一种荧光检测装置的制造方法
【专利摘要】本实用新型提供了一种荧光检测装置，包括样本抽取机构、磁微球汇集机构和荧光检测机构；所述的样本抽取机构包括吸液针头、石英管和吸液泵，所述吸液针头连接石英管，石英管连接吸液泵；所述的磁微球汇集机构为恒流源供电线圈缠绕的电磁铁，所述电磁铁的一端朝向石英管；所述的时间分辨荧光检测机构包括激发光光源、光电转换器、激发光路和收集光路，所述激发光光源的光线通过激发光路聚焦在石英管上，且该汇集点与电磁铁朝向石英管的位置相同，所述的收集光路对应该汇集点的位置设置，所述的光电转换器对应收集光路。
【专利说明】
-种黄光检测装置
技术领域
[0001] 本实用新型属于生物医学检测技术领域，具体设及一种巧光检测装置。
【背景技术】
[0002] 巧光检测技术在医学和生物学中的应用已有近70年的历史，它与免疫检测技术相 接合形成巧光免疫技术，并随着免疫技术的发展和应用，成为微生物学、免疫学、病理学、免 疫组织化学和基因组化学中最常用、最有效的一种检测技术。
[0003] 随着临床医学和科技进步，巧光免疫技术又发展出多种实用检测技术，如电化学 巧光免疫分析(E化I)、化学发光免疫分析(CLIA)、时间分辨巧光免疫分析(TRFIA)等巧光免 疫分析技术。运些技术均是通过对标记物(示踪探针)检测来确定被检测物，标记物通过免 疫反应法、化学反应法、生化反应法、链霉亲和素和生物素等包被技术，制作成具有较高特 异性的探针，探针通过相应的反应与目标物质结合;检测仪器通过对示踪探针的检测，测定 出目标物质的浓度。另一方面包被技术也在发展，从传统的包被酶标板改为用磁微球作为 免疫反应的载体，通过控制磁场抓取磁微球，可大大提高包被物量，增加检测灵敏度，减少 反应时间，方便反应过程中的清洗，实验自动化操作，提高系统灵活性和工作效率，如目前 比较流行的化学发光免疫分析仪。
[0004] 目前，无论是使用磁微球作为免疫反应载体的设备，如：免疫巧光分析仪、化学发 光巧光分析仪;还是用96孔板作为免疫反应载体的装置，如：酶标仪或时间分辨免疫分析 仪，反应过程中需要进行若干次的样品池清洗，最后的巧光检测，均在反应池中进行，也就 是检测整个反应池巧光标记物含量。W上运种常规的巧光标记检测技术，都存在一个无法 克服的问题就是：由于反应过程经过了清洗步骤，无法保证每次试验时反应池中磁微球的 数量不发生变化。也就是说，在检测过程中，清洗次数不同或清洗误差会影响检测结果，具 有W下缺陷：
[0005] 1、未清洗干净时，很多杂质存在的瞬时巧光对巧光标记物巧光的特异性构成干 扰。
[0006] 2、检测磁微球W低浓度分布在样本溶液中，容易被样本溶液中的干扰物质影响， 导致检测误差。 【实用新型内容】
[0007] 为解决上述技术问题，本实用新型提供了一种时间分辨巧光检测装置及其检测方 法。将样品池中的磁微球分成等量的若干份，并对磁微球进行汇集后再完成巧光标记物检 测。
[000引本实用新型为了实现上述发明目的，采用如下技术方案：
[0009] -种时间分辨巧光检测装置，包括样本抽取机构、磁微球汇集机构和时间分辨巧 光检测机构;所述的样本抽取机构包括吸液针头、石英管和吸液累，所述吸液针头连接石英 管，石英管连接吸液累;所述的磁微球汇集机构为恒流源供电线圈缠绕的电磁铁，所述电磁 铁的一端朝向石英管;所述的时间分辨巧光检测机构包括激发光光源、光电转换器、激发光 路和收集光路，所述激发光光源的光线通过激发光路聚焦在石英管上，且该汇集点与电磁 铁朝向石英管的位置相同，所述的收集光路对应该汇集点的位置设置，所述的光电转换器 对应收集光路。
[0010] 本实用新型的检测装置通过电磁铁对磁微球的磁力作用，将磁微球聚集在石英管 的检测区域，使磁微球在局部区域的浓度提高了成千倍，巧光标记物的巧光强度则可提高 上万倍，而背景干扰巧光没有相应的提高，从而提高系统的抗干扰能力和灵敏度高。
[0011] 本实用新型所述石英管为中空透明管，其内径为O.l-lOmm。能够限制磁微球向外 延聚集，使有限的空间内磁微球分布均匀且数量稳定，并且确保在磁微球汇集点处，获得更 高的磁微球总数与液体容积的占比，运样可大大提高系统信噪比。
[0012] 优选地，所述石英管的内径和外径均为方形。
[0013] 本实用新型所述的吸液累为蠕动累或空气喷射累，对液体流动石英管产生压差， 促使液体从反应池中流过石英管，并且流速可控。
[0014] 本实用新型所述的激发光路和收集光路由聚集透镜和滤光片构成。
[0015] 本实用新型时间分辨巧光检测装置的检测方法：
[0016] 步骤如下：
[0017] 1)将吸液针头下端浸入反应池中待检测样本溶液，吸液累对液体产生压差，促使 反应池里的液体在石英管中流动;所述待检测样本溶液中含结合了被检测物和巧光标记物 的磁微球；
[0018] 2)打开恒流源，电磁铁产生磁场，将流过石英管液体中的磁微球驻留在电磁铁前 端，使磁微球在石英管内的汇集数量不断增加，形成汇集点；
[0019] 3)待磁微球汇集一段时间后，启动激发光光源，光线通过激发光路聚焦在石英管 内汇集点的磁微球上，第一收集光路收集磁微球结合的巧光标记物的巧光信号，并通过第 一光电转换器转换为电信号，进行巧光标记物含量检测，关闭恒流源；
[0020] 重复上述步骤0-3)，分批次获得抽取液体中汇集磁微球的检测结果，并进行统 计，完成对整个反应池中巧光标记物的含量检测。
[0021 ]本实用新型所述磁微球的粒径在0.1皿-20皿之间，作为巧光标记物的载体。
[0022] 巧光标记物为反应试验的示踪物质，包被有能与检测目标物相结合的物质，巧光 标记物具有在特定波长激发光照射下激发出长寿命巧光的特异性。
[0023] 本实用新型所述磁微球的检测目标物包括:免疫蛋白、激素、生物酶、药物、微量元 素、肿瘤标记物、基因、DNA和RNA、微生物及其代谢物等。
[0024] 本实用新型的有益效果在于：
[0025] 1.通过电磁铁将磁微球聚集在检测区域，使磁微球在检测区域的浓度提高了成千 倍，巧光标记物的巧光强度则可提高上万倍，而溶液中的杂质所产生的背景干扰信号不会 被增强，有效消减由于清洗不彻底对检测结果带来的干扰。
[0026] 2 .常规反应试验清洗的目的是减少杂质，提高巧光标记物与背景信号占比；本发 明的检测方法，通过提高磁微球密度，提高巧光标记物与背景信号占比，来提高实验精度， 特别适用于免清洗的反应体系检测巧光标记物含量。
【附图说明】
[0027] 图1是本实用新型巧光检测装置的结构示意图。
[0028] 图2是本实用新型巧光检测装置检测状态的结构示意图。
[0029] 图3是本实用新型装置在焦点处垂直液体流动方向的剖面图。
[0030] 附图标记：1、石英管，2、磁微球，3、激发光光源，5、光电转换器，6、电磁铁恒流源， 7、汇集点，8、电磁铁，9、激发光路，10、收集光路，12、反应池，13、吸液针头，14、吸液累。
【具体实施方式】
[0031] 下面结合【具体实施方式】对本实用新型的实质性内容作进一步详细的描述。
[0032] 实施例1
[0033] 如图1、图2和图3所示，一种巧光检测装置，包括样本抽取机构、磁微球汇集机构和 巧光检测机构;所述的样本抽取机构包括吸液针头13、石英管1和吸液累14,所述吸液针头 13连接石英管1，石英管1连接吸液累14;所述的磁微球汇集机构为恒流源6供电线圈缠绕的 电磁铁8,所述电磁铁8的一端朝向石英管1;所述的巧光检测机构包括激发光光源3、光电转 换器5、激发光路9和收集光路10,所述激发光光源3的光线通过激发光路9聚焦在石英管1 上，且该汇集点7与电磁铁朝向石英管的位置相同，所述的收集光路10对应该汇集点7的位 置设置，所述的光电转换器5对应收集光路10。
[0034] 实施例2
[0035] 本实施例在实施例1的基础上：
[0036] 所述石英管1为中空透明管，其内径为0.1mm。
[0037] 实施例3
[0038] 本实施例在实施例1的基础上：
[0039] 所述石英管1为中空透明管，其内径为10mm，其内径和外径均为方形。
[0040] 所述的吸液累为蠕动累。
[0041 ] 实施例4
[0042] 本实施例在实施例1的基础上：
[0043] 所述石英管1为中空透明管，其内径为1mm，其内径和外径均为方形。
[0044] 所述的吸液累为空气喷射累。
[0045] 所述的激发光路和收集光路由聚集透镜和滤光片构成。
[0046] 实施例5
[0047] 本实施例在实施例1的基础上：
[004引所述石英管1为中空透明管，其内径为2mm，其内径和外径均为方形。
[0049] 所述的吸液累为蠕动累。
[0050] 所述的激发光路和收集光路由聚集透镜和滤光片构成。
[0051 ]本实用新型所述巧光检测装置的检测方法：
[0化2] 步骤如下：
[0053] 1)将吸液针头下端浸入反应池中待检测样本溶液，吸液累对液体产生压差，促使 反应池里的液体在石英管中流动;所述待检测样本溶液中含结合了被检测物和巧光标记物 的磁微球；
[0054] 2)打开恒流源，电磁铁产生磁场，将流过石英管液体中的磁微球驻留在电磁铁前 端，使磁微球在石英管内的汇集数量不断增加，形成汇集点；
[0055] 3)待磁微球汇集一段时间后，启动激发光光源，光线通过激发光路聚焦在石英管 内汇集点的磁微球上，第一收集光路收集磁微球结合的巧光标记物的巧光信号，并通过第 一光电转换器转换为电信号，进行巧光标记物含量检测，关闭恒流源；
[0056] 重复上述步骤0-3)，分批次获得抽取液体中汇集磁微球的检测结果，并进行统 计，完成对整个反应池中巧光标记物的含量检测。
[0化7] 实施例6
[0058] -种巧光检测装置，包括样本抽取机构、磁微球汇集机构和巧光检测机构，其中：
[0059] 样本抽取机构包括吸液针头13、石英管1、吸液累14;所述吸液针头13下端浸入反 应池12中待检测样本溶液液面W下，上端经过软管连接石英管1，石英管下端连接吸液累 14,吸液累14为蠕动累或空气喷射累，对液体流动管路产生压差，促使液体从反应池12中流 过石英管1，并且流速可控，吸液累14出口连接废液收集瓶，废液瓶和连接软管。
[0060] 磁微球汇集机构包括电磁铁8、恒流源6;所述电磁铁8设置在控制石英管1中部，打 开恒流源6后电磁铁8产生的磁力，将流过石英管1液体中的磁微球2驻留在电磁铁8前端，在 磁力恒定和液体流速恒定的情况下，磁微球2在石英管内的汇集数量不断增加，形成高密度 汇集点7。
[0061] 巧光检测机构包括激发光光源3和巧光检测装置;所述激发光光源3光线被光路9 聚焦在石英管1内汇集点7的磁微球2上，巧光标记物在激发光3照射下产生特异性的长寿命 巧光;巧光检测装置设置在石英管1侧面，收集光路10用于收集巧光标记物巧光，再通过光 电转换器5转换为电信号。
[0062] 所述石英管1为方形或圆形细长中空液流管路，内径为0.1到IOmm之间。
[0063] 基于上述装置的检测方法是:将反应池12中的液体经过针头13连续抽入石英管1， 石英管1中部设有电磁铁8,随着液体的连续流动，越来越多的磁微球2聚集在电磁铁8的前 端;磁微球2聚集到一定时间后数量基本稳定，关闭吸液累，启动光源3照射磁微球2设定时 间后关闭，经延迟设定时间后，启动光电转换器5,获得磁微球2所结合的巧光标记物的时间 分辨巧光强度电信号。
[0064] 通过分批次抽取液体、汇集磁微球2、检测巧光标记物的巧光，对2到1000次检测结 果进行统计，实现对整个反应池12中巧光标记物含量检测。
[0065] 通过W下实施例，对本实用新型巧光检测装置定量测定样品溶液中目标检测物含 量的方法进行详细的说明。
[0066] 实施例7
[0067] 双抗体夹屯、法定量检测TSH(促甲状腺激素）的检测
[0068] 1、把抗人T甜的0-亚单元单克隆抗体包被磁微球上
[0069] 将20mg粒径扣m、表面带簇基的磁微球(购自化ermo Scientific公司）用磁铁分离 上清液，然后把上清液移走，除去缓冲液中的叠氮钢3次，用0.1 MMES缓冲液(P册.8~7.2)悬 浮，稀释到5ml;在揽拌下加入5mg碳二亚胺(EDC)和5mg N-径基班巧酷亚胺横酸钢盐，揽拌 溶解，室溫反应25分钟;把活化后的磁微球用磁铁分离上清液，然后把上清液移走，除去多 余的抓C和N-径基班巧酷亚胺横酸钢盐。用50mM棚酸缓冲液(p册.2~9)清洗，之后用棚酸缓 冲液悬浮到3毫升。
[0070] 加入Img用50mM棚酸缓冲液(P册.2~9)透析过的抗人T甜的0-亚单元单克隆抗体， 揽拌均匀，室溫反应16到24小时；反应结束后用磁铁分离上清液，把上清液移走，加封闭液 (含有5g/L的BSA(牛血清白蛋白）、50mM P册.5的化is(S径甲基氨基甲烧醋酸盐)缓冲液封 闭8小时左右，用磁铁分离上清液，把上清液移走，然后用稀释液(含有5g/L的BSA、5g/L的 PVP(聚乙締化咯烧酬）、0.2%叠氮钢的抑8.0的化is缓冲液50mM)溶解沉淀，制成标识微球试 剂。4°C冷藏保存。
[0071] 2、把在抗人-T甜的a-亚单元单克隆抗体标记在巧光标记物上
[0072] 首先把Img抗人-T細的a-亚单元单克隆抗体PH7.0的0.05M憐酸缓冲溶液，2~8°C 透析四次。取出加入〇.2mg的二硫苏糖醇(DTT)还原20分钟，再加入0.4mg的穴状化合物（时 间分辨巧光标记物），和0.0 Img的乙二胺四乙酸(邸TA)低溫反应24小时。
[0073] 用Sephadex G-50柱层析分离标记了穴状化合物的单抗和没在标记的单抗，用蛋 白仪区分不同分子量的蛋白，同时检定标记到单抗的穴状化合物的比例，制备得到巧光标 记试剂，4°C冷藏保存。该试剂分辨巧光标记物能在340nm波长光源的激发下，发出610nm巧 光，并且寿命为2msW上。
[0074] 3、免疫反应样品制备
[0075] 取TSH浓度为0.09IU/ml的标准样品3份各SOiil，分别加入3个塑料管式样品反应池 12中，并标记物A、B和C。
[0076] 向上述3个样品池中分别加入取步骤1制备的磁微球试剂20iU (固含量为万分之 二），利用电磁场振荡，样品中的TSH抗原与磁微球的包被抗人T甜的0-亚单元单克隆抗体免 疫反应，并附着在磁微球表面，样品溶液中的抗原越多，则在标识微球表面聚集得越多。反 应30分钟后，利用磁场进行分离，移去上清液多余的样本，再加入20化1清洗液，磁场分散， 再利用磁场进行分离，反复清洗5次，最后加入稀释液。
[0077] 按上述步骤分别对样品池B和C进行重复清洗6次、7次。
[007引向上述3个样品池中分别加入步骤2制备的标记物试剂50iil，巧光标记物会通过标 记的抗人-T甜的a-亚单元单克隆抗体与附着在磁微球上的TSH抗原结合，形成磁微球-目标 物-标记物的复合物，约30分钟后，利用磁场进行分离，移去上清液多余的巧光标记物，再加 入20化1清洗液，磁场分散，再利用磁场进行分离，反复清洗5次，最后一次加入稀释液。
[0079] 按上述步骤分别对样品池B和C进行重复清洗6次、7次。
[0080] 理论上清洗次数越多溶液中的杂质越少，背景干扰越低，但导致磁微球数量丢失 的可能性越大。
[0081] 4、巧光检测
[0082] 用本实用新型装置对样品进行检测，装置中激发光光源3为340nm光电二极管，其 供电电流为80mA，从上方照射，并将焦距对准反应池12中屯、，时间分辨巧光光路10的滤光片 为610nm光窄带通过，光电转换器5为滨松公司光电倍增管R4220P，转换的电信号经过发大 和滤波后，并进入模数转换为数字信号。
[0083] 首先取上述A样品反应池，加入巧光增强液后，将吸液针头13下端浸入反应池12中 液面W下，开启吸液累14,使液体流动管路产生压差，促使液体从反应池12中样品液体不断 流过石英管I，并且流速稳定可控，吸液累14出口连接废液收集瓶，废液瓶和连接软管，未在 视图中画出；
[0084] 如图2，打开恒流源6，使电磁铁8受电产生磁力，石英管1内流动的液体中的磁微球 2在电磁铁如兹力作用下，渐渐汇集在石英管1内壁，越积越多并形成汇集点7,经过设定的35 秒后，汇集点7聚集的磁微球2达到稳定的数量，关闭吸液累14;同时，开启汇集点7上方激发 光源3,经过50微秒时间的照射后关闭，汇集点7的磁微球2所结合的巧光标记物，在390nm光 照射下被激发出610nm波长的巧光，经汇集点7侦晒的时间分辨巧光收集光路10和光电转换 器5,巧光信号被转换为电信号;激发光源3关闭200微秒延时时间后，检测并记录时间分辨 巧光信号。
[0085] 完成一次检测后，关闭电磁铁8，磁微球随液体流走，然后再次开启，重复30次上述 汇集磁微球2，检测记录巧光强度过程，最后进行统计获得平均光强值，完成对样本A中的目 标物的检测。
[0086] 清洗吸液针头13和液路管道内壁，防止交叉污染。按上述同样方法依次对样品B和 C进行检测，得到检测结果如下。
[0087] 表1 T甜定量微球检测巧光结果
[008引
[0089] 5、使用常规检测仪的检测结果
[0090] 进行上述1-3步操作，最后把反应物移入酶标板内，对整个反应池检测巧光，使用 苏州新波的Anytest2000检测仪，检测A、B和C反应池的巧光信号，结果如下：
[0091] 表2 TSH反应池检测巧光结果
[0092]
[0093] 本实施例的实验数据说明，相比T甜反应池巧光检测的常规方法，通过采用定量微 球的检测方法不仅减少了清洗过程中磁微球丢失所引入误差，而且减少了由于清洗不彻底 引入的背景干扰，更适合应用于全自动、快速、高灵敏度、高精度和高通量检测。
【主权项】
1. 一种荧光检测装置，其特征在于:包括样本抽取机构、磁微球汇集机构和荧光检测机 构;所述的样本抽取机构包括吸液针头、石英管和吸液栗，所述吸液针头连接石英管，石英 管连接吸液栗;所述的磁微球汇集机构为恒流源供电线圈缠绕的电磁铁，所述电磁铁的一 端朝向石英管;所述的荧光检测机构包括激发光光源、光电转换器、激发光路和收集光路， 所述激发光光源的光线通过激发光路聚焦在石英管上，且该汇集点与电磁铁朝向石英管的 位置相同，所述的收集光路对应该汇集点的位置设置，所述的光电转换器对应收集光路。2. 根据权利要求1所述的一种荧光检测装置，其特征在于:所述石英管为中空透明管， 其内径为〇.l-l〇mm。3. 根据权利要求2所述的一种荧光检测装置，其特征在于:所述石英管的内径和外径均 为方形。4. 根据权利要求1所述的一种荧光检测装置，其特征在于:所述的吸液栗为蠕动栗或空 气喷射栗。5. 根据权利要求1所述的一种荧光检测装置，其特征在于:所述的激发光路和收集光路 由聚集透镜和滤光片构成。
【文档编号】G01N21/76GK205720248SQ201620520478
【公开日】2016年11月23日
【申请日】2016年6月1日
【发明人】吴俊清, 章健, 吴冠英
【申请人】章健, 吴俊清, 吴冠英