专利名称：：一种改进的标记免疫测定方法
技术领域：
：本发明涉及生物领域的一种标记免疫实验方法，具体是指一种改进的标记免疫测定方法。
背景技术：
：免疫血清学技术是一类在生物学、医学诊断，研究及其相关制品生产中应用最为广泛的实验方法之一。标记免疫学创建于上世纪六十年代中后期，他的出现使多数原有免疫实验方法退出生物学应用，而部分新的或能与标记技术衔接的原有试验方法则集合为一个新兴的实验
技术领域：
而得到迅速发展。标记血清学是标记免疫学中的一个最为重要分支，在近四十年发展历程中，其敏感性、特异性与稳定性，因实验材料的进步而得到显著的提高；其发展空间因新的标记物、示踪物及其反应信号探测方式的不断发掘而得以迅速拓展；操作的便捷程度因实验反应方式的改进而得到不断改善，这种改善与实验设备自动化的结合显著降低了实验操作者的工作强度。既往采用的标记免疫实验就其反应方式而言包括直接法、间接法、补体法、双抗体(或双抗原)夹心法、几种不同方式的竞争法，各种不同形式的蛋白芯片技术，以及PAP法等多种。在二十余年的沿革与发展中，间接法、双抗体夹心法及其部分竞争法的应用迅速得到普及，他们三者均有两步或以上的免疫反应，而此两步免疫反应在操作方式上可采用二步法，也可以合并在同一时间平面内进行，即一步法。由于一步法能在充分保证检测结果特异性、敏感性与稳定性，在几乎完全相同的实验操作、试剂、与实验仪器条件下，较二步法节省一次免疫反应时间，并省去一轮洗涤步骤，这一改进曾作为标记免疫学上的重大技术进步，于上世纪90年代后期在我国迅速推广。Hooks效应即钩状现象，表现为当反应体系中待测物质，即抗原或抗体，浓度升高到一定程度时，检测信号反而下降，甚至出现假阴性结果。随着标记免疫学技术在方法敏感性上的大幅提高，尤其是其主要反应方式由传统的二步法简化为一步法，并在我国临床检验中大幅度普及应用后，由Hooks效应导致的临床检验结果失真便成为一个十分常见的临床现象。造成Hooks效应的原因虽可能与待测的免疫分子结构相关，但反应体系中靶抗原与对应抗体比例的高度失调是其最主要的原因。这种影响如果发生于某些特殊临床指标如采用一步法ELISA或化学发光技术进行血清HBsAg筛选，则可造成部分强阳性标本检测信号的降低或显著降低，甚至导致个别具有高度传染性的强阳性标本在一步法检测中出现假阴性结果。如果这种漏检发生在献血员筛选，则势必导致受血者发生输血相关性肝炎的严重临床事件。鉴于该指标在我国检测规模及其社会影响面极其广大，一步法在献血员HBV感染者筛选中的应用在我国已被明令禁止。
发明内容本发明的目的是提供一种能简化二步法的实验操作，同时又能克服一步法中钩状效应的标记免疫测定方法。为了实现上述目的，一种改进的标记免疫测定的方法，其步骤包括1)向已包被已知抗体或抗原的固相载体表面加入含待测抗原或抗体的待测标本，进行免疫反应；2)向步骤1)的已发生免疫反应的固相载体中加入密度大于上述待测标本溶液的标记抗体或抗原溶液，静置分层使标记抗体或抗原覆盖于固相载体表面，使标记抗体或抗原与固相载体表面的对应免疫物质进行免疫反应；3)洗去固相载体表面未发生免疫结合的物质；4)根据常规方法生成检测信号，并据此测定待测标本中靶抗原或抗体的含量。所述常规方法采用酶促显色的方法，该方法进行酶促显色反应后，用酶标记比色计比色，并根据对照或标准曲线孔测值判读实验结果。所述常规方法采用化学发光显色的方法，该方法进行化学发光显色反应后，用化学发光测定仪比色，并根据对照或标准曲线孔测值判读实验结果。所述标记抗体或抗原溶液为常规标记溶液中加入惰性有机与无机分子，使标记溶液的密度大于待测标本溶液。所述标记抗体或抗原溶液的粘度能使标记溶液与待测标本溶液分层。步骤3)所述的洗涤方法为洗涤3-6次，每次洗1-5分钟。同一体积溶液内溶质数量及种类的不同，会导致他们密度与粘度的差别。而将两种或以上溶液置于同一容器中时，他们将因密度上的差别而依次处于容器中不同的位置，密度较高的溶液会沉在相对下层。合理的溶液粘度对各溶液间界面的维系至关重要。本发明利用上述原理，在标记溶液中加入惰性有机与无机溶剂调节标记溶液至适当的密度。将其加至第一步免疫反应完成后的反应孔或其它容器中，此法配制的标记抗体或抗原溶液可因密度较高而平铺在反应孔底部，覆盖与靶物质反应后的固相界面并完成二次免疫反应。而先期加入的标本溶液则通过排溢作上升至标记溶液的顶端，不或基本不对二次免疫反应发生干扰。本发明将二步法标记免疫测定中所需要的二步洗涤步骤简化为一步洗涤，省略一步洗涤及其与之伴随的相关操作，从而使实验过程明显简化，并减少了洗涤操作自身的负面影响。本发明还保留二步法中两步免疫反应依序进行的特征，从理论上根除发生Hooks效应的可能性。本发明所用各项实验条件、实验仪器、具体操作方法、结果的计算方式以及检测的质量标准与控制等都基本与常规的测定方法相同，可确保本发明能与现有技术实现良好的对接，具有很强的实用性。具体实施例方式以下结合具体实施例进一步说明本发明，本实施例仅作举例来说明本发明，不作任何限定实施例1一种双抗体夹心ELISA(酶联免疫吸附测定)实验来测定血清中HBsAg的方法，其步骤包括在已包被抗HBs-IgG的反应孔中加入含拟进行HBsAg检测的血清、其它标本或质控物，室温免疫反应30分钟；向反应板的各反应孔中小心加入密度高于待测标本溶液的抗HBs-HRP溶液，所加入的抗HBs-HRP溶液平铺于各反应孔的底部，并将已反应的待测标本溶液排溢到抗HBs-HRP溶液的顶端，静置，以保持两层溶液的相对分层状态，在室温下再反应30分钟；免疫反应完成后，甩出反应孔内的全部液体，用洗涤液洗涤反应板3次，每次5分钟，甩干；向反应孔中加入酶反应底物，室温放置30分钟，待酶促显色反应完成后加入50mL浓度为2mol/L硫酸终止反应。采用酶标比色计比色，并根据对照或标准曲线孔测值判读实验结果。实施例2一种双抗体夹心酶化学发光标记免疫来测定血清中HBsAg的方法，其步骤包括在已包被抗HBs-IgG的反应孔中加入含拟进行HBsAg检测的血清、其它标本或质控物，室温免疫反应60分钟。向反应板的各反应孔中小心加入密度高于待测标本溶液的抗HBs-HRP溶液，所加入的抗HBs-HRP溶液平铺于各反应孔的底部，并将已反应的待测标本溶液排溢到抗HBs-HRP溶液的顶端，静置，以保持两层溶液的相对分层状态，在室温下再反应60分钟。免疫反应完成后，吸出反应孔内的全部液体，用洗涤液洗涤反应板6次，每次1分钟，甩干。向反应孔中加入化学发光底物作酶促发光反应，用发光信号测定仪测定发光信号强度，并根据对照或标准曲线孔测值判读实验结果。实施例3一种用间接法ELISA测定血清中抗HCV的方法，其步骤包括在已包被重组HCAg的反应孔中加入含拟进行抗HCV检测的血清、其它标本或质控物，室温免疫反应60分钟。向反应板的各反应孔中小心加入密度高于待测标本溶液的抗HCV-HRP溶液，所加入的抗HCV-HRP溶液平铺于各反应孔的底部，并将已反应的待测标本溶液排溢到抗HCV-HRP溶液的顶端，静置，以保持两层溶液的相对分层状态，在室温下再反应60分钟。免疫反应完成后，吸出反应孔内的全部液体，用洗涤液洗涤反应板5次，每次2分钟，吸干。向反应孔中加入酶反应底物，室温放置30分钟，待酶促显色反应完成后加入50μmL浓度为2mol/L硫酸终止反应。采用酶标比色计比色，并根据对照或标准曲线孔测值判读实验结果。将本发明的测定方法、常规标记免疫测定方法的一步法与二步法进行比较。以实施例1中的双抗体夹心ELISA来测定血清中HBsAg含量的方法为例，不同的测定方法对检测敏感性的影响如表1所示，血清中HBsAg含量单位为ng/mL，测定值为A45(1。测\含^XyI2.01.O0.50.250.1250.06250.03130.016空白_________本发明3.112.791.941.160.430.370.0210.140.06一步法3.232.931.871.240.580.290.230.170.05二步法2.892.732.111.130.470.310.190.1050.045表1不同的测定方法对检测敏感性的影响由表1可以看出本发明的敏感性可以达到0.03ng/mL，与一步法和二步法没有明显差别。以实施例1中的双抗体夹心ELISA来测定血清中HBsAg含量的方法为例，不同的测定方法对检测的显色强度的影响如表2所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表2不同的测定方法对检测的显色强度的影响由表2可以看出以上三种测定方法没有明显差别。以实施例1中的双抗体夹心ELISA来测定血清中HBsAg含量的方法为例，不同的测定方法对检测的Hooks效应的影响如表3所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表3不同的测定方法对检测的Hooks效应的影响由表3可以看出血清中HbsAg含量过高时，本发明方法测值与二步法ELISA之间未见显著差异，而一步法自150.0μg/mL起，随着检测标本靶物质含量的升高，其A450反而呈序贯下降的趋势。本发明检测信号强度与二步法一样消除了Hooks效应的影响。总之，本发明的敏感性和显色强度都与一步法及二步法相当，但是在进行高浓度测量时的准确性高于一步法，而又比二步法减少一次洗涤操作，从而减小了操作强度，也减少了洗涤操作过多而给实验结果带来的误差影响。本发明不局限于酶标记和化学发光标记方法，其他标记方法也可以运用本发明的方法进行测定。并且，本发明也不局限于双抗体(原)夹心法，间接法与竞争法也可以运用本发明的方法进行测定。同时，所述基于实验标本与标记抗体溶液两者间密度差异而产生的排溢分层的现象还可用于除二步法以外的有二步以上免疫反应步骤的其它免疫学实验中，从而对其方法进行简化。因此本发明可以值得推广应用，具有很强的实用性。权利要求一种改进的标记免疫测定的方法，其步骤包括1)向已包被已知抗体或抗原的固相载体表面加入含待测抗原或抗体的待测标本，进行免疫反应；2)向步骤1)的已发生免疫反应的固相载体中加入密度大于上述待测标本溶液的标记抗体或抗原溶液，静置分层使标记抗体或抗原覆盖于固相载体表面，使标记抗体或抗原与固相载体表面的对应免疫物质进行免疫反应；3)洗去固相载体表面未发生免疫结合的物质；4)根据常规方法生成检测信号，并据此测定待测标本中靶抗原或抗体的含量。2.根据权利要求1所述的改进的标记免疫测定的方法，其特征在于所述常规方法采用酶促显色的方法，该方法进行酶促显色反应后，用酶标记比色计比色，并根据对照或标准曲线孔测值判读实验结果。3.根据权利要求1所述的改进的标记免疫测定的方法，其特征在于所述常规方法采用化学发光显色的方法，该方法进行化学发光显色反应后，用化学发光测定仪比色，并根据对照或标准曲线孔测值判读实验结果。4.根据权利要求1所述的改进的标记免疫测定的方法，其特征在于所述标记抗体或抗原溶液为常规标记溶液中加入惰性有机与无机分子，使标记溶液的密度大于待测标本溶液。5.根据权利要求1所述的改进的标记免疫测定的方法，其特征在于所述标记抗体或抗原溶液的粘度能使标记溶液与待测标本溶液分层。6.根据权利要求1所述的改进的标记免疫测定的方法，其特征在于步骤3)所述的洗涤方法为洗3-6次，每次洗1-5分钟。全文摘要本发明提供了一种改进的标记免疫测定的方法，其步骤包括向已包被已知抗体或抗原的固相载体表面加入待测标本，进行免疫反应；向上述固相载体中加入密度大于待测标本溶液的标记溶液，静置分层使标记物质覆盖于固相载体表面，并在固相载体表面进行免疫反应；洗去固相载体表面未发生免疫结合的物质；根据常规方法进行显色，测定待测标本中靶物质的含量。本发明将二步法标记免疫测定中所需要的二步洗涤简化为一步洗涤，使实验过程简化，并减少了洗涤操作自身的负面影响。本发明还保留二步法中两步免疫反应依序进行的特征，从理论上根本消除发生Hooks效应的可能性。本发明所用各项实验条件、实验仪器等都基本与常规的测定方法相同，具有很强的实用性。文档编号G01N21/76GK101806797SQ20101012807公开日2010年8月18日申请日期2010年3月17日优先权日2010年3月17日发明者张春燕,李佩珊,李方和,陈妍申请人:华中科技大学同济医学院附属同济医院