专利名称：一种指甲/趾甲毒物分析的前处理方法
技术领域：
本发明涉及一种对证物鉴定分析的前处理方法，尤其涉及一种应用在司法毒物鉴定中对指甲/趾甲鉴定的前处理方法。
背景技术：
指甲/趾甲的中毒药物分析正成为辅助其他生物检材证据的有力的一支，并有望在一些以往难以解决的涉毒药物事(案)件中发挥其有力的作用。包埋于指甲/趾甲内的毒药物需经前处理过程将其释放以供仪器分析。陈航等人在2003年03期《法医学杂志》上发表的“指(趾)甲在滥用药物分析中的研究现状及应用展望” 一文中，罗列了包括酸水解、碱消化和醇浸提在内的常用的指甲处理中水解/消化处理的办法。碱消化法通过热碱彻底破坏组织及细胞结构，会完全释放其内包埋的毒药物，高温和强碱环境会使得不稳定化合物分解。酸水解法能疏松组织结构，但由于大多数毒药物为碱性，酸性环境的质子化效应能帮助包埋于组织内的目标物进入提取液。指甲中存在大量原胶原构成的胶原层级，原胶原结构遇酸可迅速变性而交联沉积，维持固化形态。因此，酸水解后的指甲横断面层级结构较之未处理指甲更为明显，内外表面也较未处理前更为紧密。原胶原交联沉积后形成致密的网反而阻止其中包埋毒药物的释放。甲醇浸提依靠指甲组织的溶胀效应和甲醇本身对毒药物的溶解性进行提取，如电镜所见:由于溶胀效应内外表面均有一定的开裂，横断面的层级结构也由于溶胀效应产生的力而被破坏。但其耗时过长，难以适应于需要快速获取结果的法庭科学领域。综合目前常用处理方法，对指甲/趾甲分析的前处理过程大多套用毛发分析前处理过程。由于毛发与指甲/趾甲组成和结构方面的不同，简单的方法套用并不能保障方法的合理性和适用性。同时，指甲/趾甲分析的前处理过程大多采用酸、碱处理或有机溶剂浸泡等传统方法来达到提取效果，此类方法在不同条件下分别存在杂质影响多，对酸碱、热不稳定的目标化合物不适合，释放、提取效率低等缺点。
发明内容
本发明针对现有检验指甲/趾甲的前处理方法中存在的问题，提供一种全新的指甲/趾甲毒物分析的全处理方法，改善可指甲/趾甲的微观结构，大幅度提高了释放效率，避免了传统的酸碱等剧烈化学方法可能对指甲/趾甲中毒药物的影响。为了实现上述的目的，提供一种指甲/趾甲毒物分析的前处理方法，包括以下顺序步骤:步骤1:将待检验指甲/趾甲和撞子一同置于研磨容器内，将密封好的研磨容器置于低于-150°C的环境下研磨；步骤2:将研磨过的待检验指甲/趾甲和萃取剂混合形成混合物，所形成混合物利用超声波进行萃取。在上述提供的前处理方法中，其中所述研磨前还包括预冷处理，所述预冷处理时间优选控制在2 10分钟之间。
在上述提供的前处理方法中，其中所述研磨过程中撞子球磨的时间为1~5分钟，碰撞频率为:3~15 S—1。研磨过程循环进行2飞次，优选循环2次研磨过程。在上述提供的前处理方法中，其中所述超声波的频率为30~40ΚΗz。在上述提供的前处理方法中，其中所述萃取时环境温度为10~30°C。在上述提供的前处理方法中，其中所述萃取处理的时间为1~2小时。在上述提供的前处理方法中，其中所述萃取剂为甲醇、甲酸、乙醚、乙腈、乙酸铵、乙酸乙酯、氯仿中的一种或多种混合物，或者根据实际需求配置的萃取溶剂。其中，优选的萃取液是乙腈和乙酸铵/甲酸以70:30的体积比所组成的混合物，所述乙酸铵/甲酸由20mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸所组成。本发明提供的指甲/趾甲毒物分析的前处理方法，将冷冻研磨和超声波技术应用在对指甲/趾甲的前处理中，能提高前处理过程的释放效率，并保证前处理过程中毒药物稳定性，避免了传统酸碱等化学处理方法对指甲/趾甲中毒药物的影响。
图1是冷冻研磨后指甲结构的扫描电子显微镜图。图2是超声波处理后的指甲结构扫描电子显微镜图。图3是酸水解处理后的指甲结构扫描电子显微镜图。图4是甲醇浸泡处理后的指甲结构扫描电子显微镜图。图5是剪刀绞碎的指甲颗粒超声波处理前的扫描电子显微镜图。图6是剪刀绞碎的指甲颗粒超声波处理后的扫描电子显微镜图。
具体实施例方式本发明提供一种指甲/趾甲毒物分析的前处理方法，包括:(1)将待检验指甲/趾甲和撞子一同置于研磨容器内，将密封好的研磨容器置于低于-150°C的环境下研磨；(2)将研磨过的待检验指甲/趾甲和萃取剂混合形成混合物，所形成混合物利用超声波进行萃取。冷冻研磨是使用特制冷冻研磨仪进行的样品处理技术，其处理过程为将样品装入密闭的研磨容器浸入液氮，以电磁为动力，带动撞子在液氮温度环境下对样品粉碎研磨。由于，样品在低温下变脆而更易研磨，同时低温下的样品中所含的组成信息和生物活性得到较好保留。超声波处理是指使用超声波清洗仪对样品进行处理的技术，藉由超声波发生器及换能器使得仪器水槽中的液体流动而产生频率大于20KHz的机械纵波，其产生的巨大能量可用于多种样品处理。以下通过实施例对本发明提供的指甲/趾甲毒物分析的前处理方法做进一步说明，以便更好理解本发明创造的内容，但实施例的内容并不限制本发明创造要求保护的范围。样品采集
由于指甲和趾甲材质、结构及其他性质相同，故本实施例中仅以指甲作为检验对象。指甲收集来自本实验室无指甲疾病、无药物滥用史的健康志愿人员，使用洁净钢制指甲钳取其日常指甲，修剪碎片收集于洁净的离心管中，避光常温储存。样品毒物分析的前处理方法
将取得的指甲样品用十二烷基磺酸钠溶液清洗3次，用去离子水震荡，丙酮溶液冲洗。分别采用下列不同方法对清洗过的指甲进行分析前处理。并将下述各种方法处理后的指甲残片(或残留物)及 机械剪碎和冷冻球磨后的指甲粉末，放于通风橱内洁净表面于常温下干燥。干燥后的各样品置于已铺导电胶样品台上固定，用喷金镀膜仪喷金，置于扫描电镜工作仓中，尽量设定短的工作距离，在高真空环境下观察并作相应记录。实施例1
根据研磨管的大小取一定量待检验指甲和不锈钢撞子置入研磨管中(指甲用量在5飞Omg之间)，并用配套的盖子密封，将密封好的研磨管置于冷冻研磨仪中，并加入液氮。预冷3飞分钟后，球磨2分钟，撞子的碰撞频率控制在315^之间，并且循环研磨过程2 3次。将研磨得到的指甲粉末和LOmL由乙腈、乙酸铵和甲酸所组成的混合萃取剂中(萃取液中各物质的配比为:乙腈:20mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸溶液=70 30 v/v)，将萃取液和指甲混合物置于20±3°C的恒温环境下，用频率为40KHz的超声波，超声处理I小时。对照实验I
将待检验指甲机械剪碎，浸泡在ImL 10%氢氧化钠溶液中，在80°C下保温20分钟。对照实验2
将采集到指甲机械剪碎，浸泡在0.lmol/L盐酸中，在45°C下保温18小时。对照实验3
将采集到指甲机械剪碎，浸泡在2mL的HPLC级甲醇中，在40°C下保温24小时。对照实验4
将待检验指甲机械剪碎，浸泡在1.0mL由乙腈、乙酸铵和甲酸所组成的混合萃取剂中(萃取液中各物质的配比为:乙腈:20mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸溶液=70 30 v/v)，将萃取液和指甲混合物置于20±3°C的恒温环境下，用频率为40KHz的超声波，超声处理I小时。观察经过上述各方法处理后得到的溶液体系，发现实施例1的指甲样品溶液体系中，可见白色粉末弥散于整个溶液体系中，指甲粉末悬浊在溶液中，久置缓慢沉降。对照实验I的指甲样品在热碱中迅速被消解，整个溶液呈明黄色，左右晃动溶液有类似晃动胶水感觉。在对照实验2 4的指甲样品溶液体系中，溶液底部存有微白色至透明碎片，整个液体澄清透明。干燥上述各方法处理后的指甲样品，并通过扫描电子显微镜观察指甲表面情况。图1和图2分别是实施例1中冷冻研磨后指甲粉末结构超声波处理前后的扫描电子显微镜图(放大倍数分别为X 1200和X 1200)。从图中可以观察到，冷冻研磨后的指甲粉末大小约为10 μ m，指甲粉末呈球形。超声波处理后，微观上仍基本保持球形，无粉末碎裂成更小的片段或球状结构展开痕迹。对照实验I的指甲碎片，在碱消化后指甲显微结构被完全破坏，将产生胶状溶液体系铺展吹干后呈现土壤状。图3是酸水解处理后的指甲结构扫描电子显微镜图，从左到右分别显示了指甲的外表面、横断面和内表面，放大倍数分别为X160、X600和X 150。图4是甲醇浸泡处理后的指甲结构扫描电子显微镜图，从左到右分别显示了指甲的外表面、横断面和内表面，放大倍数分别为X160、X1200和X160。对照实验2和对照实验3的指甲碎片，经酸水解或醇浸泡后，指甲的外表面粗糙，多处表层结构翻起。指甲内表面的波纹状结构被破坏或消失，其中醇处理过后的指甲内表面可见开裂。酸水解后指甲的内部层级式的结构较正常指甲更为明显且略显紧致，醇浸泡后的层级结构模糊难以辨认。图5和图6分别是剪刀绞碎的指甲颗粒超声波处理前后的扫描电子显微镜图，放大倍数依次是X98和X98。从图中看到，对比实验4的指甲碎片使用剪刀机械性绞碎，指甲颗粒大小约为直径1mm，经超声处理后球形的颗粒呈被击碎状展开。实施例1中，将指甲冷冻研磨成为约为ΙΟμπι类球形颗粒粉末，有效的增大指甲粉末的比表面积，更多的比表面积意味着与提取溶剂更多的接触，大幅度增加了指甲中毒药物进入提取溶剂的机会，使释放效率增高。由于指甲为保护指端不受伤害而存在的致密及微弧形结构，使其质地较为坚硬，难以使用普通剪刀绞碎至足够小颗粒。使用剪刀机械性绞碎指甲时，每份指甲平均花费10分钟绞碎至Imm左右颗粒且极为费力，冷冻研磨约花费同样的时间下提高指甲粉末比表面积约100倍。此外，机器研磨可保证颗粒大小的均匀，同时低温能有效保证处理过程中指甲内毒药物的稳定性。超声波处理产生的空泡效应能将指甲的组织间隙撕开形成一空泡，此空泡会随周围介质的振动而瞬间被周围的液体或气体填充。如果被填充的是液体，则由于强大的吸引力造成液体撞击指甲组织面儿产生大量的固液物质交换。如果被填充的是气体，由气体的膨胀效应能产生较大的切向力促使更多组织间隙被拉开。对依靠死细胞和角蛋白的堆积力层叠起来的指甲结构，空泡效应与机械效应产生的较大的切相力，足以撕裂组织间隙造成颗粒被击碎展开的情形。组织间隙被撕开而增大的表面积和空泡效应，使得固液物质交换释放效率的增高。超声波处理带来的热效应将包埋于指甲内部的毒药物分子运动加速，有利于溶解入提取溶剂，但同时易造成超声水槽内的水温过高，对温度敏感的毒药物会产生破坏作用，影响冷冻研磨带来的低温优势。故本实施例1中超声波处理的环境温度控制在20±3°C的恒温环境下。综上所述，本发明将冷冻研磨与超声波技术结合使用在指甲检材的前处理中，与传统的前处理方法相比，改善了指甲的微观结构，大大提高了释放效率，避免了酸碱等剧烈化学方法可能对指甲中毒药物的影响。同时整个前处理过程控制一定的温度，可保证毒药物的稳定性。冷冻研磨联合超声波前处理技术更适用于指甲中毒药物分析的需要。以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
权利要求
1.一种指甲/趾甲毒物分析的前处理方法，其特征在于，包括以下顺序步骤: 步骤1:将待检验指甲/趾甲和撞子一同置于研磨容器内，将密封好的研磨容器置于低于-150°c的环境下研磨； 步骤2:将研磨过的待检验指甲/趾甲和萃取剂混合形成混合物，所形成混合物利用超声波进行萃取。
2.根据权利要求1所述前处理方法，其特征在于，所述研磨前还包括预冷处理，所述预冷处理时间为2 10分钟。
3.根据权利要求1所述前处理方法，其特征在于，所述研磨过程中撞子球磨的时间为Γ5分钟，碰撞频率为3 15s—1。
4.根据权利要求3所述前处理方法，其特征在于，所述研磨过程循环进行2飞次。
5.根据权利要求1所述前处理方法，其特征在于，所述超声波的频率为3(Γ50ΚΗζ。
6.根据权利要求1所述前处理方法，其特征在于，所述萃取时环境温度为1(T30°C。
7.根据权利要求1所述前处理方法，其特征在于，所述萃取处理的时间为f2小时。
8.根据权利要求1所述前处理方法，其特征在于，所述萃取剂为甲醇、甲酸、乙醚、乙腈、乙酸铵、乙酸乙酯、氯仿中的一种或多种混合物。
9.根据权利要求8所述前处理方法，其特征在于，所述萃取液为乙腈和乙酸铵/甲酸以70:30的体积比所组成的混合物，所述乙酸铵/甲酸由20mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸所组成。
全文摘要
本发明提供一种指甲/趾甲毒物分析的前处理方法，包括(1)将待检验指甲/趾甲和撞子一同置于研磨容器内，将密封好的研磨容器置于低于-150℃的环境下研磨；(2)将研磨过的待检验指甲/趾甲和萃取剂混合形成混合物，所形成混合物利用超声波进行萃取。本发明提供的指甲/趾甲毒物分析的前处理方法，将冷冻研磨和超声波技术应用在对指甲/趾甲的前处理中，能提高前处理过程的释放效率，并保证前处理过程中毒药物稳定性，避免了传统酸碱等化学处理方法对指甲/趾甲中毒药物的影响。
文档编号G01N1/28GK103175716SQ20111042924
公开日2013年6月26日 申请日期2011年12月20日 优先权日2011年12月20日
发明者陈航, 向平, 孙其然, 沈敏 申请人:司法部司法鉴定科学技术研究所