专利名称：PCR-mtDNA检测鹌鹑源性成分的扩增引物及其检测试剂盒和使用方法
技术领域：
本发明主要涉及禽类源性成分的检测，尤其涉及鹌鹑源性成分的检测。
背景技术：
疯牛病、禽流感、羊搔痒病在世界各地的蔓延和传染给人类的事例，引起了各国政 府和消费者对肉食品、词料安全性的高度关注。目前畜禽肉食品的动物源性成分的鉴别 检测已涉及到肉食品的工业、进出口贸易、市场及餐饮业等领域。同时，国内外肉食品 及饲料贸易市场中的检验检疫工作对高新技术的需求也越来越迫切。因此，研究出一种 准确、快速、可靠的鉴别畜禽类动物源性成分的方法，就非常有必要。目前，为了确定食物及饲料的真实成分，已经开发了很多对动物源性成分鉴别的方 法，有物理、化学、免疫学和分子生物学等方法。在分子生物学方法中，分子标记技术以其快速、准确、稳定、高效等优点显示出巨 大的开发潜力和广阔的应用前景。目前在动植物源性成分鉴别检测中应用的分子标记主要包括核DNA 、 RNA、线粒体DNA (mtDNA)、和蛋白质分子标记等。PCR分子标记 鉴别检测技术，具有特异性高、针对性强、灵敏度高、简便快速、对检测样品要求低(几 乎所有的样本都可以作为PCR的材料，它只要求样本中有完整的靶序列核酸)，因此， 无论是经过远途运输或低温保存多年的陈旧样本，都可以用于PCR扩增。哺乳动物和禽类mtDNA在遗传上相对独立，是双链的超螺旋环状分子，具有基因 组小(约16kb)、没有重复序列、生物个体内无组织特异性、每个细胞中含有大量线粒 体基因组(哺乳动物约1000 2300个拷贝)等特点。因此，用mtDNA分子标记鉴别畜 禽肉食品及饲料动物源性成分与核DNA分子标记相比，具有灵敏度高、精确度好、快 速、降解小(加工过程中mtDNA保持较完整)、稳定易操作等优势。基于动物mtDNA 的PCR分子标记技术的上述特点，因此在动物源性成分鉴别检测中的应用具有广阔的—"j曰刖景。国外已对牛、绵羊、猪、鸡的源性成分进行了研究报道，国内对牛、绵羊、猪、鸡、驴、马、鹿属进行了研究报道。在用分子生物学方法鉴定检测动物源性成分的研究上， 国内外尚未见到对鹌鹑源性成分鉴别检测的研究报道。
发明内容
本发明的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种PCR-mtDNA技术检测鹌鸫源性成分的扩增弓l物及其特异性弓l物的扩增条件。本发明的另一目的是提供一种PCR-mtDNA检测鹌鹑源性成分的检测试剂盒。 本发明的还有一个目的是提供一种PCR-mtDNA检测鹌鹑源性成分的检测试剂盒的使用方法。以解决准确、快速、可靠的用PCR-mtDNA技术鉴别鹌鹑源性成分。 本发明的目的可以通过采用以下技术方案来实现 一种用于检测鹌鹑源性成分的特 异性PCR-mtDNA扩增引物，其主要特点是上下游长度均为18bp的核苷酸，序列如下 上游引物AF(18bp): 5， -TGAGCTCAATAGCCGCCA-3'; 下游引物AR(18bp): 5'-TGGCTTAATGGTTGGGTG-3'。所述的用于检测鹌鹑源性成分的特异性PCR-mtDNA扩增引物，所述的特异性 PCR-mtDNA扩增引物的扩增条件为94。C预变性5min， 1个循环，然后进入PCR循环 94。C变性30sec， 57。C退火30sec, 72。C延伸20sec，设计35个循环，最后72。C延伸8min。所述的用于检测鹌鹑源性成分的特异性PCR-mtDNA检测试剂盒，包括有①10X PCR缓冲液，其中含Mg2+20 mmoL/L;②dNTP ，其中2. 5 mmoL/L ;③上游引物AF，其 中25pmoL/L;④下游引物AR，其中25pmoL/L;⑤Taq酶，其中2L)/ML;⑥灭菌超纯水； ⑦DNA模板。所述的用于检测鹌鹁源性成分的特异性PCR-mtDNA检测试剂盒使用方法，包括有 如下步骤(1) 待检物DNA的提取；(2) 试剂盒中各组分与待检物DNA混合，按权利要求2的条件进行PCR扩增；(3) PCR产物经1.5l琼脂糖凝胶电泳检测，含有鹌鹑源性成分的检测物被引物AF+AR 扩增出DNA限制性片段，阳性即为检测出含有鹌鹑源性成分。所述的用于鹌鹑源性成分检测的PCR-mtDNA检测的试剂盒使用方法，所述的待检 物DNA的提取有如下步骤①称取0.03g研碎的待检测物样品于高压灭菌后的1.5ml离心管中，加入500pl 细胞裂解液消化；② 加入蛋白酶K10nl，浓度20mg/mi，慢速搅拌使之溶解并混匀，如需要可再次 加入蛋白酶K，置于5(TC水浴中消化过夜，适时混匀多次；③ 将细胞裂解液冷却至室温，加入等体积的Tris饱和酚，温和地转动离心管混匀 两相，使水相与酚形成乳状液；④4。C13000rpm/min离心10min，小心从离心机中取出离心管，禁止晃动，可见 有清晰的分层，上层为水相，提取的DNA便在这上层水相中，下层为酚相，一 般为黄色，中间可见有白色的絮状物为蛋白质。用大口的tip头(用剪刀将lml Tip头口剪成大于3mm的口，使孔径变大，以免核酸通过吸头时发生机械剪切) 小心吸出上层水相，移至另一干净离心管中，尽量不要吸出两相的交界面； 加入RNase (1%) 3 u 1 (1. 5 u 1 /ml)，轻轻混匀37。C水浴lh; 降至室温后，再加入等体积酚氯仿异戊醇，其比例为25:24:1温和的混匀 两相，振荡2min，形成均匀乳浊液； 重复步骤 ;⑧加入等体积的氯仿异戊醇，其比例为24:1，使两相充分混匀继续抽提； (9)重复步骤3); 在水相中加入1/10体积的3M NaAc混匀后，再加入两倍体积的预冷的无水乙 醇，弃上清液；0用70%乙醇漂洗1次，13000rpm离心5min，弃上清液，将离心管倒置于灭菌的滤纸上10 15min使乙醇挥，，干燥10 15min; G加入30plTE缓冲液，室温放置24h，然后4'C保存备用。本发明的有益效果是，近年来随着数个国家高致病性禽流感的相继发生，除鸡以外 已波及到人、天鹅、猫等，因感染禽流感而致死的人数不断增加，禽类食品和饲料的安 全性已关系到人类的安危。因此，研究出准确、快速、可靠的鉴别禽类动物源性成分的 方法和技术，对有效抵御禽流感及其它禽类疫病的传播和蔓延，具有重要的现实意义。 本发明以灭菌超纯水对鹌鹑DNA模板进行稀释，使其浓度分别降低到12ng/ul、 1.2ng/ul 、 120pg/ul、 12pg/ul、 1.2pg/ul、 120fg/ul、 12fg/ul、 1.2fg/ul，然后进行PCR 扩增。由PCR产物电泳结果可知，能检测到的最低浓度为120pg/ul,即该引物的灵敏度 是120pg/ul。
-图l为鹌鹑、含鹌鹑源性成分的饲料、鸪子、鸡、鸭、鹅、鸵鸟、鹧鸪、牛、羊、; DNA; :2、鹌鹁；3、含鹌鹁源性成分的饲料；4、鹆；5、 鸡；6、鸭；7、鹅；8、鸵鸟；9、鹧鸪；10、牛；11、羊；12、马；13、驴 14、鱼；15、空白对照；图4鹌鹤特异性PCR灵敏度验证结果检测电泳图。
具体实施例方式以下对所示之最佳实施例作进一步详述实施例1:对鹌鹁、含鹌鹁源性成分的饲料、鹆、鸡、鸭、鹅、鸵鸟、鹧鸪、牛、羊、马、驴、鱼动物的的检测验证实验。其编号为l、 2kbMarker; DNA; :2、鹌鹑；3、含鹌享鸟源性成分的饲料；4、鹆；5、鸡；6、鸭；7、鹅；8、鸵鸟；9、鹧鸪；10、牛；II、羊；12、马；13、驴14、鱼；15、空白对照。(1) 总DNA的提取采用酚氯仿抽提法，提取鹌鹑、含鹌鹑源性成分的词料、鸽、鸡、鸭、鹅、鸵鸟、鹧鸪、牛、羊、马、驴、鱼动物的基因组DNA，电泳检测结果如图1。提取基因组DNA 均经紫外分光光度计测定其纯度和浓度。测定OD260/OD280值均为1.8左右，说明DNA 纯度较高符合PCR扩增要求。(2) PCR-mtDNA特异性引物的设计比较GenBank中公布的各种动物线粒体基因序列，依据其物种保守序列设计出鉴别 检测鹌鹑源性成分的PCR特异性引物(只能扩增出鹌鹑DNA特异性片段，而扩增不出 其它动物DNA特异性片段)，引物如下上游引物AF(18bp): 5， -TGAGCTCAATAGCCGCCA-3'下游弓l物AR(18bp): 5'-TGGCTTAATGGTTGGGTG陽3'扩增序列长度为245 bp。(3) 鹌鸫PCR扩增利用设计的特异性引物AF和AR，以鹌鹑为模板进行PCR扩增。(3. 1) PCR反应体系 灭菌超纯水 18.5W; 10XPCR缓冲液(含Mg"20鹏oL/L) 2.5|4;70. 5W;上游引物AF (25pmoL/L) l.OW;下游引物AR (25pmoL/L) 1. 0ri;Taq酶(2UAC) 0. 5|4;灭菌超纯水 18.5W; DNA模板 1.014。 反应总体积为25. (3.2) PCR反应条件扩增条件为94'C预变性5min， 1个循环，然后进入PCR循环94'C变性30sec, 57 。C退火30sec， 72。C延伸20sec，设计35个循环，最后72。C延伸8min。扩增产物电泳结果如图2，可以看出，扩增出约245bp的DNA片段，与预期扩增的 片段长度相符。原理1) 模板DNA的变性模板DNA经加热至94。C5min后，使模板DNA双链或经PCR扩 增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；2) 模板DNA与引物的复性模板DNA经加热变性成单链后，温度降至57'C，引物 模板DNA单链的互补序列配对结合；3) 引物的延伸DNA模板-引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反 应原料，耙序列DNA序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性-复性-延伸三个过程，就可获得更多的"半 保留复制链"，而且这种新链又可成为下次循环的模板。(4) 引物的特异性验证 利用所设计鉴别检测鹌鹑源性成分的特异性引物AF和AR，分别以鹌鹑，含鹌鹑源性成分的饲料，鹆，鸡，鸭，鹅，鸵鸟，鹧鸪，牛，羊，马，驴、鱼的DNA为模板进 行PCR扩增，验证引物的特异性。PGR产物电泳结果见(图3)，该引物能够从鹌享鸟及 含有鹌鹑成分的词料样品的DNA中扩增出特异性的目的条带，扩增产物大小为245bp， 而从其它动物组织的DNA中均没有能够扩增出目的条带。(5) 扩增鹌鸦DNA产物测序序列将鹌鹑PCR扩增产物进行纯化后送测序公司测序。测序结果经与GENEBANK比对分析 表明:PCR特异性扩增产物的测序结果与鹌鹑的线粒体DNA的12sRNA基因区段完全一致， 同源性为100%。鹌鹁PCR产物测序序列结果tgagctcaat agccgccact aataagacag gtcaaggtat agcctatggg atggaagaaa 60 tgggctacat tttctaaaat agaacaaacg aaaaaggaca tgaaacctgg tccttggaag 120 gaggatttag cagtaaaatg ggatcacttt gcccacttta agatggccct gaggcacgta 180 cataccgccc gtcaccctct tcaaaagcta ctaataccga taaataacac ccaaccatta 240 agcca 245 (6)特异性PCR的灵敏度验证以灭菌超纯水对鹌鹑DNA模板进行稀释，使其浓度分别降低到12ng/ul、 1. 2ng/ul 、 120pg/ul、 12pg/ul、 1.2pg/ul、 120fg/ul、 12fg/ul、 1.2fg/ul，然后进行PCR 扩增。由PCR产物电泳结果图(图4)可知，能检测到的最低线为120pg/ul，即该引物 的灵敏度是120pg/ul。实施例2:对含有鹌鹑源性成分的饲料的PCR检测方法(一)提取DNA:采用酚氯仿抽提法(参照"分子克隆试验指南(第二版).北京科学出版 社，1995:34 60")① 称取0.03g研碎的待检测物样品于高压灭菌后的1.5ml离心管中，加入500W 细胞裂解液消化；② 加入蛋白酶K(20mg/m1)1(^1，慢速搅拌使之溶解并混匀，如需要可再次加入蛋 白酶K，置于5(TC水浴中消化过夜，适时混匀多次；③ 将细胞裂解液冷却至室温，加入等体积的Tris饱和酚，温和地转动离心管混匀 两相，使水相与酚形成乳状液； 4°C13000rpm/min离心10min，小心从离心机中取出离心管，禁止晃动，可见 有清晰的分层，上层为水相，提取的DNA便在这上层水相中，下层为酚相，一 般为黄色，中间可见有白色的絮状物为蛋白质。用大口的tip头(用剪刀将lml Tip头口剪成大于3誦的口，使孔径变大，以免核酸通过吸头时发生机械剪切) 小心吸出上层水相，移至另一干净离心管中，尽量不要吸出两相的交界面；⑤加入RNase(l。/。)3u 1 (1.5ul/ml)，轻轻混匀37'C水浴lh; 降至室温后，再加入等体积酚氯仿异戊醇(25:24:1)温和的混匀两相，振 荡2min，形成均匀乳浊液；0重复步骤(D;⑧加入等体积的氯仿异戊醇(24:1)，使两相充分混匀继续抽提；9@重复步骤@;t9在水相中加入1/10体积的3MNaAc混匀后，再加入两倍体积的预冷的无水乙醇， 弃上清液；0用70%乙醇漂洗1次，13000rpm离心5rain，弃上清液，将离心管倒置于灭菌的滤纸上10 15min使乙醇挥发，干燥10 15min; g加入3(M TE缓冲液，室温放置24h，然后4'C保存备用。(二) 引物合成将上游引物AF(18bp): 5， -TGAGCTCAATAGCCGCCA-3';下游引物AR(18bp): 5'-TGGCTTAATGGTTGGGTG-3'合成，每条引物各20D ，用时稀释到25pmoI/L(三) PGR扩增PCR反应试剂盒10XPCR缓冲液(含Mg2+20 mmoL/L)2. 5[4d麼(2. 5励L/L)0. 5rtAF (25pmoL/L)l潜lAR (25pmoL/L)l潜lT叫酶(2U/ML)0. 514DNA模板加灭菌超纯水至25W。将试剂盒中各组分与待检物DNA混合。 PCR反应条件94。C预变性5min， 1个循环，然后进入PCR循环94。C变性30sec， 57。C退 火30sec， 72。C延伸20sec，设计35个循环，最后72。C延伸8min。(四) 电泳检测PCR产物经1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物电泳结果见(图3)(五) 检测结果含有鹌鹑源性成分的检测物会被引物AF+AR扩增出DNA特异性片段，即阳性。 实施例3:基因组DNA的提取试剂的制备(1)细胞裂解液的制备① 1M Tris-HCl 250mL:称30. 285gTris，加水定容至250mL，加HC1调解pH至8. 0，高压灭菌，4。C保存。② 0. 5mol/L EDTA:在lOOmL双蒸水中加入37. 22g EDTA-Na2. 2H20，剧烈搅拌，用NaOH调节pH至8. 0 (约需4gNaOH)，定容至200 mL，分装后高压灭菌，4。C保存。 ③10% (m/v) SDS:将10g SDS溶于90mL双蒸水中，加热至68°C (助溶几滴浓HC1, pH=7. 2)，加水定 容至100mL，分装备用，室温保存，无须灭菌。取lmol/L的Tris-HC1 (pH8. 0) 2mL、0. 5mol/L的EDTA (pH8. 0)40mL、 10% (m/v)的SDS 10mL，加灭菌双蒸水定容至200mL。(2) 20mg/ml蛋白酶K的制备100mg蛋白酶K溶于5ml灭菌双蒸水，-20 。C保存。(3) 氯仿异戊醇(24:1):将氯仿、异戊醇按24: l的体积混合，置棕色瓶中4'C保 存。(4) 苯酚氯仿异戊醇(25: 24: 1):按25:24:1的体积将苯酚、氯仿、异戊醇 混合，置棕色瓶中保存于4'C。(5) 3M NaAc的制备称取40.8gNaAc.3H20，溶解，加水至100mL。高压灭菌15rain ， 4。C保存。(6) 10mg/ml RNase A的制备称取RNase A lOmg溶于10mmol/L Tris-HC1 (pH7. 5)、 15mmol/L NaCl中于IO(TC加热煮沸15min灭活DNase，缓慢冷却至室温，分 装成小份保存于一20'C。如为Sigma公司产品， 一般则不需加热煮沸。序歹U 表〈110〉深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心〈120〉 PCR-mtDNA检测鹌鹁源性成分的扩增引物及其检测试剂盒和使用方法 〈211〉 245bp 〈212〉腿 〈400〉tgagctcaat agccgccact aataagacag gtcaaggtat agcctatggg atggaagaaa 60 tgggctacat tttctaaaat agaacaaacg aaaaaggaca tgaaacctgg tccttggaag 120gaggatttag cagtaaaatg ggatcacttt gcccacttta agatggccct gaggcacgta 180cataccgccc gtcaccctct tcaaaagcta ctaataccga taaataacac ccaaccatta 240 agcca 24权利要求
1.一种用于检测鹌鹑源性成分的特异性PCR-mtDNA扩增引物，其特征是上下游长度均为18bp的核苷酸，序列如下上游引物AF(18bp)5，-TGAGCTCAATAGCCGCCA-3′；下游引物AR(18bp)5′-TGGCTTAATGGTTGGGTG-3′。
2. 如权利要求1所述的用于检测鹌鹑源性成分的特异性PCR-mtDNA扩增引物，其特 征是所述的特异性PCR扩增引物的扩增条件为94'C预变性5min， 1个循环，然后 进入PCR循环94。C变性30sec， 57。C退火30sec， 72。C延伸20sec,设计35个循 环，最后72"C延伸8min。
3. 如权利要求l所述的用于检观鹏鹑源性成分的特异性PCR-mtDNA检湖IJ试剂盒，其特征是包括有①10XPCR缓冲液，其中含Mg2+20咖oL/L;②dNTP ，其中2. 5 mmoL/L ; ③上游引物AF，其中25praoL/L;④下游引物AR，其中25pmoL/L;⑤Taq酶，其 中21)/|^;⑥灭菌超纯水；⑦DNA模板。
4. 如权利要求3所述的用于检测鹌鹑源性成分的特异性PCR-mtDNA检测试剂盒使用方 法，其特征是包括有如下步骤(1) 待检物DNA的提取；(2) 试剂盒中各组分与待检物DNA混合，按权利要求2的条件进行PCR扩增；(3) PCR产物经1.5y。琼脂糖凝胶电泳检测，含有鹌鹑源性成分的检测物被引物AF+AR 扩增出DNA特异性片段，阳性即为检测出含有鹌鹁源性成分。
5. 如权利要求4所述的用于鹌鹑源性成分检测的PCR-mtDNA检测的试剂盒使用方法，其特征是所述的待检物DNA的提取有如下步骤① 称取0.03g研碎的待检测物样品于高压灭菌后的1.5ml离心管中，加入50(^1细胞 裂解液消化； '② 加入蛋白酶K10W，浓度20mg/ml，慢速搅拌使之溶解并混匀，如需要可再次加 入蛋白酶K，置于5(TC水浴中消化过夜，适时混匀多次；③ 将细胞裂解液冷却至室温，加入等体积的Tris饱和酚，温和地转动离心管混匀两 相，使水相与酚形成乳状液；④ 4'C13000rpm/min离心10min，从离心机中取出离心管，禁止晃动，见有清晰分层， 上层为水相，提取的DNA便在这上层水相中，下层为酚相， 一般为黄色，中间有白色的絮状物为蛋白质；用大口的tip头吸出上层水相，移至另一千净离心管中，尽 量不要吸出两相的交界面； 加入RNase3 u 1 ，浓度1. 5 u 1 /ml，混匀37。C水浴lh;(B)降至室温后，再加入等体积酚氯仿异戊醇，其比例为25:24:1，温和的混匀 两相，振荡2min，形成均匀乳浊液；ro重复步骤④；⑧加入等体积的氯仿异戊醇，其比例为24:1，使两相充分混匀继续抽提； Q)重复步骤④；③在水相中加入1/10体积的3M醋酸钠混匀后,再加入两倍体积的预冷的无水乙醇， 弃上清液；0用70%乙醇漂洗1次，13000rpm离心5min，弃上清液，将离心管倒置于灭菌的 滤纸上10 15min使乙醇挥发，干燥10 15min; (2加入30WTE缓冲液，室温放置24h，然后4。C保存备用。
全文摘要
本发明主要涉及禽类源性成分的检测，尤其涉及鹌鹑源性成分的检测。一种用于检测鹌鹑源性成分的特异性PCR-mtDNA扩增引物，其主要特点是上下游长度均为18bp的核苷酸，序列为上游引物AF(18bp)5，-TGAGCTCAATAGCCGCCA-3′；下游引物AR(18bp)5′-TGGCTTAATGGTTGGGTG-3′。本发明的优点是，准确、快速、可靠的鉴别鹌鹑源性成分的方法和技术，对有效抵御禽流感及其它禽类疫病的传播和蔓延，具有重要的现实意义。本发明以灭菌超纯水对鹌鹑DNA模板进行稀释，使其浓度分别降低到12ng/ul、1.2ng/ul、120pg/ul、12pg/ul、1.2pg/ul、120fg/ul、12fg/ul、1.2fg/ul，然后进行PCR扩增。由PCR产物电泳结果可知，能检测到的最低浓度为120pg/ul，即该引物的灵敏度是120pg/ul。
文档编号C12Q1/68GK101260438SQ20081008240
公开日2008年9月10日 申请日期2008年3月3日 优先权日2008年3月3日
发明者吴建平, 卉 宗, 张利平, 张慧霞, 李丽娟, 阮周曦, 虹 陶 申请人:深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心