一种集提取、扩增和检测一体化的基因检测装置的制造方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学及医学的普通领域，尤其涉及在一便携式装置中提取核酸，扩增特异的靶核酸并检测扩增核酸序列的方法的领域。
【背景技术】
[0002]由于对传染病和新出现疾病、生物威胁试剂、遗传病和致病因子的环境储库的公共健康影响和认识已经增加了，因此，对于更加信息化、灵敏和特异性的使用快速测定的需求已使得对检测样本工具的要求增加。目前，通过传统的核酸提取方法提取核酸，通过PCR的扩增的方法进行的分子检测是非常灵敏的、特异性的和信息化的。不幸的是，目前可用的提取核酸和核酸检测方法不适合在取样现场使用或在取样现场使用的实用性有限，原因在于其需要精巧的、笨重且昂贵的仪器、专业的实验室材料和/或依赖于使用者干预的多个操作。因此，大部分用于分子检测的样品被装运到集中式实验室，这导致获得所需要的信息需要长的周转时间。
[0003]尽管目前研究开发了一些涉及检测扩增的靶序列自动化系统，但目前的技术包括三个步骤。
[0004]第一步，核酸提取:
[0005]1869年，瑞士医师Friedrich Miescher首例成功的进行了核酸提取。起初，他关注于组成白细胞各种蛋白质，并指出蛋白质是细胞质的主要成分。但在随后的测试试验中发现，当加入酸性溶液时溶液中生成一种沉淀物，再加入碱性溶液时沉淀继而溶解消失。Miescher首例提取出粗糙的DNA，Miescher成功从细胞中提取出DNA后，一些研究者纷纷效仿，并在材料、试剂的应用上进行了不断的探索，由此发展了许多核酸的生物分子提取技术。现如今，从硫氰酸胍盐-苯酚-氯仿提取法到柱纯化技术，已被广泛地用于DNA和RNA的提取。提取方法主要包括以下几种:
[0006]1.胍盐裂解法
[0007]胍盐是蛋白强变性剂，核酸提取一般采用高浓度的胍盐来裂解细胞，促使核蛋白体解离，同时高浓度的胍盐能使细胞内核酸酶失活，使释放出的核酸不被降解。1977年，Ulrich等首次使用异硫氰酸胍从总RNA中分离纯化出mRNA。该方法特点是利用多数真核细胞中mRNA的3’端有polyA尾巴，使用oligo(dT)—纤维素亲和层析法，从总RNA中分离纯化出mRNA，但此方法费时费力。在Ulrich研究的基础上，1979年Chirgwin等[4]发明了一种破裂细胞膜但不破坏核苷酸的方法，即先将组织在异硫氰酸胍和巯基乙醇中混合均匀，然后通过乙醇抽提或氯化铯梯度超速离心来分离纯化细胞中的RNA。该技术是首次能特异性分离RNA的方法，但还是存在诸多缺点，比如耗时长、效率低，并且由于采用苯酚等毒性有机溶剂，操作有一定的风险性。到目前为止，虽然在此基础上发展出了很多核酸提取技术，但均没有克服耗时长、危险性大等诸多弊端。
[0008]2.CTAB 裂解法
[0009]1980年，Murray和Thompson发明了一种方法:使用溴化十六烧基三甲基钱(CTAB)法可快速提取高纯度的大分子量植物DNA。经液氮研磨样品后，用适当体积的CTAB缓冲液重溶样品。CTAB是一种非离子型去垢剂，它能使核酸和酸性的多糖从低离子强度的溶液中沉淀出来。同时，蛋白质和中性多糖等杂质留在溶液中。CTAB裂解法对产生大量多糖的生物体的核酸提纯非常有用的，如植物和某些革兰氏阴性菌，但这种方法的缺点是:实验步骤多，操作较繁琐。
[0010]3.酸抽提法
[0011]苯酚作为蛋白变性剂，能使蛋白质快速变性，因此，可用来提取基因组DNA:先用EDTA和SDS为主的裂解缓冲液裂解细胞，再经蛋白酶K处理后，然后用pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA，重复抽提至一定纯度后，根据不同需要进行透析或沉淀处理，获得所需的核酸DNA。此法的优点是提取的DNA保持天然状态，且纯度高，可满足临床各种检测所需;缺点是操作繁琐，比较费时，而且使用毒性有机溶剂苯酚对试验人员有一定的危害。
[0012]由上所述，现有技术提取核酸存在实验步骤多、操作较繁琐、危险性大等缺点。
[0013]第二步，靶核酸扩增:
[0014]核酸研究已有100多年的历史，20世纪60年代末、70年代初，人们致力于研究基因的体外分离技术，1983年美国科学家Kary Mul 1 is驱车在蜿蜒的州际高速公路上行驶，孕育出了PCR的雏形。经过两年的努力，在实验上证实了PCR的构想，并于1985年申请了有关PCR的第一个专利，在science杂志上发表了第一篇PCR学术论文。从此PCR技术得到了生命科学界的普遍认同。Kary Mullis也因此获得了诺贝尔化学奖。
[0015]PCR技术本身非常简单，且能最大限度地满足生物学家操作DNA的不同要求。PCR技术又以惊人的速度发展，并渗透到各生物学分支科学和临床各科的速度也令其它生物技术望而生叹。PCR在分子生物学、医学研究、生命科学、生物工程、遗传工程、疾病诊断、法医学、考古学等许多科学领域中都具有重要的实际应用价值，并对已建立的基因克隆、DNA序列分析等现代分子生物学技术的发展起到巨大的推动作用。PCR能提供基因物质的十分可信的精确分析，比任何现有技术敏感1万到100万倍。有人预测，21世纪为生物世纪，那么PCR便是生物世纪最重要的技术。
[0016]在DNA扩增方面，PCR—直是应用最广泛的方法。实时荧光定量PCR检测有较高的灵敏度与特异性，并且易于操作。如TaqMan就是采用这种技术，两端分别标记有荧光与淬灭基团的寡核苷酸探针结合到PCR产物上后，其淬灭基团被具有5,-3'外切酶活性的Taq DNA聚合酶切掉，从而产生荧光，通过对荧光的实时动态检测可对PCR产物进生定性和定量。其缺点是，需要昂贵的检测荧光的仪器，对操作人员的要求较高。
[0017]第三步，靶核酸检测:
[0018]PCR产物一般为1013拷贝/ml，取0.1ml即为109拷贝，而lmg人基因组DNA才含1.4 X106拷贝的单拷贝基因片段，因此使得PCR扩增反应具有强大的扩增能力，提高了检测的敏感性。PCR反应具有强大的扩增效率，也正是其易污染的原因，极微量的污染便可导致假阳性结果。因此，PCR检测微量感染因子时，一定要注意产物残留污染的问题，对临床实验室尤应如此。所以如何消除PCR假阳性结果则成了科研工作者们要解决的一大难题。
[0019]在临床上检测扩增的核酸非常大的依赖于扩增产物的杂交和应用各种酶和发光试剂标记的探针的检测。这些技术要求多种试剂，若干洗涤步骤及检测靶核酸的特殊装置。另外，这些技术劳动强度大并要求具有分子生物学专门知识的技术人员。
[0020]核酸检测自动化方案不需要专门训练的人员，但设备非常昂贵且由于许多样本将由同一个设备加工因而仍可能存在污染。综上所述，由于现有技术的检测方法需要大型仪器以及扩增产物容易造成污染的缺陷，使得提取核酸进行扩增的诊断受到了很大的限制。
[0021]因此，如何克服上述缺陷成为本领域需要解决的问题。
【发明内容】
[0022]本发明目的是克服现有技术不方便携带仪器，且需对样品依次分步的进行提取、扩增、检测，步骤繁琐且不能直接观察检测结果的缺陷，提供一种对靶核酸进行快速提取、扩增及检测一体化的便携式装置。
[0023]本发明是一种便携式装置，其在一个装置内综合了核酸提取，特异的靶核酸扩增及检测，使得核酸检测能迅速而准确的进行。本装置可用于所有核酸及其衍生物。本发明可用于鉴别相应于某些疾病的特异性核酸序列，并检测传染性疾病的治疗疗效，但不限于这些用途。
[0024]在本发明中，此便携式装置包括两个位于相邻位置的长圆筒，两个圆筒通过可压缩的弹性物质密封相连且能相对上下压缩。样本导入第一个圆筒进行裂解消化，裂解消化后得到的混合物经过过滤系统过滤，过