专利名称：毒性测试的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种使用球状体(spheroid)的体外毒性分析方法。
球状体具有用作体外模型的潜力以测试不同浓度的化合物的毒性。在体外模型中应用球状体作为可重复的和可靠的毒性指示剂是使用活体动物的合意的替代物。
本发明人开发了细胞散布抑制测试(cell spreading inhibition test)，其基于当球状体生长于适当的表面并处于静态即没有摇动时所观察到的球状体细胞生长或球状体中细胞的“散布”。如图1所示，细胞从球状体表面生长。发现当球状体暴露于一定浓度的毒药时，细胞散布被抑制。细胞散布的抑制提供了毒性的一种指示剂。
本发明的第一个方面提供了一种体外毒性分析方法，其包含a)将球状体样品暴露于一种选定浓度的待分析的化合物；b)孵育所述球状体样品一段适当的时间；和c)观察是否发生了细胞散布抑制。
在选定的浓度，如果相对于没有暴露于待分析的化合物的对照球状体时，在样品中观察到所有球状体没有细胞散布，或只有非常有限的散布，则认为散布抑制是阳性(+)结果。然而，如果在样品中一或多个球状体中有可观察到的细胞散布，这个细胞散布抑制是阴性(-)结果。
当观察到部分散布，即样品中有一些可观察到的细胞散布，但不像对照中那样广泛，则在较高化合物浓度下重复分析以保证可以获得确定性的结果，即散布抑制阳性(+)结果。
当发生了球状体细胞散布抑制，这表明在选定的浓度，所述化合物对衍生了球状体样品的细胞类型具有毒性影响。
此处所有术语“球状体”指一种三维结构，典型地，其基本上是球形，其不是天然产生的，其组成为组织的或器官的或从细胞系形成的再聚集(re-aggregate)细胞——典型地含有103或更多的细胞——或是其组合。
此处的术语“组织”指具有共同功能的有组织的细胞的集合。术语“器官”指具有共同功能的有组织的“组织”的集合。术语“细胞系”指衍生自经过转化的或者是已经获得了连续分裂能力的细胞的连续细胞培养物。
“组织”或“器官”不需要十分完整以用于本发明，因为可将完整的组织或器官的部分(可以通过活组织切片获得)分解为单个细胞/小群的细胞，然后进行再聚集以形成用于本发明的球状体。
用于生产本发明所使用的球状体的细胞可以衍生自任何合适的组织来源，包括被感染的组织。对包含神经细胞的球状体(例如，脑球状体)，优选胎组织。对于包含其它细胞的球状体一般可以使用来自胚胎/胎和非胎的(例如成人来源的)组织。肝细胞是特别有用的，因为它们可以用于生产保留了某些肝脏特征例如白蛋白分泌、尿素分泌、葡萄糖分泌的球状体，因而可以在体外模拟肝中物质的代谢并用于研究一般的细胞毒性和特异的肝毒性作用。这是有用的，例如在确定特定的物质被肝代谢后是否可能是有毒性的和/或对肝细胞是有直接毒性的(即肝毒素)或影响一般的细胞功能性。
球状体可以，大体上从任何动物的任何所需的组织或器官通过分解组织或器官样品，优选分解为单个细胞或小群的细胞而产生。例如，对视网膜和脑组织而言，可以使用如用巴斯德吸液管(Pasteur pipette)通过温和研碎的机械分解。或者，可以使用酶消化法，例如，使肝细胞分离。
优选地，本发明的球状体衍生自哺乳动物组织或器官，如来自人、非人灵长类动物、犬类、啮齿类(包括大鼠和小鼠)或猪的组织或器官。或者，本发明的球状体可以衍生自鱼类的组织或器官。
也可以使用来自细胞系的细胞。这些可以最初培养为单层以产生更多的细胞；胰蛋白酶化可以用于单层细胞培养物的细胞分离。
本发明所用的球状体可以包含两种或多种不同的细胞类型，因而细胞散布抑制表明待测试的毒剂对组成球状体的所有的细胞类型都显示出了毒性影响。
本发明所用的球状体可以是新鲜制备的或可以通过解冻低温贮藏的球状体获得。可以使用如WO 98/35021所描述的方法低温贮藏球状体。
本发明的体外分析可以使用一系列不同的选定浓度的待分析化合物来进行，以提供估计的阈值浓度，在该浓度所述化合物对所述球状体细胞类型具有毒性。
通过使用相同的化合物和不同的球状体细胞类型进行本发明的分析，可以确定在什么浓度所述化合物对一种细胞类型有毒性，但对其它没有毒性。
图1A到1C显示了当生长在静止状态的表面时球状体细胞的散布；图2A到2C显示了在存在和不存在特异浓度的半乳糖胺时球状体的散布；图3A到3C显示了在存在和不存在特定浓度的心得安时球状体的散布；图4A到4C显示了在存在特定浓度的双氯芬酸(diclofenac)时球状体的散布；和图5A和5B显示了在存在特定浓度的扑热息痛时球状体的散布。
以下实施例中，使用了新鲜的肝或HepG2球状体。重复每个测试，以保证获得相同的结果，因而保证球状体细胞散布抑制测试是毒性的可信赖的指标。
制备肝球状体通过Seglen P.O.((1976)Preparation of isolated rat liver cells.MethodsCell Biol.13，29-38)中描述的并被Lazar，A.；Peshwa，M.V.，Wu，F.J.，Chi，C.M.，Cerra，F.B.，和Hu，W.S.((1995)在Extended liver-specificfunctions of procine hepatocyte spheroids entrapped in collagen gel.In VitroCell Biol Anim.31，340-346)改良的两步胶原酶灌注法从雄性Wistar大鼠的肝制备肝球状体。分离的肝细胞的存活率通过台盼蓝(trypan blue)染料排除法确定，即一份分离的肝细胞和等体积的台盼蓝染料(1.0％w/v的等张盐溶液)混合并在室温孵育最少5分钟。只有存活率高于80％的分离的肝细胞制备物用于制备肝球状体。细胞悬浮液用培养基(补充了5％FCS，200mM L-谷氨酰胺，2ng/ml的胰岛素，100U/ml青霉素和100μg/ml硫酸链霉素)稀释以达到5×105细胞/ml的细胞密度。稀释的细胞悬浮液分散在6孔板，3ml/孔。该板在37℃，5％CO2孵箱中的旋转摇床(New Brunswick)上孵育，开始以85rpm的速度摇24小时，随后是77rpm。在研究过程中(最多45天，但典型地为2-10天)，该板以此速度旋转。每隔一天，将每个孔的1.5ml旧的培养基用2.0ml新鲜的培养基置换。在研究的过程中一直进行培养基换液(最多45天，但典型地为2-10天)。
用这个方法制备的球状体具有统一的大小，典型地为170μm，其中超过80％在160-180μm的范围内。
制备HepG2球状体HepG2细胞系(白种人肝细胞癌细胞，得自ECACC)在75cm2的培养瓶中，在含有补充了10％FBS，200nM L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素和100μg/ml的链霉素(GibcoBrill)的MEM(Sigma)的培养基中，以102个细胞/ml的初始密度培养为单层细胞。铺满培养瓶的HepG2细胞通过胰蛋白酶分离并收集在一起以用台盼蓝染料排除法进行计数。细胞悬浮液用培养基(补充了5％FBS，200nM L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)稀释到1×106个细胞/ml细胞悬浮液。该细胞悬浮液铺在6孔板中，3ml/孔。该板在开始的24小时置于在37℃的CO2的孵箱中的83rpm的旋转摇床(New Brunswick)，然后旋转速度降至77rpm。体外培养6天(6 DIV culture)后，球状体准备待用。
实施例1将3到5个新鲜制备的球状体转移至24孔板的每个孔中，并暴露于不同浓度的半乳糖胺，详见表1和2。每个半乳糖胺浓度使用2个孔。球状体在补充了10-15％的FCS，200nM L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素和100μg/ml硫酸链霉素的肝细胞培养基(Sigma)中，并在37℃置于5％CO2条件下孵育，而将所述细胞暴露于半乳糖胺48小时后观察对球状体细胞散布抑制的作用。
表1使用新鲜肝球状体的SCSIT结果
表2使用新鲜的HepG2球状体的SCSIT结果
-表示没有观察到球状体细胞散布抑制；
+表示球状体细胞散布被抑制。
图2A显示旋转停止后48小时的一个对照肝球状体(没有暴露于半乳糖胺)。没有观察到球状体细胞散布抑制。图2B显示将肝球状体暴露于16mM浓度的半乳糖胺后48小时，没有观察到球状体细胞散布抑制。然而，图2C显示将肝球状体暴露于40mM浓度的半乳糖胺后48小时，球状体细胞散布被抑制。
从表1，可见半乳糖胺在20mM和更高的浓度抑制肝球状体细胞散布。
从表2，可见半乳糖胺在16mM和更高的浓度抑制HepG2球状体细胞散布。
实施例2新鲜制备的球状体暴露于不同浓度的心得安，详见表3和4，观察其对球状体细胞散布抑制的作用。
表3使用新鲜的肝球状体的SCSIT结果
表4使用新鲜的HepG2球状体的SCSIT结果
图4A显示肝球状体暴露于100μM浓度的双氯芬酸后48小时，没有观察到球状体细胞散布抑制。然而，图4B显示肝球状体暴露于1000μM浓度的双氯芬酸后48小时，球状体细胞散布被抑制。
从表5和6，可见1000μM和更高浓度的双氯芬酸抑制肝球状体和HepG2球状体细胞散布。
实施例4新鲜制备的球状体暴露于不同浓度的扑热息痛，详见表3和4，观察对球状体细胞散布抑制的作用表7使用新鲜的肝球状体的SCSIT结果
表8使用新鲜的HepG2球状体的SCSIT结果
-表示没有观察到球状体细胞散布抑制；+表示球状体细胞散布被抑制。
图5A肝球状体暴露于5mM浓度的扑热息痛后48小时，没有观察到球状体细胞散布抑制。然而，图5B显示肝球状体暴露于50mM浓度的扑热息痛后48小时，球状体细胞散布被抑制。
从表7和8，可见50mM和更高浓度的扑热息痛抑制肝球状体和HepG2球状体细胞散布。
总结从上述的实施例，清楚可见当球状体暴露于某种浓度的毒素时，细胞散布被抑制。这个作用使用新鲜的肝和HepG2球状体用所有4个选择的毒素都观察到了。因此，球状体细胞散布抑制是可靠的、可重复的和稳定的毒性指标。
权利要求
1.一种体外毒性分析方法，包含a)将一种球状体样品暴露于选定浓度的待分析的化合物；b)孵育所述球状体样品一段合适的时间；和c)观察是否发生球状体细胞散布抑制。
2.权利要求1的体外毒性分析方法，其中球状体细胞散布抑制表示，使用该选定的浓度时，所述化合物对所述球状体细胞具有毒性作用。
3.权利要求1或权利要求2的体外毒性分析方法，其中所述球状体细胞衍生自神经元细胞、肝细胞或视网膜细胞。
4.前述权利要求中任一项的体外分析方法，其中所述球状体样品衍生自哺乳动物细胞。
5.权利要求4的体外毒性分析方法，其中所述哺乳动物细胞是人类的细胞、啮齿类的细胞或猪的细胞。
6.权利要求4的体外毒性分析方法，其中所述哺乳动物细胞是非人类灵长类的细胞或犬类的细胞。
7.权利要求1至3中任一项的体外毒性分析方法，其中所述球状体样品衍生自鱼类的细胞。
8.前述权利要求中任一项的体外毒性分析方法，其中所述球状体细胞衍生自培养的细胞系。
9.前述权利要求中任一项的体外毒性分析方法，其中所述球状体样品包含一种以上的细胞类型。
全文摘要
一种体外毒性分析方法，其包含a)将一种球状体样品暴露于选定浓度的待分析的化合物；b)孵育所述球状体样品一段适当的时间；和c)观察是否发生了球状体细胞散布抑制。
文档编号G01N33/50GK1615438SQ03802197
公开日2005年5月11日 申请日期2003年1月14日 优先权日2002年1月14日
发明者温迪·珀塞尔, 许晋升 申请人:西英格兰布里斯脱大学