同时检测多种动物源性成分的试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及动物分子生物学领域，具体涉及同时检测多种动物源性成分的试剂 盒及其应用。 技术背景
[0002] 随着市场经济的不断发展，一些不法商贩为了谋取不正当的利益，在血制品、肉制 品中掺杂一些价格便宜的肉种甚至有挂羊头卖狗肉的行为存在。有调查研宄表明，这种掺 假的现象在市场上已经普遍存在，大部分肉制品中都掺有相对比较便宜的肉种，甚至全部 是价格便宜的肉种，这极大的损害了消费者的利益，扰乱了市场秩序，危害市民的健康。
[0003] 并且口蹄疫、疯牛病、禽流感、羊瘙痒病等动物源传染病频发，疫情区域内的动物 源性成分鉴别显得尤为重要；为了防止疫情扩散，维护广大消费者的切身利益，也需要一种 快速有效的动物源性监测方法。
[0004] 但是，因血制品和肉类的同源性因此难以直接分辨，目前已有的动物源性成分鉴 别方法都存在一定的缺陷（显微检测方法：难以区分动物源性、免疫学检测方法：工艺繁琐 及灵敏特异性低、近红外光谱检测方法：需要大量有权威性的标准样品、实时荧光定量检测 方法通量低且容易出现假阳性)。目前检测监测机构没有一种快速有效的检测方法，对肉制 品中的动物源性成分做出鉴定，致使此类现象难以判断和裁决。为了规范市场秩序，维护消 费者的正当权力和利益，保证市场竞争的公正性，急需一种快速全面准确的检测方法来判 断此类现象。
[0005] 大肠杆菌是人和许多动物肠道中最主要且数量最多的一种细菌。其食品卫生学意 义是作为食品是否被粪便污染的指示菌，广泛被我国和国外许多国家应用于食品卫生质量 检验。虽然肠道致病菌是引起食物中毒的主要来源，但由于大肠杆菌与致病菌的来源相同， 只要食品检出大肠杆菌，说明有粪便污染，被认为不卫生。本发明，包含11对不同动物来源 的特异性引物，并包含一对大肠杆菌引物作为血液、血制品及肉类，肉制品是否有粪便污染 的现象存在。
[0006] 专利201310082539. 1和201310368498. 2提供的检测系统仅可检测1种和4种肉 类源性，适用范围有很大的限制。
[0007] 微卫星（Microsatellite)，又称简单序列重复（Simple sequencerepeats, SSR)， 是指少数几个核苷酸(一般为1-6个）为重复单位组成的简单多次串联重复序列，其长度大 多在IOObp以内。由于微卫星具有高度的多态性，在基因组中含量丰富且分布均匀等优点， 而且微卫星DNA所在区域在生物的基因组中是比较保守的，某一物种的微卫星引物可在相 关密切的物种中使用，因此微卫星标记技术的应用非常广泛。STR位点相对线粒体细胞色素 氧化酶b (Cytb)物种间的特异性更加好，扩增特异性较好，在样本浓度高时，依然可以做到 特异性较高，避免了 Cytb序列物种间序列高度相似，无法复合扩增及高浓度样本易出现假 阳性结果的缺陷。
[0008] 毛细管电泳检测具很高的灵敏度，最低可检测31-62. 85pg的基因组DNA，相当于 10-20个拷贝的人类基因组。并且可同时检测的位点数量比实时荧光定量检测多，通量更 尚。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是提供一种同时检测多种动物源性成分的试剂盒及其应用，采用荧 光引物复扩和毛细管电泳方法结合，快速有效的对动物源性成分检测，可以同时检测犬、 牛、羊、鱼、猪、鸭、鸡、兔、猫、马、鼠和大肠杆菌的动物源性成分。
[0010] 本发明采用的技术方案： 在12种种属的序列STR保守区域设计12对特异性引物分别扩增犬（PEZ1)、牛 (BM2113)、羊（MAF33)、鱼（HLJ392)、猪（SW742)、鸭（CAUD056)、鸡（MCW248)、兔（Sat7)、猫 (FCA955)、马（HMS3)、鼠（cds)和大肠杆菌（CFS073)，检测样本DNA中是否含有这12种种属 的DNA，实现同时鉴别样本多种动物源性成分的目的。
[0011] 同时检测多种动物源性成分的试剂盒，该试剂盒包括12对用于检测动物源性成 分的引物，所述特异性引物由犬（PEZ1)、牛（BM2113)、羊（MAF33)、鱼（HLJ392)、猪（SW742)、 鸭（CAUD056)、鸡（MCW248)、兔（Sat7)、猫（FCA955)、马（HMS3)、鼠（cds)和大肠杆菌 (CFS073)的特异性引物组成，所述引物序列及其浓度见表1。
[0012] 表1引物序列及浓度
所述的引物中至少有一个引物的5'端进行荧光染料标记。
[0013] 优选的，所述的每个基因座对应的引物中至少有一个引物的5'端进行荧光染料标 记。
[0014] 优选的，将所述12个物种分组，具体为：第一组羊（MAF33)、鱼（HLJ392)、猪 (SW742 )、鸡（MCW248 )、大肠杆菌（CFT073 )、犬（PEZ1) ;第二组鸭（CAUD056)、鼠（cds)、兔（Sat7)、牛（BM2113)、马（HMS3)、猫（FCA955); 每组引物采用蓝色荧光染料6-FAM、绿色荧光染料HEX、黄色荧光染料TAMRA或红色荧 光染料ROX中任一种进行标记，且各组之间的标记色均不相同；内标选用橙色荧光标记，标 记物为SIZ。
[0015] 所述试剂盒的扩增体系如表2 : 表2 PCR加样体系
其中所述的 Reaction Mix 为MgCl2 7. 5mM，Tris-HCl buffer 125mM，KCl 125mM，dNTPs 7. 5mM，BSA 2mg/ml。其中DNA模版为待检测样品中提取的DNA，样品来源可为肉、肉制品、 血、血制品。
[0016] 复合扩增引物之间存在相互干扰，比如不同基因座引物形成二级结构、产生非特 异扩增。复合扩增引物测试的加样体系如表2,扩增体系如表2。经过引物筛选之后最终确 定了引物序列及引物浓度，如表1，引物扩增效率高，相互之间无非特异扩增。
[0017] 所述的试剂盒在检测动物源性成分中的应用，包括如下步骤： 1) 、取待检测样品，进行DNA的提取，提取的DNA作为DNA模版，样品来源可为肉、肉制 品、血、血制品， 2) 按表1中的引物及浓度配置引物混合物，PCR加样体系如表2 ; 3) 将PCR扩增管置于热循环仪上，选择表3所示的扩增程序进行扩增；扩增后的样品 应避光保存； 表3热循环仪的扩增程序
4) 扩增产物在遗传分析仪上荧光检测 由去离子甲酰胺与系统中分子量内标AG⑶Marker SIZ-500组成上样混合物〔（0. 5μ1 AG⑶Marker SIZ-500 (无锡中德美联生物技术有限公司））X (进样数）+ (12μ1去离子 甲酰胺）X (进样数)〕。将12. 5μ1上样混合物与PCR产物，避免产生气泡。95°C变性3分 钟，冰浴3分钟，并尽快电泳；用遗传分析仪检测分析； 用片段分析软件GeneMapper分析步骤4)中遗传分析仪检测收集的数据。
[0018] 电泳采用多道或单道毛细管电泳。软件分析峰高高于50rfu，认为相应的基因有扩 增。反之，分析结果峰高低于50rfu，认为无扩增，即不含相应的基因。
[0019] 有益效果： 1、本发明提供的同时检测多种动物源性成分的试剂盒，可以同时检测犬（PEZ1)、牛 (BM2113)、羊（MAF33)、鱼（HLJ392)、猪（SW742)、鸭（CAUD056)、鸡（MCW248)、兔（Sat7)、猫 (FCA955)、马（HMS3)、鼠（cds)动物源性成分，在一次扩增、可以检测出是否血液，血制品， 肉类和肉类品来源。
[0020] 2、复扩体系中添加的大肠杆菌（CFS073)引物可以作为制品是否存在粪便污染的 指示。
[0021] 3、选用11种物种的STR位点，避免了各物种间线粒体基因由于序列相似，实时荧 光定量PCR高浓度样本检测带来的假阳性结果。本发明20ng模版DNA扩增除目的峰以外 无非特异扩增。同时灵敏度较好，50pg模版DNA能够检出。
【附图说明】
[0022] 图1为鸭提取DNA扩增结果，只有CAUD056基因座有扩增，其余无扩增。
[0023] 图2为羊提取DNA扩增结果，只有MAF33基因座有扩增，其余无扩增。
[0024] 图3为鱼提取DNA扩增结果，只有HLJ392基因座有扩增，其余无扩增。
[0025] 图4为猪提取DNA扩增结果，只有SW742基因座有扩增，其余无扩增。
[0026] 图5为鸡提取DNA扩增结果，只有MCW248基因座有扩增，其余无扩增。
[0027] 图6为大肠杆菌菌液扩增结果，只有CFS073基因座有扩增，其余无扩增。
[0028] 图7为马提取DNA扩增结果，只有HMS3基因座有扩增，其余无扩增。
[0029] 图8为猫提取DNA扩增结果，只有FCA955基因座有扩增，其余无扩增。
[0030] 图9为牛提取DNA扩增结果，只有BM2113基因座有扩增，其余无扩增。
[0031] 图10为犬提取DNA扩增结果，只有PEZl基因座有扩增，其余无扩增。
[0032] 图11为鼠提取DNA扩增结果，只有cds基因座有扩增，其余无扩增。
[0033] 图12为兔提取DNA扩增结果，只有Sat7基因座有扩增，其余无扩增。
[0034] 图1~12中第三行峰为分子量marker AG⑶SIZ-500的峰，由无锡中德美联生物