cDNA，以其为模板进行罗氏荧光定量PCR分析。
3. 根据权利要求1所述的一种荧光定量PCR技术筛选低富集镉花生品种的方法，其 特征在于所述的设计特定的不同镉处理水平是对照、低镉处理水平10iiM和高镉处理水平 200iiM。
4. 根据权利要求1所述的一种荧光定量PCR技术筛选低富集镉花生品种的方法，其特 征在于所述的花生AhMT2a基因表达差异检测与分析方法是依据荧光定量PCR引物设计原 则对基因进行引物设计，以恒定表达基因Actin作为内参基因对同一样品cDNA模板利用 Roche荧光定量PCR仪进行定量分析；引物设计如下AhMT2a-F :5' -GAAGGTGCTGAAATGGGTGT-3' AhMT2a-R :5' -CAATTGGATTTGCCTGAGGT-3' Actin-F :5' -GTCCATCAGGCAACTCGTAGC-3' Actin-R :5' -GCCCTCGACTATGAGCAAGAG-3， Roche荧光定量PCR仪染料法检测程序如下 第一步预变性95t:变性2分钟；第二步荧光收集95°C 15秒-58°C 15秒_72°C 20秒本步结束时进行荧光信号收集40 个循环；第三步融解曲线分析65°C 30秒逐步升至95t:，每隔0. 2t:收集一次荧光； 结果分析利用罗氏定量PCR仪自带的lightcycler4. 05版软件进行分析。
5. 根据权利要求1所述的一种荧光定量PCR技术筛选低富集镉花生品种的方法，其特 征在于所述的筛选依据是1、花生籽仁中镉的容纳能力与AhMT2a基因的表达量相关；不同 条件下，表达量的高低是筛选镉低积累品种的主要依据；2、镉低积累花生在对照(无镉离 子处理)下，该基因与内参基因actin的表达差异不显著，而镉高积累花生则表达差异大； 3、镉低积累花生在低镉处理水平(10i!M)下，该基因表达量与对照比小量增加，但增加不 显著，而镉高积累花生该基因表达量与对照比则极显著增加；4、镉低积累花生在高镉处理 水平(200iiM)下，该基因表达量与对照比小幅降低，但不显著；而镉高积累花生该基因表 达量与对照比则极显著增加。
全文摘要
一种荧光定量PCR技术筛选低富集镉花生品种的方法，它涉及一种筛选低富集镉花生品种的方法。1、利用营养液培养花生幼苗；2、设计特定的不同镉处理水平；3、花生AhMT2a基因表达差异检测与分析方法；4、筛选依据利用营养液培养花生幼苗，利用幼苗叶片AhMT2a基因序列，应用荧光定量PCR技术检测该基因表达差异的方法进行镉敏感品种的筛选；检测方法简单，不需要设计探针，成本低，通用性好，且能够进行融解曲线分析检测扩增反应的特异性。
文档编号G01N21/64GK101724697SQ20091022372
公开日2010年6月9日 申请日期2009年11月18日 优先权日2009年11月18日
发明者万书波, 单世华, 张廷婷, 李春娟, 杨志艺, 王才斌, 闫彩霞 申请人:山东省花生研究所