Rps23基因作为绵羊免疫性状的分子标记及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于绵羊分子标记制备技术领域，具体涉及RPS23基因片段作为绵羊免疫 性状的分子标记及其应用。
【背景技术】
[0002] 在养羊业生产中，疾病严重威胁着羊只的健康并造成巨大的经济损失。尽管通过 加强饲养管理和应用药物疫苗等措施可预防疾病，但未能十分有效控制传染病的流行，同 时大量药物的使用会使动物机体产生耐药性，给畜产品的安全造成隐患。
[0003] 长远来看，从抗病力的遗传基础研宄出发，筛选抗性基因，从分子水平开展抗病育 种，从遗传上提高羊只对病原的抗性，增强免疫力是从根本上解决这一问题的重要途径。抗 病育种潜在的巨大经济效益以及某些疾病可作为研宄人类疾病动物模型的诱人前景，正有 力地推动着这项工作的发展。随着分子生物学、分子遗传学和基因工程技术的发展，抗病育 种在绵羊的育种中已经开始发挥重要作用。
[0004] 在抗病育种中，抗病基因的寻找是关键。目前国内外已鉴定出的主要抗病候选基 因有以下几个：
[0005] (1)天然抗性巨结合蛋白 I (Natural resistance-associated macrophage protein l，Nrampl)，Nramp是一个基因家族，是目前研宄较多的宿主抗性基因之一，至少包 括2~3个成员，现已发现有Nrampl和Nramp2。国内外学者对Nrampl基因与抗病力的相 关性进行了大量的研宄，把Nrampl基因作为功能基因研宄其结构与动物抗病性状的报道 也较多，但主要集中在人类、小鼠、猪和家禽上（陈冬金，谢喜平，陈岩锋，等.畜禽Nrampl 基因抗病作用的研宄进展.畜牧与饲料科学，2012, 33(7) : 79-81.)。绵羊的Nrampl基 因定位在 1 号染色体 2q41_q42 的区域（Pitel F. E. P. Cribiu，M. Yerle，et al. Regional localization of the ovine NRAMP gene to chromosome 2q41-q42by in situ hybridization. Cytogenet Cell Genet，1995, 70 (1-2) :116 ~118·)，山羊的 Nrampl 基因 定位于 2 号常染色体上长臂 ql2. 2 (Vacca G. Μ· M. Pazzola，C. Pisano，et al. Chromosomal localisation and genetic variation of the SLCllAlgene in goats(Capra hircus). Vet J，2011. 190(1) :60~65.)。研宄发现，绵羊Nrampl基因多态性与伤寒沙门氏菌易感 性和抗性有关（姚菊霞，王光华，马利青.羊主要抗病候选基因的研宄进展.青海畜牧兽医 杂志，2014, 44(5) :40~43.)。Nrampl蛋白可抵抗分枝杆菌、沙门氏菌等多种胞内寄生病 原菌的侵染而发挥重要的免疫功能，对畜禽机体抗病力影响较大（吴宏梅等，NRAMPl基因 研宄进展及其在抗病育种中的应用.中国畜牧兽医，2005,32(4) :26~28)。
[0006] (2)主要组织相容性复合物（MHC)是由一群紧密连锁的基因群组成的一个定位于 动物某对染色体的特定区域，与免疫应答和抗病性密切相关的多基因家族，在宿主的免疫 反应中对病毒、细菌、寄生虫的控制和清除有重要作用。目前，已证实主要组织相容性复合 物与人类和家畜的多种疾病存在着密切关系。因此，近年来对MHC的研宄成为家畜抗病育 种研宄中的前沿部分（孙东晓等.反刍家畜主组织相容性复合物的研宄进展.中国畜牧杂 志，2002, 38 (5) :46~47.)。绵羊的MHC称为OLA (绵羊白细胞抗原），位于第20号染色体 上，具有高度的多态性和连锁不平衡性。根据MHC抗原结构和功能的不同，可将MHC分为 class I型class II型和class III型。一般认为绵羊MHC class II的多态性和遗传性是 为了保护机体组织对抗疾病的感染。在这个基因区域有DQ和DR两个亚区，OLA II类分子 的DQ和DR亚区的DRB和DQB两个基因位点所编码的MHC在抗原免疫系统中发挥着最主要 的作用；其第2个外显子编码抗原的功能区（抗原结合区）具有丰富的多态性，它组成II类 抗原分子功能最重要的部分。此外，MHC与生产性能具有密切的联系，但需要进一步研宄才 能应用于家畜的遗传标记。
[0007] 此外，其它有研宄的与抗病力有关的基因是TLR(Toll-like rec印tor，Toll 样受体）MX1 (Myxovirus (influenza)resistance 1，粘液病毒（流感）抗性因子 I)、 ILl(Interleukins 1，白细胞介素 I)、PPARG(Peroxisome proliferator activated receptor gamma，过氧化物酶体增殖激活受体γ)等基因。
[0008] 最近研宄发现老鼠上的一个基因，RPS23逆转录转座基因1，调节β-淀粉样蛋 白水平和牛磺酸磷酸化水平，阿尔茨海默病（AD)的两个病理特征，并且发现RPS23rgl是 由鼠的RPS23mRNA逆转录转座引起的。同时发现RPS23mRNA逆转录转座在不同物种中发 生多次但在鼠中只生成另一个RPS23rgl同源基因功能表达，RPS23rg2,而人类可能不具 备RPS23rg的功能性同系物。相对地RPS23rgl和RPS23rg2都是相对于父母代RPS23基 因转录，在各种组织和与腺苷酸环化酶进行交互编码蛋白质中表达。与RPS23rgl蛋白类 似，RPS23rg2能对蛋白激酶A的活动进行上调来降低糖原合成酶激酶的活性，β-淀粉样 蛋白水平和牛磺酸磷酸化水平。然而，RPS23rg2的影响比RPS23rgl要弱，这种差异可能 是由于RPS23rg2额外的羧基末端区域导致的，这可能就有抑制作用。此外，研宄人员还发 现RPS23rg 1的跨膜结构域对这个功能很重要。该研宄结果提供了一个新的基因家族，它 的产物和相关信号通路可能会阻止鼠的阿尔茨海默病的发展（Huang X，Chen Y，Li W B，et al.The Rps23rg gene family originated through retroposition of the ribosomal protein s23mRNA and encodes proteins that decrease Alzheimer's beta-amyloid level and tau phosphorylation[J]· Hum Mol Genet. 2010, 19 (19):3835-3843.)〇
[0009] 通过以上资料我们可以得出RPS23基因参与多种生理病理过程并发挥着重要的 作用。寻找基因中的变异位点，通过与性状间的关联分析发现基因与性状间的关系是研宄 基因功能的一个重要手段，也是进行标记辅助选择的基础。为此开展了绵羊HPSE基因的克 隆、SNP筛查、检测及与性状关联分析。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，制备一种与为绵羊免疫性状的分子标记 及其应用。本发明的分子标记从RPS23基因中得到。采用克隆绵羊RPS23基因的完整⑶S 序列，寻找RPS23基因的突变位点以及基因的多态性的检测方法，进而建立适用于绵羊免 疫性状的分子标记的方法。
[0011] 具体地，本发明的技术方案如下所述：
[0012] 一种从绵羊RPS23基因片段中克隆得到一种作为与绵羊免疫性状相关的分子标 记，该标记完整的编码区序列如序列表SEQ ID NO :1和图1所示，它的部分DNA序列如序列 表SEQ ID NO :2和图2所述。在SEQ ID NO :1所示序列的第421位碱基处有一个A/G碱基 突变，即在作为本发明的分子标记的如序列表SEQ ID NO :2所示序列的第221位碱基处有 一个A221-G221的碱基突变，该突变位于第4外显子内，导致Bsa I -RFLP多态性。
[0013] 申请人设计了一对克隆绵羊RPS23基因的⑶S引物序列，该引物扩增的⑶S序列 如SEQ ID NO :1所述。同时申请人设计了一对包含第4外显子的用于扩增绵羊RPS23基因 组序列的引物，该引物扩增的序列如SEQ ID NO :2所述（即本发明制备的分子标记）。
[0014] 申请人提供了一种制备上述分子标记的方法，所述的方法按照以下步骤进行：
[0015] 以成年湖羊瘤胃、肾、肺和脾脏等组织样提取总RNA为模板，作RT-PCR扩增、PCR产 物纯化和克隆测序，进行序列分析，获得如序列表SEQ ID NO: 1所述的cDNA序列（包括全 部⑶S);从绵羊血液基因组中提取DNA，设计引物，PCR扩增、PCR产物纯化和测序，获得如 序列表SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列。
[0016] 应用常规的PCR-RFLP的方法对序列表SEQ ID NO :2的第221位碱基突变进行了 检测，并初步进行其基因型与绵羊免疫性状之间的关联分析的应用，为绵羊的分子标记辅 助选择提供了 一个新的分子标记。
【附图说明】
[0017] 序列表SEQ ID NO :1是本发明克隆的绵羊免疫性状的基因 RPS23的cDNA序列。
[0018] 序列表SEQ ID NO :2是本发明制备的与绵羊免疫性状相关的分子标记的序列 (RPS23基因用于PCR-RFLP部分DNA序列）。
[0019] 图1 :是本发明克隆的绵羊免疫性状的RPS23基因用于PCR-RFLP部分DNA序列。 下划线部分是引物的序列。
[0020] 图2 :是本发明制备的与绵羊免疫性状相关的分子标记的序列（序列的下划线部 分：即l-