多重扩增循环检测的制作方法
【专利说明】多重扩增循环检测
[0001] 政府利益 本发明在国立卫生研宄院授予的批准号1U01AI082184下由政府支持完成。政府对本 发明具有一定的权利。
[0002] 相关申请的交叉引用 本申请要求2012年9月10日提交的标题为"多重扩增循环检测"的美国临时专利申 请号61/699, 103的权益和优先权，其整体通过引用结合到本文中。
[0003] 发明背景 在美国、加拿大和西欧，传染病占人类死亡率的约7%，而在发展中地区，传染病占人类 死亡率的超过40%。传染病导致多种临床表现。常见的明显表现为发烧、肺炎、脑膜炎、腹泻 和含血腹泻。尽管身体表现提示一些病原体为病原并排除其它，仍剩余多种可能的病原体， 清楚的诊断常常需要进行多个测定。用于诊断病原体的传统微生物学技术可耗费数日或数 周，常常延误适当的疗程。
[0004] 近年来，聚合酶链反应（PCR)已经成为快速诊断传染原的方法选择。PCR可为诊断 传染病的快速、灵敏和特异工具。使用PCR作为主要诊断方法的挑战为可能致病微生物的 多样性和一些病理标本中所存在的生物的水平低。运行大量PCR测定板（针对每种可能的 致病微生物为一个，其中多数预期为阴性）常常是不实际的。当病原体核酸处于低浓度以 及需要大量样品以收集足够的反应模板时该问题恶化。在一些情况下，样品不足以测定所 有可能的病原。一种解决方案为运行"多重PCR"，其中样品在单个反应中同时测定多个靶 标。尽管已经证明多重PCR在一些系统中有价值，但关于高水平多重反应的健壮性和难以 清楚分析多个产物存在缺陷。为了解决这些问题，可随后将测定分为多个二级PCR。将二级 反应嵌套在初级产物内常常增加健壮性。然而，此进一步的操作可能很昂贵并且可导致污 染或其它问题。
[0005]FilmArray?(BioFireDiagnostics,Inc.，SaltLakeCity,UT)是为诊断市场 开发的用户友好的、高度多重PCR系统。该单个样品仪器接受整合样品制备和嵌套多重PCR 的诊断"袋"。整合的样品制备提供易用性，而高度多重PCR提供PCR灵敏性和同时检验多 达30种不同生物的能力。该系统非常适合其中数种不同的病原体均表现出相似临床症状 的病原体鉴定。当前可得的诊断板包括用于上呼吸道感染的呼吸板和用于血流感染的血液 培养板。其它板处于开发中。
[0006]FilmArray板，以及与其它仪器一起使用的板中所靶向的许多生物通常在环境中 存在。尽管这样的环境污染倾向于以显著低于临床相关样品的浓度存在，但可能难以区分 环境污染和临床感染。同样，某些个体具有通过染色体整合的潜伏病毒感染，其中染色体整 合的病毒DNA可能引起或可能不引起临床症状。具有用于测定阳性结果由临床相关感染还 是由另一种核酸源引起的方法将是合乎需要的。 发明摘要
[0007] 本公开内容涉及用于同时扩增若干靶标的方法，同时区分临床相关扩增和从其它 源例如从背景污染、扩增反应的交叉反应性或染色体整合的扩增。
[0008] 在本发明的一个方面，公开了用于鉴定样品中存在多个靶核酸中的哪些的方法和 装置。所公开的方法包括提供多个样品孔（每个样品孔拥有用于扩增来自多个靶核酸序列 中的不同序列的基因座的引物）、向多个样品孔中的每一个内提供部分样品、同时使多个样 品孔经受扩增条件经历若干扩增循环、检测第一组多个样品孔的每个中是否发生扩增、使 多个样品孔同时经受扩增条件经历若干额外扩增循环、检测第二组多个样品孔的每个中是 否发生扩增和通过鉴定其中发生扩增的相应孔鉴定样品中存在的靶核酸。
[0009] 在另一个说明性的实施方案中，提供了方法区分样品中染色体整合和临床-相关 感染，说明性地包括提供具有样品和用于从样品扩增靶核酸序列的引物的样品孔、使样品 孔经受扩增条件经历若干扩增循环、检测样品孔中是否发生扩增、使样品孔经受扩增条件 经历若干额外扩增循环和检测样品孔中是否发生扩增。在某些说明性实例中，第一个检测 步骤中的阳性判定可指示染色体整合，第一个检测步骤中的阴性判定与第二个检测步骤中 的阳性判定可指示临床-相关感染。
[0010] 在又一个说明性实施方案中，提供了用于分析样品中靶核酸的方法，包括 (a) 提供其中包含样品和用于扩增靶核酸的引物的样品孔， (b) 使样品孔经受扩增条件经历至少一个扩增循环， (c) 产生所扩增靶核酸的熔解曲线，和 (d) 重复步骤（b)和（c)。
[0011] 这些方法可进一步包括测定熔解曲线的值，和通过鉴定熔解曲线的值超过预定值 的扩增循环测定Cp。在说明性的实例中，该值可通过熔解曲线负导数的峰高或峰面积测定。
[0012] 在又一个实例中，提供了用于分析样品中靶核酸的方法，包括 (a) 提供包含样品、用于扩增靶核酸的引物、对照核酸、用于扩增对照核酸的引物和 dsDNA结合染料的样品孔， (b) 使样品孔经受扩增条件经历多个扩增循环， (c) 产生所扩增靶核酸和所扩增对照核酸的熔解曲线， (d) 测定所扩增靶核酸的值，和 (e) 重复步骤（b)、（c)和（d)。
[0013] 这样的说明性方法还可包括使用步骤（d)中测定的值产生靶核酸的校准扩增曲 线和绘制校准扩增曲线或测定两种核酸之间的相对浓度的步骤。
[0014] 本文中还提供反应容器和装置。本发明其它特征将会在考虑下列例示目前所认为 的实施本发明的最佳模式的优选实施方案的详述后对本领域技术人员显而易见。
[0015] 附图简述 图1显示本公开内容的一个实施方案中所使用的说明性的袋。
[0016] 图2A-B显示三个不同循环后鲍曼不动杆菌（A.baumannii)的扩增和恪解曲线。 图2A显示假阳性数据，图2B显示真阳性数据。
[0017] 图3A-B显示三个不同循环后热带念珠菌（C.tropicalis)的扩增和恪解曲线。图 3A显示阴性样品数据，图3B显示阳性样品数据。
[0018] 图4A-B显示三个不同循环后金黄色葡萄球菌（S.aureus)的扩增和恪解曲线。图 4A显示阴性样品数据，图4B显示阳性样品数据。
[0019] 图5显示用于检测低负载样品的说明性循环方案。
[0020] 图6显示说明性的扩增曲线和截止荧光阈值。
[0021] 图7显示典型的两步PCR方案期间可收集的说明性的温度数据。变性/退火段期 间，温度从基线值上升至最大值，随后温度降回基线。延伸段期间，温度保持恒定。
[0022] 图8显示图7的两步PCR方案期间可收集的荧光数据的说明性的连续监测。
[0023]图9显示两个典型两步PCR方案循环后可收集的荧光数据的说明性的连续监测。 变性段期间，由于饱和dsDNA-结合染料从dsDNA释放，荧光数据降低，与典型的熔解曲线相 似。延伸段期间，由于引物ssDNA片段引发并延伸为dsDNA片段，荧光数据上升。
[0024]图10显示若干个PCR循环变性段期间可收集的说明性的荧光数据的叠加。
[0025]图11显示若干个PCR循环变性段期间所收集的说明性的荧光数据的负一阶导数 的叠加。
[0026] 图12显示包含对照核酸和未知浓度靶核酸的多重PCR反应的典型扩增曲线。
[0027] 图13显示包含对照核酸和靶核酸的多重PCR反应的几个循环的变性段期间可收 集的荧光数据的说明性的负一阶导数的叠加。
[0028] 图14显示说明性的调整后的图13对照和样品核酸的实时PCR曲线。对通过在对 照窗口连续监测PCR反应所产生熔解曲线的负一阶导数进行积分，产生调整的对照核酸扩 增曲线（实线）。对通过在靶窗口连续监测PCR反应所产生熔解曲线的负一阶导数进行积 分，产生调整的靶核酸扩增曲线（虚线）。
[0029] 图15例示了依照本公开内容的方面的热循环系统的示例性实施方案的方框图。
[0030] 发明详述 如本文所使用的，术语"a"、"an"和"the"定义为指一个或多个，并且包括复数，除非上 下文不合适。范围在本文中可表述为从"约"一个特定值，和/或至"约"另一个特定值。术 语"约"在本文中用于指近似、在其区域内、大致或大约。当术语"约"与数字范围结合使用 时，其通过扩展所列数字值上面和下面的界限修饰该范围。一般而言，术语"约"在本文中 用于修饰数值在所述值上和下达5%的差异。当表述这样的范围时，另一个实施方案包括从 一个特定值和/或至其它特定值。相似地，当值通过使用先词"约"表述为近似值时，将理 解为该特定值形成另一个实施方案。将进一步理解的是，每个范围的端点相对于其它端点 均显著，并且独立于其它端点。
[0031] 如本文所使用的词语"或"意指特定列表中的任何一个成员，并且还包括该列表中 成员的任何组合。
[0032] "样品"意指如本文所述进行测定的动物；动物的组织或器官；细胞（受试者体内、 直接从受试者获取或维持培养的细胞或来自培养的细胞系的细胞）；细胞裂解物（或裂解 物级分）或细胞提取物；