用于测试高藻水生物毒性的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及环境水体的检测方法，尤其是涉及一种用于测试高藻水生物毒性的方法，该方法运用酿酒酵母进行检测，建立了准确检测高藻水水样生物毒性的方法，本方法最终结果准确、稳定、重现性好，是对现有方法的有效改进。
【背景技术】
[0002]目前，日趋严重的水体富营养化已成为全球性的环境问题之一。当在夏、秋季，湖泊、水库、池塘等有时因一些蓝藻大量繁殖形成水华，给人类带来很大危害。高藻水中主要含有蓝绿藻，己知的蓝绿藻中有40余种可产生毒素毒素，而同一藻株也可产生多种不同的毒素。此类毒素具有水溶性，长期摄入会对人体造成危害。我国目前常用的水处理工艺难以将其彻底去除，使人们的身体健康受到威胁。
[0003]目前采用藻类毒素的毒性检测通常采用生物检测法，如小鼠口服或注射来间接衡量毒性，毒性强弱用半致死剂量表示。此外还有用无脊椎动物如虾、贝、水蚤及其卵进行毒性评价的研究，以发光细菌进行毒性试验也有报道。目前的方法可较粗略地判断藻提取物是否有急性毒性，灵敏度较低，毒素消耗量大，需要大量的动物试验品，存在伦理问题，并且只能检测总的毒性，不能检测出细胞凋亡和坏死，对慢性毒性缺乏定量评价。。
【发明内容】
[0004]本发明的目的就是为了解决现有生物毒性检测方法中存在结果粗略，灵敏度较低，毒素消耗量大，需要大量的动物试验品等问题，提供一种用于测试高藻水生物毒性的方法。
[0005]为解决上述技术问题，本发明的实施方式提供了一种用于测试高藻水生物毒性的方法，该方法中，将酿酒酵母菌活细胞培养于固体培养基，再挑单克隆接种于5%Yro液体培养基中，振荡培养至对数期;分别加入磷酸缓冲液(PBS)为空白样品A，加入高藻水样为检测样品B，放置于混匀器上震荡24小时，PBS洗涤细胞二次后分别配成浓度为IX 105-1X106cells/mL细胞悬液；加入5yg/mL Annexin V-FITC混勾后，再加入5yg/mL碘化丙啶(PI)混匀;室温、避光、反应5-15min;在1小时内，用流式细胞术检测死细胞、活细胞和凋亡细胞的比例，流式细胞术中激发波长Ex = 488nm;发射波长Em = 530nm;将样品B的凋亡率和死亡率对照空白样品A，即可判定水质毒性。
[0006]进一步，用于测试高藻水生物毒性的方法，包括如下步骤:
[0007]S1.含5 % YPD和1.5 %琼脂固体培养基灭菌后加入酿酒酵母菌活细胞，YPD培养基与酿酒酵母菌菌种液体积比为1:150，待长出克隆后，再挑单克隆接种于5%Yro液体培养基中，置于恒温气浴培养箱中培养，180-250rpm，25-28°c，振荡培养过夜。取培养至对数期的菌种液待用，菌种液中0D值1.5-1.8;
[0008]S2.取0D值1.5-1.8菌种液，分别加入磷酸缓冲液(PBS)为空白样品A，加入高藻水样为检测样品B，放置于混匀器上震荡24小时；
[0009]S3.将样品A和B用PBS洗涤细胞二次，并分别配成浓度为1 X 105_1 X 106cellS/mL细胞悬液；
[0010]S4.A、B样品均加入5yg/mL Annexin V-FITC混匀后，再加入5yg/mL碘化丙啶(PI)，混匀;室温、避光、反应5-15min;在1小时内，进行流式细胞仪检测；
[0011]S5.用流式细胞术(激发波长Ex = 488nm;发射波长Em = 530nm)检测死细胞、活细胞和凋亡细胞的比例；
[0012]S6.结果计算:将样品B的凋亡率和死亡率对照空白样品A，即可判定水质毒性。
[0013]与现有技术相比，本发明具有如下有益效果:
[0014](1)酿酒酵母作为一种模式生物，它与一些复杂的生命形式具有很多相同的生命行为，特别在细胞循环控制、减数分裂和DNA修复方面与人类基因具有高度同源性，它具有易操作、增殖周期短、培养基简单廉价的优点，因此可用其细胞的凋亡率和死亡率简便、可靠的判定水质毒性。
[0015](2)能定量测定细胞凋亡率和坏死率，结果准确、稳定、重现性好，能更细致的判断高藻水生物毒性。
[0016]该方法运用酿酒酵母针对藻类毒素进行生物毒性检测，最终结果准确、稳定、重现性好，影响因素少，是对现有方法的有效改进，具有较高的实用价值和应用潜力。
【附图说明】
[0017]图1为用于测试高藻水生物毒性的方法的毒性检测结果示例图。
【具体实施方式】
[0018]为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的各实施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施方式中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本申请各权利要求所要求保护的技术方案。
[0019]本发明中用于测试高藻水生物毒性的方法应用于lOyg/mL藻毒素(MC-LR)生物毒性检测:
[0020](1)将lml酿酒酵母菌菌种液加入5%YPD和1.5%琼脂固体培养基培养基中，其中接种假丝酵母菌菌种液浓度，以0D值计，在1.5以上为宜，置于恒温气浴培养箱中培养，待长出克隆后，再挑单克隆接种于5%Yro液体培养基中，150-200rpm，25-28°C，振荡过夜培养至对数期(0D值在1.5-1.8左右)备用。
[0021 ] (2)配制lOyg/mL藻毒素(MC-LR)标准样品溶液模拟高藻水样。取0D值1.5-1.8菌种液5mL，分别加入5mL磷酸缓冲液(PBS)为空白样品A，加入5mL模拟高藻水样为检测样品B，放置于混匀器上震荡24小时。
[0022](3)将样品A和B用PBS洗涤细胞二次，并分别配成浓度为1 X 105_1 X 106cellS/mL细胞悬液；
[0023](4)A、B样品均加入5yg/mL Annexin V-FITC混匀后，再加入5yg/mL碘化丙啶(PI)，混匀;室温、避光、反应5-15min;在1小时内，进行流式细胞仪检测。
[0024](5)用流式细胞术(激发波长Ex = 488nm;发射波长Em = 530nm)检测死细胞、活细胞和凋亡细胞的比例。
[0025]图1是按上述方法检测的结果示意图。
[0026]将上述方法应用于模拟高藻水的水质生物毒性检测，得出酵母细胞凋亡率为10.34%，坏死率为 67.41 %。
[0027]本发明将酿酒酵母细胞作为生物标志物进行高藻水的生物毒性评价，实现利用酵母细胞凋亡率和坏死率定量化检测高藻水生物毒性，提高水质生物毒性评价的灵敏性和准确性，为高藻水体污染提供预警技术支持，保障供水水质安全。
[0028]本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。
【主权项】
1.用于测试高藻水生物毒性的方法，其特征在于，该方法中，将酿酒酵母菌活细胞培养于固体培养基，再挑单克隆接种于5 %Yro液体培养基中，振荡培养至对数期;分别加入磷酸缓冲液为空白样品A，加入高藻水样为检测样品B，放置于混匀器上震荡24小时，PBS洗涤细胞二次后分别配成浓度为1 X 105-1 X 106cells/mL细胞悬液;加入5yg/mL Annexin V-FITC混匀后，再加入5yg/mL碘化丙啶混匀；室温、避光、反应5_15min;在1小时内，用流式细胞术检测死细胞、活细胞和凋亡细胞的比例，流式细胞术中激发波长Ex = 488nm;发射波长Em =.530nm ；将样品B的凋亡率和死亡率对照空白样品A，即可判定水质毒性。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤: S1.含5%YPD和1.5%琼脂固体培养基灭菌后加入酿酒酵母菌活细胞，YPD培养基与酿酒酵母菌菌种液体积比为1:150，待长出克隆后，再挑单克隆接种于5%YPD液体培养基中，置于恒温气浴培养箱中培养，180-250rpm，25-28°C，振荡培养过夜，取培养至对数期的菌种液待用，菌种液中OD值1.5-1.8; S2.取OD值1.5-1.8菌种液，分别加入磷酸缓冲液为空白样品A，加入高藻水样为检测样品B，放置于混匀器上震荡24小时； S3.将样品A和B用PBS洗涤细胞二次，并分别配成浓度为1X 105-1 X 106cells/mL细胞悬液； S4.A、B样品均加入5yg/mL Annexin V-FITC混匀后，再加入5yg/mL碘化丙啶(PI)，混匀;室温、避光、反应5-15min;在1小时内，进行流式细胞仪检测； S5.用流式细胞术检测死细胞、活细胞和凋亡细胞的比例，流式细胞术中激发波长Ex=.488nm ；发射波长 Em = 530nm ； S6.结果计算:将样品B的凋亡率和死亡率对照空白样品A，即可判定水质毒性。
【专利摘要】本发明公开了用于测试高藻水生物毒性的方法，其包括：酿酒酵母菌首先培养于含5％YPD和1.5％琼脂固体培养基，待长出克隆后，再挑单克隆接种于5％YPD液体培养基中，180-250rpm，25-28℃，振荡培养过夜；取OD值1.5-1.8菌种液，分别加入磷酸缓冲液为空白样品A,加入高藻水样为检测样品B，放置于混匀器上震荡2小时；将样品A和B用PBS洗涤细胞二次，并分别配成浓度为1×105-1×106cel？ls/mL细胞悬液；A、B样品均加入5μg/mL？Annexin？V-FITC混匀后，再加入5μg/mL碘化丙啶，混匀；室温、避光、反应5-15min；在1小时内，进行流式细胞仪检测；用流式细胞术检测死细胞、活细胞和凋亡细胞的比例；将样品B的凋亡率和死亡率对照空白样品A，即可判定水质毒性。本发明为高藻水体污染提供预警技术支持，保障供水水质安全。
【IPC分类】C12Q1/02, G01N33/18, C12R1/865
【公开号】CN105483202
【申请号】CN201610049076
【发明人】刘新续
【申请人】上海艾耐基新能源科技有限公司, 上海艾耐基环保科技有限公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2016年1月25日