技 术有限公司生产及销售，以siz荧光标记，从75bp到500bp，分别是75,100,139,150,160， 200, 250, 300, 340, 350,400,450,490, 500,共 14 个片段。
【具体实施方式】
[0035] 以下通过【具体实施方式】结合附图对本发明作进一步详细说明，但本领域技术人员 将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明 具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等 著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所 用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0036] 实施例1引物的筛选 从NCBI genebank中下载引物设计模板序列，如表4。
[0037] 表4模板序列表
每个基因座序列在genebank中比对，在STR序列两端设计引物，选择特异性较好经 blast比对唯一的引物，经大量反复测试在复扩体系中各物种DNA模版扩增出唯一扩增峰， 设计引物时，需要在引物设计软件中反复调试，确保所有引物具有适中的长度、具有相似的 物理学特性和反应动力学特点、Tm值相近、GC含量适中、并保证引物之间不形成二聚体。此 外，某些转基因位点之间同源性较高，因此需要保证每对引物的特异性；同时应考虑在复合 扩增体系中，引物对不同扩增模板的适用性，保证不同模板扩增时，都满足试剂盒均衡性要 求。引物见表1。
[0038] 引物由上海生工合成，共分为两组：第一组羊（MAF33)、鱼（HLJ392)、猪（SW742)、 鸡（MCW248)、大肠杆菌（CFT073)、犬（PEZl)引物采用蓝色荧光染料6-FAM进行标记；第二 组鸭（CAUD056)、鼠（cds)、兔（Sat7)、牛（BM2113)、马（HMS3)、猫（FCA955)采用绿色荧光染 料HEX进行标记。内标选用橙色荧光标记，标记物为SIZ。单对引物做退火温度梯度扩增， 扩增体系如表2。
[0039] 其中所述的 Reaction Mix 为 MgCl2 7. 5mM，Tris-HCl buffer 125mM，KCl 125mM， dNTPs 7. 5mM , BSA 2mg/ml〇
[0040] B扩增热循环： (1) 将PCR扩增管置于热循环仪上； (2) 选择表5的扩增程序进行扩增； (3) 扩增后的样品应避光保存； 表5、温度梯度扩增程序
其中延伸温度分别为54°C，56°C，58°C，60°C，62°C，64°C。其余步骤温度相同。做梯度 测试。选择从54°C _64°C扩增特异性、扩增效率都好的12对引物用于复合扩增测试。
[0041] 复合扩增引物之间存在相互干扰，比如不同基因座引物形成二级结构、产生非特 异扩增。复合扩增引物测试的加样体系如表2,扩增体系如表2。经过引物筛选之后最终确 定了引物序列及引物浓度，如表1，引物扩增效率高，相互之间无非特异扩增。
[0042] C、扩增产物在遗传分析仪上荧光检测 由去离子甲酰胺与系统中分子量内标AG⑶Marker SIZ-500组成上样混合物〔（0. 5μ1 AG⑶Marker SIZ-500 (无锡中德美联生物技术有限公司））X (进样 数)+(12μ1去离子甲酰胺）X (进样数)〕。将12.5μ1上样混合物与PCR产物混合， 避免产生气泡。95°C变性3分钟，冰浴3分钟，并尽快电泳；用遗传分析仪检测分析； D、分型分析 用片段分析软件GeneMapper分析步骤C中遗传分析仪检测收集的数据。
[0043] 电泳采用多道或单道毛细管电泳。
[0044] 实施例2、实际样本测试 自行购买市场上的12种肉类，使用QIAamp?DNA Blood Mini Kit试剂盒提取12种肉 类 DNA。
[0045] 用分光光度计检测12个提取DNA的浓度，并稀释至0. 5ng/ μ L作为模板。
[0046] 按表6的加样体系加样，按表3的扩增程序进行扩增。
[0047] 表6 PCR加样体系
其中所述的 Reaction Mix 为MgCl2 7. 5mM，Tris-HCl buffer 125mM，KCl 125mM，dNTPs 7. 5mM ,BSA 2mg/ml〇
[0048] 扩增结果按实施例1中的电泳检测、数据分析方法进行分析，每个模板重复3管扩 增。
[0049] 附图]-12是电泳结果经美国AB公司genemapper IDX软件分析之后的12种动物 源性成分扩增图谱。
[0050] 附图 1-12 依次为鸭（CAUD056)、羊（MAF33)、鱼（HLJ392)、猪（SW742)、鸡 (MCW248)、大肠杆菌（CFT073)、马（HMS3)、猫（FCA955)、牛（BM2113)、犬（PEZ1)、鼠（cds)、 兔（Sat7);各物种提取DNA模板均能扩增出单一目的峰。
【主权项】
1. 同时检测多种动物源性成分的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于扩增如下 12种动物基因位点的引物：犬PEZ1、牛BM2113、羊MAF33、鱼HLJ392、猪SW742、鸭CAUD056、 鸡MCW248、兔Sat7、猫FCA955、马HMS3、鼠cds和大肠杆菌CFS073。2. 根据权利要求1所述同时检测多种动物源性成分的试剂盒，其特征在于，所述12对 引物核苷酸序列为：犬PEZlSEQIDN0.5~6，牛BM2113SEQIDN0.21~22,羊MAF33SEQ IDN0.7~8，鱼HLJ392SEQIDN0.11~12,猪SW742SEQIDN0.13~14,鸭CAUD056SEQID N0.17~18,鸡MCW248SEQIDN0.1~2,兔Sat7SEQIDN0.15~16,猫FCA955SEQIDN0.3~4， 马HMS3SEQIDN0.19~20,鼠cdsSEQIDN0.9~10 和大肠杆菌CFS073SEQIDN0.23~24。3. 根据权利要求I所述同时检测多种动物源性成分的试剂盒，其特征在于，所述引 物在扩增体系中的终浓度为：SEQIDNO. 1~2 :0.1剛；SEQIDNO. 3~4 :0.08剛；SEQID NO. 5~6 ：0. 15m；SEQIDNO. 7~8 ：0. 2|^M；SEQIDNO. 9~10 ：0. 15|^M；SEQIDNO. 11-12 ： 0.Iim；SEQIDNO. 13-14 ：0.2m；SEQIDNO. 15-16 ：0.25m；SEQIDNO. 17-18 ：0. 18|^M； SEQIDNO. 19~20 :0? 2剛；SEQIDNO. 21~22 :0?I剛；SEQIDNO. 23~24 :0?I剛。4. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括反应混合物、热启动Taq酶和 sdH20;所述的反应混合物中包括有：MgCl2 7. 5mM，Tris-HClbuffer125mM，KCl125mM， dNTPs7. 5mM,BSA2mg/ml〇5. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的引物中至少有一个引物的5'端 进行荧光染料标记。6. 根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的扩增体系为：反应混合物 10.OyL，DNA模板0. 1~10yL，引物混合物5yL，热启动Taq酶0. 5yL，sdH20补足至 25. 0yL〇7. 根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述12个动物基因位点的引物分组进 行荧光染料标记，第一组：羊MAF33、鱼HLJ392、猪SW742、鸡MCW248、大肠杆菌CFT073、犬 PEZl;第二组：鸭CAUD056、鼠cds、兔Sat7、牛BM2113、马HMS3、猫FCA955。8. 根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，每组引物采用蓝色荧光染料6-FAM、绿 色荧光染料ffiX、黄色荧光染料TAMRA或红色荧光染料ROX中任一种进行标记，且各组之间 的标记色均不相同；内标选用橙色荧光标记，标记物为SIZ。9. 根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的扩增程序为： 变性 95°C2min， 循环 94°C30s，59°Clmin，72°CImin30 个循环， 终止延伸 72°C20min， 4°C保温维持。10. 权利要求1~9中任意一项所述的试剂盒在检测动物源性成分中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种同时检测多种动物源性成分的试剂盒及其应用，采用荧光引物复扩和毛细管电泳方法结合，能同时检测12种动物源性成分，选择犬、牛、羊、鱼、猪、鸭、鸡、兔、猫、马、鼠的STR序列和大肠杆菌设计多组特异性引物。所述特异性引物由犬PEZ1、牛BM2113、羊MAF33、鱼HLJ392、猪SW742、鸭CAUD056、鸡MCW248、兔Sat7、猫FCA955、马HMS3、鼠cds和大肠杆菌CFS073组成。具有特异性好，灵敏度好，可以较快速的鉴定肉类的源性，且由于复扩系统中包含大肠杆菌的引物，可以同时鉴定肉类食品和制品是否存在大肠杆菌污染。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN104928387
【申请号】CN201510346772
【发明人】郑卫国, 李科杰, 陈林丽, 郭育林
【申请人】无锡中德美联生物技术有限公司
【公开日】2015年9月23日
【申请日】2015年6月19日