一种同时检测马和驴源性成分的双重荧光pcr方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及食品检测技术领域，具体地说涉及检测食品中马和驴源性成分的双重 荧光PCR检测方法。
【背景技术】
[0002] 近年来，动物源性食品在人们日常膳食中的比例逐步增大，各种冷鲜肉、精深加工 的半成品肉、熟肉制品等消费比例逐年上升。但不同物种的肉品质和价格存在很大差异，给 掺杂掺假创造了极大的利润空间。为了谋取经济利益，有些不法企业和商贩在肉制品中使 用低成本肉代替高价位肉的现象时有发生。这不仅严重侵害了消费者的健康和权益，还会 涉及宗教信仰，导致民族问题，同时直接影响到国家的形象，社会的和谐发展以及政府的公 信力。因此，研究出一种准确、快速、可靠地鉴别动物源性成分的方法，就非常有必要。
[0003] 随着分子生物学方法在食品检验中的应用不断深入，食品中动物源性成分的鉴别 技术也在不断发展，鉴别精度和检测灵敏度的不断提高，目前已初步形成了以基因检测为 基础的方法体系。以聚合酶链式反应（PCR)为基础的技术已成为食品中动物源性成分鉴定 的核心方法。物种特异性PCR根据不同物种基因序列的差异位点设计特异性引物，利用PCR 反应实现动物源性成分特征基因片段的指数级扩增，继而通过电泳检测鉴别可能的物种成 分。多重PCR能够实现混合物中多个物种同时检测。近年来，实时荧光PCR技术是动物源 性成分检测中研究最多的方法，与普通PCR相比，具有特异性强、灵敏度高、重现性好、有效 降低污染等优点。
[0004] 哺乳动物线粒体DNA(mtDNA)在遗传上相对独立，具有基因组小、没有重复序列、 生物个体内无组织特异性、每个细胞中含有大量线粒体基因组等特点。因此，用mtDNA分子 标记鉴别动物源性成分与核DNA分子标记相比，具有灵敏度高、精确度好、DNA降解小等优 势。基于动物线粒体DNA的荧光PCR检测技术在动物源性成分鉴别中具有广阔的应用前景。
[0005] 目前，根据线粒体基因组DNA序列差异设计物种特异性引物，建立PCR与实时荧光 PCR方法已见大量报道，然而，针对马和驴动物源性成分同时检测的双重荧光PCR方法尚未 见报导。因此，建立动物源性产品中马、驴源性成分双重实时荧光PCR检测方法，对提高突 发事件应急处理能力，提升食品安全风险监测水平和监管能力具有重要意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种同时检测马和驴源性成分的双重荧光PCR方法。
[0007] 本发明首先提供用于检测、马和驴源性成分的引物对以及荧光探针，其中用于检 测马源性成分的引物核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 1-2所示，探针序列如SEQ ID NO. 5所 示；用于检测驴源性成分的引物核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 3-4所示，探针序列如SEQ ID NO. 6所示，两条探针分别标记不同的荧光素。
[0008] 在本发明的实施例中，SEQ ID NO. 5所示的探针以FAM荧光素标记，SEQ ID NO. 6 所示的探针以VIC荧光素标记。
[0009] 本发明提供了上述引物对和荧光探针在检测马和驴源性成分中的应用。
[0010] 本发明提供了上述引物对和荧光探针在制备检测马和驴源性成分试剂盒中的应 用。
[0011] 含有本发明引物对和荧光探针的试剂盒也属于本发明的保护范围。本发明的试剂 盒可以是由多个隔断所形成，以容纳固定一个或多个如管或小瓶的容器。这些容器之一或 者多个可以装有本发明的引物以及荧光探针，根据需要该引物和荧光探针可以是冻干形式 或溶于缓冲液中的状态。另外，本发明的试剂盒中还可以包括用于荧光定量PCR反应的一 种或多种酶/试剂，以及实施本发明所需要的其它成分及用具，例如DNA裂解液、荧光定量 反应液、阴性模板、阳性模板，所述阴性模板为双蒸水，所述阳性模板为马基因组DNA和驴 基因组DNA。
[0012] 进一步地,本发明的试剂盒其20 μ L工作体系为：
[0013] 试剂 体积μι浓度 GoTaqii qPCR Master Mix 10,0 2 x 马上游引物 0.5 10 μΜ 马下游引物 0.5 10 μΜ 马探针 0.5 10 μΜ 驴上游引物 0.5 10 μΜ 驴下游引物 0.5 10 μΜ 驴探针 0.5 10 μΜ DN A 模板 1.0 0.1 ,Ug /μ? - 0.5 tig /μι 去离子水 6.0
[0014] 本发明试剂盒的工作程序为：预变性95°C IOmin ;再经95°C变性15s，60°C退火 Imin, 40个循环。
[0015] 本发明每次检测标本时须设立阴性对照和阳性对照，在检测中两种对照为有效扩 增时，样本结果判断标准如下：
[0016] 有FAM和VIC荧光同时被检出，且Ct值均〈35. 0时，判定为阳性，表明从样品中同 时检出马和驴源性成分；
[0017] 有FAM荧光被检出，且Ct值〈35. 0，但无 VIC荧光，判定为阳性，表明从样品中检出 马源性成分；
[0018] 有VIC荧光被检出，且Ct值〈35. 0，但无 FAM荧光，判定为阳性，表明从样品中检出 驴源性成分；
[0019] 无 FAM和VIC荧光被检出，Ct值彡35. 0,判定为为阴性。
[0020] 本发明提供了一种同时检测马和驴源性成分的双重荧光PCR方法，该方法以蛋白 酶K消化法提取的肉制品DNA为模板，利用SEQ ID NO. 1-4所述的引物和SEQ ID NO. 5-6 所述的荧光探针进行双重荧光定量PCR扩增，根据Ct值判定结果。
[0021] 本发明方法中，双重荧光定量PCR的条件为：95°C预变性IOmin ;95°C变性15s， 60°C退火lmin，40个循环。
[0022] 本发明试剂盒特异性好，检测方法快速简单，准确性高，灵敏度好，为食品中马和 驴源性成分的检测提供了新的方法。本发明所述的荧光RCR技术可以准确快速的实现对食 品中马和驴源性成分的鉴别检测，可在Ih?2h内完成，具有快速、特异、敏感、高通量等优 点，不仅能为检测马和驴源性食品提供新的方法，而且能有效抵御肉制品掺假，加大对消费 者利益的保护力度。
【附图说明】
[0023] 图1为本发明试剂盒检测马源成分特异性检测结果。
[0024] 图2为本发明试剂盒检测驴源成分特异性检测结果。
【具体实施方式】
[0025] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神 和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0026] 若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技 术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0027] 实施例1引物的设计
[0028] 经大量比对GenBank中COX 1基因，选取COX 1基因高度保守且具有物种特 异性基因序列为模板，设计马COX 1/驴COX 1特异性引物对和Taqman MGB探针，分 别命名为马 COX I-F(Pl)、马 COX I-R(P2)、驴 COX I-F (P3)、驴 COX I-R(P4)、马 COX I-FAM-MGB-Probe (Probe-P5)、驴 COX I-VIC-MGB-Probe (Probe-P6)，用于双重 Taqman MGB 实时荧光PCR扩增的引物和探针序列如下：
[0029] PI:5'-AACCCCCCTATTCGTTTGATCT-3'
[0030] P2 ：5'-ACGGTCTGTGAGAAGCATGGT-3'
[0031] P3 ：5'-AGCCTCCTAATCCGTGCTGAA-3'