一种拉曼可视化快速检测藻毒素高灵敏纸的制备方法及检测方法
【专利摘要】一种拉曼可视化快速检测藻毒素高灵敏纸的制备方法及检测方法，属于纳米材料与生物化学检测【技术领域】。本发明包括：藻毒素抗体的制备，球形及星形纳米粒子的制备、具有拉曼信号的金标抗体的制备、纸基拉曼试纸条的组装以及在藻毒素检测中的应用等步骤。本发明提供了一种高灵敏纸基拉曼可视化快速检测藻毒素的方法，通过合成具有拉曼信号的纳米粒子，并标记藻毒素抗体，用于免疫金标记技术（ICA）结合拉曼检测仪器对藻毒素进行高灵敏检测。
【专利说明】一种拉曼可视化快速检测藻毒素高灵敏纸的制备方法及检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种拉曼可视化快速检测藻毒素高灵敏纸的制备方法及检测方法，属于纳米材料与生物化学检测【技术领域】。
【背景技术】
[0002]微囊藻毒素(MC)，即微囊藻素。从蓝 藻水华中分离出的多肽毒素，具有水溶性、耐热性和相当的稳定性，加热煮沸都不能将毒素破坏；自来水处理工艺的混凝沉淀、过滤、加氯、氧化、活性炭吸附等也不能将其完全去除。微囊藻素易溶于水、甲醇或丙酮，不挥发，抗PH变化。化学性质相当稳定，自然降解过程十分缓慢。MC在去离子水中可保持稳定状态长达27d，在灭囷的河水中可保持稳定12d，而在普通河水中7d以内即会降解。它对蛋白憐Ife酶I和蛋白磷酸酶2A具有抑制作用，因此与肿瘤促进作用有直接关系。国内外研究最多的主要是MC-LR和MC-RR。MC的毒性和其结构相关，Adda是表达MC毒性的必需基团。研究表明，MC-LR的急性毒性最强，MC-YR次之，MC-RR最弱。在已报道的MC的80多种异构体中，MC-LR是最为常见的种类，且相关的毒理学研究最多，腹腔注射小白鼠的LD50值一般在50-60 μ g/kg (体重)，因此，MC-LR的毒性可与化学类有机磷神经毒剂相当。
[0003]国内外的微囊藻毒素检测标准世界卫生组织(WHO)推荐的饮水中的藻毒素标准为l.0ppb。各国已有饮水中的藻毒素含量标准一般都为微囊藻毒素LR的含量，加拿大健康组织规定饮水中可接受的藻毒素标准为0.5ppb，澳大利亚学者建议Ippb的含量为安全饮用水的上限。中国微囊藻毒素的标准检测国标主要有:《饮用水的有机标准》GB/T5750.8-2006、《水中微囊藻毒素的测定》GB/T20466-2006、《地表水环境质量标准》GB3838-2002、《地表水和污水监测技术规范》HJ/T91-2002。随着中国水体的富营养化程度逐渐加剧，蓝藻水华和赤潮的发生逐渐增加。80%的蓝藻水华都可以检测出次生代谢产
物---微囊藻毒素(microcystins, MCs),它对水体环境和人群健康的危害已成为全球关注
的重大环境问题之一。
[0004]传统检测方法采用物化分析方法，其中最主要的是:高效液相色谱法(HPLC)。液质联用法(LC-MS)，HPLC-电喷雾电离质谱法(HPLC-ES1-MS)和超高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS/MS )。这些方法需要昂贵的仪器和专业的操作人员，不适合用于现场检测。
[0005]免疫化学法是目前比较有前景的可以快速、灵敏的检测藻毒素的方法。免疫分析技术是指基于抗原和抗体之间的相互作用检测各种物质(如药物、激素、蛋白质、细菌等)的分析方法。抗原抗体之间的相互作用是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应，抗原抗体分子之间存在着结构互补性和亲和性，依靠非共价键(静电引力、分子间作用力、氢键结合力和疏水作用)的相互作用进行结合，且抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡。利用微囊藻毒素诱发免疫反应产生抗体，利用抗体对抗原的特异性识别来对各种毒素进行检测。以免疫技术为基础，微囊藻毒素的免疫化学法包括酶联免疫吸附法、放射免疫分析法、免疫亲和色谱法、胶体金法及免疫传感器法等。这类方法灵敏度较高、样品处理简单，便于操作，其检测限低于WHO水平，被认为是较有发展前景的方法。
[0006]免疫金标记技术(ICA技术)具有独特的优点，已成为第四大免疫标记新技术,是标记免疫分析方法的一种。胶体金免疫层析法的原理是将抗体标记到纳米金粒子上利用抗原抗体的反应对目标物质达到定量检测。由于具有简便、快速、低成本等优点，已经在激素检测、药物监管、癌症诊断等领域得到广泛应用。可以通过肉眼对颜色深浅做出判断，但是缺点是灵敏度低，基质干扰大。同时结合读数仪器可以达到半定量的检测，但是目前的读数仪器是基于灰度分析，对灰度值的细小差别分辨率低。
[0007]近些年表面增强拉曼光谱免疫分析技术(SERSIA)作为一种灵敏度极高的标记免疫分析方法逐渐得到深入的研究和开发。1974年，Fleischinann第一次发现了表面增强拉曼散射效应(Surface^enhanced Raman Scattering, SERS),发现吸附在粗糖银电极表面的吡啶分子的Raman信号比溶液中的吡啶拉曼信号增强了约IO6倍，即100万倍；而1977年，VanDuyne和Creighton研究小组通过实验研究和理论计算确认了表面增强拉曼散射效应的存在。SERS的发现极大地激发了人们对拉曼光谱的研究兴趣，因为它有效地解决了Raman光谱在表面科学和痕量分析中存在的低灵敏度问题。目前，随着新型纳米增强材料和增强基片的引入，SERS已经可以提供非破坏性和低至单分子水平的超灵敏检测，因此广泛地应用于化学和生物传感器、生物医学检测、痕量检测与分析、细菌分析与细胞成像、环境监测等诸多领域。SERSIA就是将SERS的高灵敏度与免疫反应的高特异性相结合的新型分析方法，巧妙的将免疫分析技术、纳米技术与SERS三者有机结合，具有独特的优越性，比如灵敏度极高、不受水的干扰、拉曼谱峰宽度窄且不会粹灭等。
[0008]目前ICA技术和其他方法或材料联用已成为新的发展趋势和研究热点，但利用信标分子在纳米粒子表面增强拉曼的特点结合ICA反应的原理进行高灵敏的检测仍处在初步阶段。在本发明项目中 ，通过合成具有拉曼信号的纳米粒子，并标记藻毒素抗体，用于ICA技术结合拉曼检测仪器对藻毒素进行高灵敏检测。
【发明内容】
[0009]本发明的目的是提供一种拉曼可视化快速检测藻毒素高灵敏纸的制备方法及检测方法。利用表面增强拉曼技术结合ICA技术，实现对水中污染物MC-LR的高灵敏检测。
[0010]本发明的技术方案，一种拉曼可视化快速检测藻毒素高灵敏纸的制备方法，
包括如下步骤:
1、合成藻毒素的抗原，制备能够结合藻毒素的抗体；2、制备不同尺寸和形状的金纳米粒子；3、金纳米粒子表面修饰信标分子和抗体；4、组建藻毒素快速拉曼检测试纸条；5、通过拉曼信号建立藻毒素浓度依赖曲线；6、环境样品的检测。
[0011]具体步骤如下:
(I)藻毒素单克隆抗体的制备:合成藻毒素的免疫原和弗氏佐剂混合后，刺激小鼠产生针对藻毒素的抗体。通过小鼠脾脏细胞和SP20细胞在PEG的作用下进行融合，得到能够分泌藻毒素单克隆抗体的细胞株，通过体外诱生的方法制备腹水，纯化得到藻毒素单克隆抗体。
[0012](2)球形及星形纳米粒子的制备:一定浓度的单宁酸和柠檬酸三钠混合液加入到四氯合金酸的水溶液中，60°C水浴搅拌,制备IOnm, 20nm, 30nm球形金纳米粒子。采用种子生长法合成10nm，20nm，30nm星形纳米粒子，采用透射电镜、紫外分析仪等测试描述的基本性质。
[0013](3)金纳米粒子表面修饰信标分子和抗体:以球形金纳米粒子为例，首先将拉曼信标分子修饰在金纳米粒子表面，然后再修饰抗体，并用牛血清白蛋白封闭剩余位点。
[0014]首先将拉曼信标分子4-氨基苯硫酚和金纳米粒子过夜反应，利用4-氨基苯硫酚的巯基和金表面形成稳定的金硫键；过夜反应后，离心，用PH8.0的硼酸缓冲液重悬，再加入藻毒素抗体，使得藻毒素抗体终浓度为lOPg/mL ;振荡标记2h，加入牛血清白蛋白封闭未反应的位点2h，终浓度0.5% ;离心，后加入PBS重悬到原始体积；
(4)组建藻毒素快速拉曼检测试纸条:将制备好的具有拉曼信号的金标记抗体，均匀浸泡到金标结合垫上，然后烘干；在塑料底板上顺序组装样品垫玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜和吸水纸，将金标结合垫组装到塑料底板上使之在样品垫玻璃纤维膜和硝酸纤维素膜之间相互叠加Imm ;在组装好的试纸条的硝酸纤维素膜上用喷膜仪器喷好检测线(MC-LR和牛血清白蛋白的偶联物)和质控线(羊抗鼠二抗)后烘干2h ;然后将组装好的片状试纸条在切条仪器剪切成3_的试纸条，组装到塑料卡壳中，单个封装，干燥保存。
[0015]所述拉曼可视化快速检测藻毒素高灵敏纸的检测方法:
(5)通过拉曼信号建立藻毒素浓度依赖曲线:在目标物存在的条件下，由于抗原抗体的竞争关系会使得拉曼信号降低，在这个原理的基础上，实现对藻毒素的高灵敏检测。采用拉曼光谱仪器等测试描述的基本性质。
[0016]添加不同浓度的藻毒素，观察对拉曼信号的影响，从而建立目标物MC-LR与拉曼信号的标准曲线。将不同浓度的藻毒素标准品滴加到试纸条上的样品孔中，5min后，在拉曼光谱仪器上进行检测；所使用藻毒素标准品浓度依次为:0、0.05ng/mL、0.lng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、Ing/mL、2ng/mL、5ng/mL,对所得到的拉曼谱图进行鉴定,得到不同藻毒毒浓度下的拉曼光谱图，并根据信号分子的特征峰值得到标准曲线；
(6)实际样品检测方法的确立:检测自来水和湖水实际样品。应用所开发的拉曼试纸条对自来水和湖水中的藻毒素污染情况进行检测，并根据标准曲线进行对比，得到检测样品中藻毒素的浓度。
[0017]本发明的有益效果:本发明试纸条利用拉曼高灵敏检测技术可以对环境污染物藻毒素进行高灵敏检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1藻毒素单克隆抗体的制备过程。
[0019]图2制备不同尺寸和形状的金纳米粒子。
[0020]图3金纳米粒子表面修饰拉曼信标分子和抗体示意图。
[0021]图4基于试纸条拉曼信号的藻毒素检测标准曲线。
【具体实施方式】
[0022](I)藻毒素单克隆抗体的制备:将合成藻毒素的免疫原和弗氏佐剂混合后，刺激小鼠产生针对藻毒素的抗体，五次免疫后通过尾部采集血检测血清中是否含有藻毒素的抗体。将能够产生藻毒素抗体的小鼠冲免三天后，处死，无菌取出脾脏，小鼠脾脏细胞和SP20细胞在PEG的作用下进行融合，7天后，用间接竞争酶联免疫法进行筛选，得到能够分泌藻毒素单克隆抗体的细胞株，然后经过三个单个细胞的亚克隆后通过体外诱生的方法制备腹水，纯化得到藻毒素单克隆抗体。如图1。
[0023](2)球形和星形纳米粒子的制备:
球形纳米粒子:洁净的三口烧瓶中加入42mL超纯水，加入2.6mL 0.2%氯金酸溶液，搅拌并加热至沸腾，10分钟后加入0.9mL 1%柠檬酸三钠溶液，溶液从无色变为红色后，停止加热，继续搅拌20分钟；透射电镜显示平均粒径为25nm ；
星形纳米粒子:首先制备种子溶液:4mL ImM的HAuCl4溶液，煮沸后，往其中加入0.6mL1%柠檬酸钠溶液，加热反应15min。然后，制备星状金纳米颗粒:10mL 0.25mM HAuCl4 (混有ΙΟμL IM的HCl )，再加入100μL种子溶液，搅拌，加入100μL AgNO3 (0.5~3Μ)搅拌30s，离心5min (300(T5000r/min)。如图 2。
[0024]( 3 )纳米粒子表面修饰拉曼信标分子和抗体:首先将拉曼信标分子4-氨基苯硫酚和金纳米粒子过夜反应，利用4-氨基苯硫酚的巯基和金表面形成稳定的金硫键。由于4-氨基苯硫酚在金的表面会有表面增强拉曼 效应，修饰上4-氨基苯硫酚的金纳米粒子会有强烈的拉曼信号。过夜反应后，离心，用PH8.0的硼酸缓冲液重悬，再加入藻毒素抗体，使得终浓度为lOPg/mL。振荡标记2h，加入牛血清白蛋白封闭未反应的位点2h，终浓度0.5%。离心，后加入PBS重悬到原始体积。如图3。
[0025](4)组建藻毒素快速拉曼检测试纸条:将制备好的具有拉曼信号的金标记抗体，均匀浸泡到金标结合垫上，然后烘干。同时在塑料底板上依次组装装样品垫玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜和吸水纸，将藻毒素抗原和羊抗鼠二抗喷到硝酸纤维膜上烘干2h。然后将金标结合垫组装到塑料底板上使之在硝酸纤维素膜和样品垫玻璃纤维膜之间相互叠加1mm。将组装好的片状试纸条在切条机器上切成3_每条的单个试纸条。组装到塑料卡壳中，单个封装，干燥保存。
[0026](5)通过拉曼信号建立藻毒素浓度依赖曲线:将不同浓度的藻毒素标准品滴加到试纸条上的样品孔中，5 min后，在拉曼光谱仪器上进行检测。
[0027]本发明所使用的藻毒素标准品浓度依次为:0、0.05ng/mL、0.lng/mL>0.2ng/mL>
0.5ng/mL、Ing/mL、2ng/mL、5ng/mL,对所得到的拉曼谱图进行鉴定,可以得到不同藻毒素浓度下的拉曼光谱图，并根据信号分子的特征峰值(1087cm-l)得到标准曲线。如图4。
[0028](6)实际样品检测方法的确立:应用所开发的拉曼试纸条对自来水和湖水中的藻毒素污染情况进行检测，并根据标准曲线进行对比，得到检测样品中藻毒素的浓度。
【权利要求】
1.一种拉曼可视化快速检测藻毒素高灵敏纸的制备方法，其特征在于步骤为: (1)制备具有拉曼信号的金标记抗体:首先将拉曼信标分子4-氨基苯硫酚和金纳米粒子过夜反应，利用4-氨基苯硫酚的巯基和金表面形成稳定的金硫键；过夜反应后，离心，用PH8.0的硼酸缓冲液重悬，再加入藻毒素抗体，使得藻毒素抗体终浓度为lOPg/mL ;振荡标记2h，加入牛血清白蛋白封闭未反应的位点2h，终浓度0.5% ;离心，后加入PBS重悬到原始体积； (2)试纸条的制备:将步骤(I)制备好的具有拉曼信号的金标记抗体，均匀浸泡到金标结合垫上，然后烘干；同时在塑料底板上依次组装样品垫玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜和吸水纸，将金标结合垫组装到塑料底板上使之在样品垫玻璃纤维膜和硝酸纤维素膜之间相互叠加Imm ;将藻毒素抗原MC-LR-BSA及羊抗鼠二抗依次喷到硝酸纤维膜上烘干2h，作为检测线及质控线； 然后将组装好的片状试纸条在切条机器上切成宽3_每条的单个试纸条，组装到塑料卡壳中，单个封装，干燥保存。
2.用权利要求1所述拉曼可视化快速检测藻毒素高灵敏纸的检测方法，其特征在于步骤为: (1)标准曲线的绘制:将不同浓度的藻毒素标准品滴加到试纸条上的样品孔中，5min后，在拉曼光谱仪器上进行检测；所使用藻毒素标准品浓度依次为:0、0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、lng/mL、2ng/mL、5ng/mL,对所得到的拉曼谱图进行鉴定,得到不同藻毒毒浓度下的拉曼光谱图，并根据信号分子的特征峰值得到标准曲线； (2)实际样品检测方法的确立:应用所开发的拉曼试纸条对自来水和湖水中的藻毒素污染情况进行检测，并根据标准曲线进行对比，得到检测样品中藻毒素的浓度。
【文档编号】G01N21/65GK104007264SQ201410227553
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年5月27日 优先权日:2014年5月27日
【发明者】徐丽广, 胥传来, 邢常瑞, 匡华, 马伟, 刘丽强, 宋珊珊, 吴晓玲 申请人:江南大学