专利名称：一种多靶同时检测分子扩增方法
技术领域：
本发明涉及一种采用公共引物进行多种靶核酸的PCR扩增方法，尤其是一种多靶 同时检测分子扩增方法。
背景技术：
改革开放以来，我们的国家在各个方面都有了飞跃的发展，这种飞速发展不仅展 现了人民生活的富足，同时也展现了民众对生活的品质和身体的健康有越来越高的追求。 正是这种追求，这种对更好生活的期待，为疾病诊断试剂工业带来了巨大的市场和商机。首 先，市场的巨大是因为我国的人口众多，这是不言而喻的。其次，也因为人们的经济能力和 观念发生了巨大的变化，通过疾病诊断试剂进行疾病的早期诊断，不仅能使治愈率大幅提 高，寿命延长，同时也为大众节约了金钱，减少了痛苦。因此高新诊断试剂的开发和产业化， 在提高广大人民群众的医疗健康水平方面，在提高国家生物医药产业技术创新能力和国际 竞争力上，都有非常重要的意义。同时也将在我国产业转型的特殊时期发挥重要作用。在诊断试剂工业内，目前最普遍采用的技术是免疫学技术，并有几十年的历史了。 因此，它的产品是成熟的。免疫技术产品的最大特点是操作简单，价格低廉。而它的最大缺 点是灵敏度和特异性不足，并由此而产生的假阴性问题，已成为诊断试剂工业的必需面对 的严肃问题，因为对一例传染病的漏检，不仅对病人本身造成危害，也对社会造成危害，甚 至危害更大。正因为如此，分子诊断类试剂近年来在临床应用方面发展迅速，特别是核酸扩增 技术(PCR)产品，在美国和欧洲已经获得广泛应用，成为当今增长最快速的一类体外诊断 试剂和公司获取利润的重要手段。PCR技术的最大优点就是它的极高的灵敏度和极高的特 异性，在这两个特点上，是免疫学技术不可相比的。核酸扩增技术应用的最广泛的是PCR技术，它可在数小时内将及微量的目的核酸 片段扩增至几百万倍。该技术自发明以来已广泛应用于生物和医学研究的各个领域。其原 理是双链DNA分子经高温变性后成为两条单链DNA，单链DNA (模板)在互补寡核苷酸 片段(弓丨物)的引导下，可以利用DNA聚合酶(Taq酶)按5’ _3’方向复制出互补DNA(PCR 产物)。PCR反应应用以上的基本过程，分别在待复制的已知序列(靶序列)DNA分子两端 各设计一条引物，其中在DNA 5’端的引物对应于正链DNA单链的序列，3’端的引物对应于 负链DNA单链的序列。在含有引物、Taq酶、DNA合成底物dNTPs (dATP、dCTP、dGTP、dTTP4 种脱氧核糖核苷酸等摩尔数混合物)的缓冲液中，通过高温变性，使双链DNA变成单链DNA 模板，降低温度复性，使引物与模板DNA配对，利用DNA聚合酶便可合成产物DNA。在同一反 应体系中可重复高温变性、低温复性和DNA合成这一循环，使产物DNA重复合成，并且在重 复过程中，前一循环的产物DNA可作为后一循环的模板DNA参与DNA的合成，使产物DNA的 量按2n方式扩增，所以这一反应称为聚合酶链式扩增反应。常用简易的PCR产物检测方法有核酸电泳、PCR-ELISA、实时荧光PCR等。核酸电泳、PCR-ELISA等由于操作烦琐，需要对PCR产物进行后处理，很容易造成PCR产物的污 染，导致PCR检测结果假阳性，严重制约PCR检测在临床上的应用。实时荧光PCR是近几年 发展起来的新技术，具有许多优点，其采用地闭管检测在临床诊断中的优势尤其明显，消除 了传统PCR等核酸检测技术的扩增产物污染问题。其原理是在PCR反应过程中利用荧光染 料在光刺激下释放的荧光能量的变化直接反映出PCR扩增产物量的变化，荧光信号变量与 扩增产物变量成正比，并通过足够灵敏的自动化仪器实现对荧光的采集和分析以达到对原 始模板的定量。荧光PCR的原理不同，一般采用荧光共振能量转移原理使荧光信号发生变 化。荧光PCR主要有以下几类SYBR Green、分子信标(Molecular Beacons)、TaqMan探针、 Scorpions 探针和Amplifluor 系统等。对于多靶核酸序列的检测，需要设计多对引物和 荧光探针，成本比较高。
发明内容
针对上述问题，本发明提出一种多重靶目标的PCR定量检测分析方法，突破了当 前PCR方法检测单一靶目标的局限，特别涉及到在同一反应中应用多对引物，多个内控，多 个不同的靶目标的创新，以达到同时定量检测多重目标的目地。宗旨是提供一种设计简单， 成本低的多靶同时检测分子扩增方法，可广泛用于多靶序列实时荧光PCR检测的公共引物 及其对多靶核酸序列的PCR扩增。多靶同时检测分子扩增方法包括以下几个步骤1)根据几个靶目标的DNA或RNA的序列，分别设计出用于扩增每一个靶目标的引 物；2)同时设计出适用于每一靶目标的内控；3)为每一个靶目标制备出一套标准物，一般为五个，例如2X107IU/ml，2X106IU/ ml，2X105IU/ml，2X104IU/ml，2X103IU/ml，此套标准物为定量分析用；4)确定复合型反应的最佳条件，制成Master Mix (混合试剂)；5)小规模生产测试，对各个靶目标，测定其灵敏度，特异性，稳定性和精确性；6)大规模生产。用于多靶序列PCR检测的公共引物为一对(两条)寡核苷酸片断，公共引物的碱 基序列及其数目不限，包括荧光标记型和非标记型两种。多靶同时检测分子扩增方法可广 泛应用于荧光标记型和非标记型两种类型的公共引物PCR检测。一般来说，荧光标记型公 共引物是由两条碱基互补配对寡核苷酸片断组成，其中一条核酸链标记荧光供体，另一条 核酸链标记荧光受体。荧光标记型公共引物两条链在稳定的双链结构时，荧光受体靠近荧 光分子，荧光分子的荧光被淬灭，此时公共引物不发荧光。当在酸、碱、热等变性条件下公共 引物两条链互相分开，荧光受体与荧光分子分开，荧光分子发出荧光。当恢复到温和条件 时，两条链复性为双链状态，荧光受体靠近荧光分子，荧光分子的荧光被淬灭。非标记型公 共引物的两条寡核苷酸片断不需要碱基互补配对。非标记型公共引物设计必须符合以下原则1)公共引物的碱基序列应选择与待扩增模板序列同源性最小的序列，引物的3’ 端与模板互补的碱基数不能超过3个；2)公共引物的碱基序列及其数目的设计应遵守引物 设计的常用规则，如碱基数目不能大于50个或小于10个，碱基(G+C)的含量不能太高，退 火温度不能太低或太高、引物内或引物间不能形成有利于产生引物二聚体的结构等。
荧光标记型公共引物设计在遵循非标记型设计的基础上还必须符合以下条件1)公共引物采用两条碱基互补配对的寡核苷酸片断，在公共引物的一条寡核苷酸 链上标记荧光供体，另一条寡核苷酸链上标记荧光受体。荧光供体和荧光受体间的距离应 小于120埃。2)公共引物两条链间的互补配对的碱基数应满足两条寡核酸链复性时荧光供 体与其受体能产生有实用价值的荧光淬灭效果。利用荧光标记型公共引物进行多靶序列PCR检测方法如下1)根据荧光标记型公共引物设计的规则设计公共引物。2)特异引物的设计特异 引物由与公共引物序列相同的公共引物部分和与待扩增靶序列互补的靶引物部分组成。靶 引物位于特异引物的3’端，采用常规PCR的引物设计方法，使碱基序列与所需要的靶序列 互补。公共引物部分位于特异引物部分的5’端，与靶引物连接，构成同一条寡核苷酸链，碱 基序列与公共引物相同。3)实时荧光PCR检测在常用的PCR反应混合体系(PCR缓冲液、 Taq酶、dNTP)中，加入荧光公共引物、特异引物、待测样品。进行复性、延伸、热变性三步热 循环反应，在第一个循环的热变性阶段，公共引物、特异引物及模板均发生变性，公共引物 中的荧光分子和其受体分离发出荧光。在复性阶段，由于这时的反应体系中没有与公共引 物序列同源的模板，公共引物两条链发生复性，荧光分子靠近其受体，不发出荧光。特异引 物中的靶引物分别和模板中对应的靶序列复性，Taq酶以它作为扩增引物进行PCR扩增，同 时公共引物序列信息被导入PCR产物。第二个PCR反应与第一个PCR反应的情况类似，公 共引物两条链的序列信息都被导入到同一条PCR产物中。在第三个循环的复性阶段，反应 体系中PCR产物两端已含公共引物同源序列，公共引物与PCR产物复性，Taq酶以公共引物 作为扩增引物进行PCR扩增，这时公共引物两条链被分离。荧光分子远离荧光受体，发出荧 光。在随后的反应中，通过检测复性阶段PCR反应体系中的荧光强度可知反应体系中PCR 扩增产物的量。利用荧光标记型公共引物进行多靶序列PCR检测的优点1、荧光公共引物设计简 单，引物序列设计不依赖靶序列，可以根据需要设计出能达到最佳荧光效果的引物。2、成本 低，由于荧光公共引物在靶序列检测时通用，可以做到制备一对公共引物能对多个靶序列 进行荧光PCR检测。3、能与常用的荧光PCR检测技术兼容，可在同一反应体系中实现多种 检测技术并用，增加检测准确度。利用非标记型公共引物进行多靶序列PCR检测方法如下1)根据非标记型公共引物设计的规则设计公共引物。2)特异引物的设计特异引 物由与公共引物序列相同的公共引物部分和与待扩增靶序列互补的靶引物部分组成。靶引 物位于特异引物的3’端，采用常规PCR的引物设计方法，使碱基序列与所需要的靶序列互 补。公共引物部分位于特异引物部分的5’端，与靶引物连接，构成同一条寡核苷酸链，碱基 序列与公共引物相同。3)PCR检测在常用的PCR反应混合体系(PCR缓冲液、Taq酶、dNTP) 中，加入公共引物、特异引物、待测样品。进行复性、延伸、热变性三步热循环反应，在第一个 循环的热变性阶段，公共引物、特异引物及模板均发生变性。在退火阶段，由于这时的反应 体系中没有与公共引物序列同源的模板，公共引物不引起PCR扩增，而靶引物可和模板中 的靶序列复性，Taq酶以它作为扩增引物进行PCR扩增，公共引物序列信息被导入PCR产物。 第二个PCR反应与第一个PCR反应的情况类似，公共引物两条链的序列信息都被导入到同 一条PCR产物中。在第三个循环的退火阶段，反应体系中PCR产物已含公共引物同源序列，公共引物的两条寡核苷酸链分别与PCR产物复性，Taq酶以公共引物作为扩增引物，以含有 公共引物序列信息的PCR产物为靶序列进行PCR扩增。4)PCR产物的检测在荧光PCR检 测上的应用，可采用一种荧光嵌入剂，它能嵌入双链DNA发出特定波长的荧光，常用的荧光 嵌入剂是SYBR Green I。在常规PCR检测上的应用，可采用电泳、PCR-ELISA等常规的PCR 检测方法。利用非标记型公共引物进行多靶序列PCR检测的优点1、公共引物设计简单，引物序列设计不依赖靶序列，可以根据需要设计出能达到 最少引物二聚体的引物。2、成本低，可以做到制备一对公共引物能对多个靶序列进行PCR 检测。3、能与常用的荧光PCR检测技术兼容，可在同一反应体系中实现多种检测技术并用， 增加检测准确度。总上所述，这种多靶同时检测分子扩增方法降低了 PCR检测的成本，降低了检测 所需的时间。
图1为公共引物结构示意图；其中1代表公共引物第1条寡核苷酸链，2代表公共引物第2条寡核苷酸链；图2为特异引物结构示意图；其中1代表特异引物第1条寡核苷酸链上的靶引物序列部分与对应的靶序列同 源；2代表特异引物第1条寡核苷酸链上的公共引物序列部分与公共引物第1条寡核苷酸 链序列同源；3代表特异引物第2条寡核苷酸链上的靶引物序列部分与对应的靶序列同 源；4代表特异引物第2条寡核苷酸链上的公共引物序列部分与公共引物第2条寡核苷酸 链序列同源；图3为荧光公共引物结果示意图；其中1代表荧光公共引物第1条寡核苷酸链；2代表标记在第1条链上的荧光分 子；3代表荧光公共引物第2条寡核苷酸链(与第1条寡核苷酸链互补配对)；4代表标记 在第2条寡核苷酸链上的荧光受体；5代表公共引物两条链发生复性后荧光分子的荧光被 淬灭；图4为荧光公共引物实时荧光PCR多靶序列扩增原理图；图5为荧光公共引物实时荧光PCR单靶序列扩增原理图；图6为非标记公共引物多靶序列PCR扩增原理图；图7为人柠檬酸脱氢酶实时荧光PCR检测图；图8为PCR产物琼脂糖电泳图；其中1代表阴性对照；2代表多靶序列PCR扩增产物琼脂糖电泳图，相应的片段大 小分别为230bp、345bp、564bp ；3代表人柠檬酸脱氢酶基因PCR扩增产物琼脂糖电泳图，相 应的片段大小为230bp ；4代表人CAPN6基因PCR扩增产物琼脂糖电泳图，相应的片段大小 为345bp ；5代表鱼生长激素基因PCR扩增产物琼脂糖电泳图，相应的片段大小为564bp ；图9为鱼生长激素实时荧光定量检测图；图10为鱼生长激素实时荧光定量检测定量曲线图；图11为荧光公共引物多靶序列(人柠檬酸脱氢酶基因、人CAPN6基因、鱼生长激 素基因)实时荧光PCR检测图12为应用多靶同时检测分子扩增方法制成的复合诊断型试剂的检测流程图。
具体实施例方式多靶同时检测分子扩增方法包括以下几个步骤1)根据几个靶目标的DNA或RNA的序列，分别设计出用于扩增每一个靶目标的引 物；2)同时设计出适用于每一靶目标的内控；3)为每一个靶目标制备出一套标准物，一般为五个，例如2X107IU/ml，2X106IU/ ml，2X105IU/ml，2X104IU/ml，2X103IU/ml，此套标准物为定量分析用；4)确定复合型反应的最佳条件，制成Master Mix (混合试剂)；5)小规模生产测试，对各个靶目标，测定其灵敏度，特异性，稳定性和精确性；6)大规模生产。多靶同时检测分子扩增方法可广泛用于多靶序列实时荧光PCR检测的公共引物 及其对多靶核酸序列的PCR扩增。用于多靶序列PCR检测的公共引物为一对(两条)寡核 苷酸片断，公共引物的碱基序列及其数目不限，包括荧光标记型和非标记型两种。多靶同时 检测分子扩增方法可广泛应用于荧光标记型和非标记型两种类型的公共引物PCR检测。下面结合具体实施例来进一步说明多靶同时检测分子扩增方法在多靶序列PCR 检测的公共引物及其对多靶核酸序列进行PCR扩增中的应用。如图1所示，所说的用于多靶序列PCR检测的公共引物为一对(两条)寡核苷酸 片断，公共引物的碱基序列及其数目不限，包括荧光标记型和非标记型两种。荧光标记型公 共引物是由两条碱基互补配对寡核苷酸片断组成，其中一条核酸链标记荧光供体，另一条 核酸链标记荧光受体。如图3所示，荧光标记型公共引物两条链在稳定的双链结构时，荧光 受体靠近荧光分子，荧光分子的荧光被淬灭，此时公共引物不发荧光。当在酸、碱、热等变性 条件下公共引物两条链互相分开，荧光受体与荧光分子分开，荧光分子发出荧光。当恢复到 温和条件时，两条链复性为双链状态，荧光受体靠近荧光分子，荧光分子的荧光被淬灭。利用荧光标记型公共引物进行多靶序列PCR检测在特异引物的设计中特异引 物由与公共引物序列相同的公共引物部分和与待扩增靶序列互补的靶引物部分组成。靶引 物位于特异引物的3’端，采用常规PCR的引物设计方法，使碱基序列与所需要的靶序列互 补。公共引物部分位于特异引物部分的5’端，与靶引物连接，构成同一条寡核苷酸链，碱基 序列与公共引物相同，参见图2，在多靶序列PCR检测体系中，同一个体系需要扩增2个以上 靶序列，就需要设计多对特异引物，其中特异引物中的靶引物部分应分别设计成与所要扩 增的靶序列互补，公共引物部分的序列与公共弓丨物相同。实时荧光PCR检测过程在常用的PCR反应混合体系(PCR缓冲液、Taq酶、dNTP) 中，加入荧光公共引物、特异引物、待测样品。进行复性、延伸、热变性三步热循环反应，在 第一个循环的热变性阶段，公共引物、特异引物及模板均发生变性，公共引物中的荧光分子 和其受体分离发出荧光。在复性阶段，由于这时的反应体系中没有与公共引物序列同源的 模板，公共引物两条链发生复性，荧光分子靠近其受体，不发出荧光。特异引物中的靶引物 分别和模板中对应的靶序列复性，Taq酶以它作为扩增引物进行PCR扩增，同时公共引物序 列信息被导入PCR产物。第二个PCR反应与第一个PCR反应的情况类似，公共引物两条链的序列信息都被导入到同一条PCR产物中。在第三个循环的复性阶段，反应体系中PCR产 物两端已含公共引物同源序列，公共引物与PCR产物复性，Taq酶以公共引物作为扩增引物 进行PCR扩增，这时公共引物两条链被分离。荧光分子远离荧光受体，发出荧光。在随后 的反应中，通过检测复性阶段PCR反应体系中的荧光强度可知反应体系中PCR扩增产物的 量，参见图4，其中，A为PCR反应前，B为以特异引物为扩增引物，C为以公共引物为扩增引 物，Al为靶序列1，A2为靶序列2，A3为荧光公共引物，A4为特异引物1，A5为特异引物2， All, A21分别为靶序列1和靶序列2的PCR扩增，Bl为第1个PCR反应，B2为第2个PCR 反应，Cl为第3个PCR反应(发出荧光)，C2为第4个PCR反应(发出荧光)。除了可利 用荧光标记型公共引物进行多靶序列的PCR检测外，也可用它对单靶序列进行荧光PCR检 测，其过程和原理与多靶序列PCR检测相同。参见图5，其中，A为PCR反应前，B为以特异 引物为扩增引物，C为以公共引物为扩增引物，AO为靶序列，A3为荧光公共引物，A4为特异 引物，Bl为第1个PCR反应，B2为第2个PCR反应，Cl为第3个PCR反应(发出荧光)，C2 为第4个PCR反应(发出荧光)。公共引物和特异引物的设计与荧光标记型相同。在常用 的PCR反应混合体系(PCR缓冲液、Taq酶、dNTP)中，加入公共引物、特异引物、待测样品。 进行复性、延伸、热变性三步热循环反应，在第一个循环的热变性阶段，公共引物、特异引物 及模板均发生变性。在退火阶段，由于这时的反应体系中没有与公共引物序列同源的模板， 公共引物不引起PCR扩增，而靶引物可和模板中的靶序列复性，Taq酶以它作为扩增引物进 行PCR扩增，公共引物序列信息被导入PCR产物。第二个PCR反应与第一个PCR反应的情 况类似，公共引物两条链的序列信息都被导入到同一条PCR产物中。在第三个循环的退火 阶段，反应体系中PCR产物已含公共引物同源序列，公共引物的两条寡核苷酸链分别与PCR 产物复性，Taq酶以公共引物作为扩增引物，以含有公共引物序列信息的PCR产物为靶序列 进行PCR扩增。参见图6，其中A为PCR反应前，B为以特异引物为扩增引物，C为以公共引 物为扩增引物，Al为靶序列1，A2为靶序列2，A3为公共引物，A4为特异引物1，A5为特异 引物2，A1UA21分别为为靶序列1和靶序列2的PCR扩增，Bl为第1个PCR反应，B2为第 2个PCR反应，Cl为第3个PCR反应，C2为第4个PCR反应。PCR产物的检测在荧光PCR 检测上的应用，可采用一种荧光嵌入剂，它能嵌入双链DNA发出特定波长的荧光，常用的荧 光嵌入剂是SYBR Green I，在PCR检测开始时加入反应混合体系。在常规PCR检测上的应 用，可采用电泳、PCR-ELISA等常规的PCR检测方法。以下给出几个实施例实施例1 人柠檬酸脱氢酶公共引物实时荧光PCR检测1)模板、靶序列及公共引物与特异引物靶序列为人柠檬酸脱氢酶基因，扩增片 段长230bp ；模板为含人柠檬酸脱氢酶基因的质粒；公共引物为5， -ACG AAC TCG CAC TTG AX(X 为 dT_FAM)G ACA-3，5， -CCC AX(X 为 dT_DABCYL)C AAG TGC GAG TTC TAA-3，特异引物为5' -ACG AAC TCG CAC TTG ATG ACA TAA TAC GAC TCA CTA TAG G-3'5' -CCC ATC AAG TGC GAG TTC TAA TCA CAT GGA CTA CGT TGG CA-3'2) PCR 反应PCR 反应总体积为 25 μ L,内含 IOmM Tris-HCL, ρΗ8· 3,50mM KCL，2. OU Taq 酶， 200 μ M dNTP, 2. OmM MgCL2，0. 01 μ M 特异引物，0. 5 μ M 公共引物，模板 1 μ L。
PCR反应条件95°C，5分钟预变性后进入PCR循环95°C 35秒，55°C 40秒，72°C 30 秒，共40个循环。荧光数据采集在退火阶段55°C时采集。实时荧光检测结果见图7 (横坐 标为循环数(cycle)，纵坐标为荧光强度(Fluorescence)。PCR产物琼脂糖电泳图见图8。实施例2 鱼生长激素公共引物实时荧光定量PCR检测1)模板、靶序列及公共引物与特异引物靶序列为鱼生长激素基因，扩增片段长 564bp ；模板为含鱼生长激素⑶NA的质粒；公共引物为5， -ACG AAC TCG CAC TTG AX(X 为 dT_FAM)G ACA-3，5， -CCC AX(X 为 dT_DABCYL)C AAG TGC GAG TTC TAA-3，特异引物为5，-ACG AAC TCG CAC TTG ATG ACA TAC GTA TCA GAA AAC CAA CGG CTC TTCA-3，5，-CCC ATC MG TGC GAG TTC TM GCG GCC GCC TAC AGG GTG CAG TTG GMTCC-3，2) PCR 反应PCR 反应总体积为 25 μ L,内含 IOmM Tris-HCL, pH8. 3,50mM KCL，2. OU Taq 酶， 200 μ M dNTP,2. OmM MgCL2，0. 01 μ M特异引物，0. 5 μ M公共引物，梯度模板各1 μ L。PCR反应条件95°C，5分钟预变性后进入PCR循环95°C 35秒，55°C 45秒，72°C 40 秒，共60个循环。荧光数据采集在退火阶段55°C时采集。实时荧光定量检测结果及数据分 析见图9 (横坐标为循环数(cycle)；纵坐标为荧光强度(Fluorescence))、图10 (横坐标为 模板浓度(concentration)，纵坐标为CT值)，PCR产物琼脂糖电泳图见图8。实施例3 多靶序列公共引物实时荧光PCR检测1)模板、靶序列及公共引物与特异引物靶序列1为鱼生长激素基因，扩增片段长 564bp ；靶序列2为人柠檬酸脱氢酶基因，扩增片段长230bp ；靶序列3为人CAPN6基因，扩 增片段长345bp ；模板分别为含鱼生长激素CDNA的质粒、含人柠檬酸脱氢酶基因的质粒、含 人CAPN6基因的质粒；公共引物为5，-ACG AAC TCG CAC TTG A X(X 为 dT_FAM)G ACA-3'5， -CCC AX(X 为 dT_DABCYL)C AAG TGC GAG TTC TAA-3'特异引物为a、鱼生长激素基因特异引物5，-ACG AAC TCG CAC TTG ATG ACA TAC GTA TCA GAA AAC CAA CGG CTC TTCA-3'5，-CCC ATC MG TGC GAG TTC TM GCG GCC GCC TAC AGG GTG CAG TTG GMTCC-3'b、人柠檬酸脱氢酶基因特异引物5' -ACG AAC TCG CAC TTG ATG ACA TAA TAC GAC TCA CTA TAG G-3'5' -CCC ATC AAG TGC GAG TTC TAA TCA CAT GGA CTA CGT TGG CA-3'c、人CAPN6基因特异引物5' -ACG AAC TCG CAC TTG ATG ACA TAA TAC GAC TCA CTA TAG G-3'5' -CCC ATC AAG TGC GAG TTC TAA CCA GAA ACG AAA GTG AAA-3'2) PCR 反应PCR 反应总体积为 25 μ L,内含 IOmM Tris-HCL, ρΗ8· 3,50mM KCL，2. OU Taq 酶， 200 μ M dNTP,2. OmM MgCL2，3种特异弓|物各0.01 μ M混合，0. 5 μ M公共引物，模板1 μ L分别 为含鱼生长激素CDNA的质粒、含人柠檬酸脱氢酶基因的质粒、含人CAPN6基因的质粒、三种
9质粒的混合物。PCR反应条件95°C，5分钟预变性后进入PCR循环95°C 35秒，55°C 45秒， 72°C 40秒，共60个循环。荧光数据采集在退火阶段55°C时采集，实验结果见图11 (横坐标 为循环数(cycle)，纵坐标为荧光强度(Fluorescence))，PCR产物琼脂糖电泳图见图8。
如图12，一种应用多靶同时检测分子扩增方法制成的复合诊断型试剂的检测流 程，首先将要检测的样品(血清或血浆)与核酸提取试剂盒里面的核酸提取试剂混合，室 温培养15分钟，进行离心，边加内控到每一个样品后进行纯化，得到纯化的靶目标(DNA或 RNA)，将纯化的靶目标(DNA或RNA)放入复合型检测试剂盒进行多重靶目标分析，然后得到 检测结果。
权利要求
一种多靶同时检测分子扩增方法，其特征在于包括以下几个步骤1)根据几个靶目标的DNA或RNA的序列，分别设计出用于扩增每一个靶目标的引物；2)同时设计出适用于每一靶目标的内控；3)为每一个靶目标制备出一套标准物，一般为五个.例如2X107IU/ml，2X106IU/ml，2X105IU/ml，2X104IU/ml，2X103IU/ml.此套标准物为定量分析用；4)确定复合型反应的最佳条件，制成Master Mix(混合试剂)；5)小规模生产测试.对各个靶目标，测定其灵敏度，特异性，稳定性和精确性；6)大规模生产。
全文摘要
针对PCR单一靶地检测方法时间长、成本高的问题，本发明提出一种多靶同时检测分子扩增方法，它包括以下几个步骤根据几个靶目标的DNA或RNA的序列，分别设计出用于扩增每一个靶目标的引物；同时设计出适用于每一靶目标的内控；为每一个靶目标制备出一套标准物，一般为五个，例如2X107IU/ml，2X106IU/ml，2X105IU/ml，2X104IU/ml，2X103IU/ml，此套标准物为定量分析用；确定复合型反应的最佳条件，制成混合试剂；小规模生产测试，对各个靶目标，测定其灵敏度，特异性，稳定性和精确性；大规模生产，本发明降低了PCR检测的成本，缩短了降低PCR检测的时间。
文档编号C12Q1/68GK101871000SQ200910030589
公开日2010年10月27日 申请日期2009年4月24日 优先权日2009年4月24日
发明者陈奎 申请人:陈奎