专利名称：一种微生物降解苯环的酶活测试方法
技术领域：
本发明涉及微生物全细胞催化过程中酶活的测试技术，具体为一种微生物降解苯 环的酶活测试方法。
背景技术：
含苯环类物质在化学工业中具有广泛的应用，因此形成的工业废水数量较多，且 苯环类物质对环境有一定毒害作用，对生物甚至有致癌致畸作用，因此，苯环类物质的降 解，是研究的热门课题。生物降解是污染物质降解常用的方法，苯环具有一定的生物降解 性，因此，微生物降解含苯环物质也有较多研究。含苯环物质的降解过程中，苯环的打开是评价降解情况的重要指标。因此，要评价 一种微生物对污染物的降解能力，考察其生物酶对苯环的降解速率是关键，也就是降解苯 环的酶活。现有酶活研究方法中，一般通过考察某个侧基发色团的变化来判断酶活力，但因 每种物质的发色团不同，导致这类测试方法不具有很好的普适性。在申请人检索的范围内， 有关直接采用苯环开环法来测定酶活的文献尚未见报道。
发明内容
针对现有酶活测试方法的局限性，本发明拟解决的技术问题是，提供一种微生物 降解苯环的酶活测试方法，该测试方法具有很好地普适性和直接性，且简便易行。本发明解决所述技术问题的技术方案是，设计一种微生物降解苯环的酶活测试方 法，该测试方法包括以下步骤
1.制作底物浓度与吸光度之间关系的标准曲线配制一系列不同含苯环浓度的底 物溶液，并在紫外分光光度计上进行全波长扫描，进而确定不同含苯环浓度的底物溶液的 最大吸收波长，然后在其最大吸收波长下测定不同含苯环浓度的底物溶液的吸光度，绘制 底物浓度与吸光度之间关系的标准曲线图，找出底物浓度与吸光度之间线性拟合度达到 0. 999以上的底物浓度范围，拟合得到用于计算降解过程中苯环含量变化的线性方程；所 述底物为含苯环的物质；
2.配制底物溶液根据待测活力的酶或菌悬液的催化条件，配制底物溶液；
3.催化反应将底物溶液和酶液预先分别加热到各自最适反应温度，然后将底物溶液 和酶液混合为反应液，在最适反应条件下，使之发生催化反应，并开始计时，经过催化反应 设定的时间后，取出反应液，迅速高温灭活，检测底物浓度变化；
4.测定反应液中的苯环含量将上述催化反应前后的反应液稀释相应倍数，使其吸光 度在所述线性方程范围内；稀释后的反应液在最大吸收波长下测试反应前后的吸光度，并 根据所述线性方程计算反应前后的底物浓度；
5.计算微生物降解苯环的酶活依据下述公式(1)，计算获得微生物降解苯环的酶
活
酶活 U= Δ C/M/AtX IO3(1)(1)式中，Δ C表示催化反应前后反应液中底物的浓度变化，单位为g/L ；M表示底物的 相对分子量，单位为g/mol，Δ t表示催化反应时间，单位为min ；IO3为各个量的单位与规定 酶活单位之间的校正量。本发明测方法采用菌悬液为催化介质，以含苯环物质为底物，通过催化降解过程 中苯环吸光度的变化，绘制出相对应的标准曲线，经过特定公式的计算，即可得出相应的酶 活数据。与现有技术相比，本发明测试方法对于含苯环的物质降解过程中酶活的检测具有 很好的普适性，适用于多数含苯环化合物的降解过程中酶活的直接测定，且测试过程简单， 不需要贵重仪器设备，非常适于实际测试使用。
图1是本发明微生物降解苯环的酶活测试方法一种实施例(对苯二甲酸浓度与 吸光度关系)绘制的曲线图2是本发明微生物降解苯环的酶活测试方法另一种实施例(原儿茶酸浓度与吸光 度关系)绘制的曲线图。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明测试方法作进一步说明
本发明设计的微生物降解苯环的酶活测试方法(简称测试方法)，该测试方法包括以下 步骤
1.制作含苯环底物(以下简称底物)浓度与吸光度之间关系的标准曲线配制一系列 不同浓度的含苯环物质溶液，并在紫外分光光度计上进行全波长扫描，进而确定不同浓度 的含苯环物质溶液的最大吸收波长，然后在其最大吸收波长下测定不同浓度的含苯环物质 溶液的吸光度，绘制底物浓度与吸光度之间关系的标准曲线图，找出底物浓度与吸光度之 间线性拟合度达到0. 999以上的底物浓度范围，拟合得到用于计算降解过程中苯环含量变 化的线性方程；
2.配制底物溶液根据待测活力的酶或菌悬液的催化条件，配制底物溶液；所述的催 化条件是指3-4g/L磷酸二氢钾和6-7g/L的磷酸氢二钠作缓冲溶液，维持体系稳定的pH值 =6. 8-7. 0，最后加入含苯环的底物，包括对苯二甲酸或原儿茶酸等，配成l-2g/L的溶液。研究表明，在所述催化反应液中，加入l_3g/L的酵母浸出粉作有机氮源，可有效 催进微生物对碳源的消耗速率，从而提高酶活。3.催化反应将底物溶液和酶液预先分别加热到各自最适反应温度(例如 37°C )，然后将底物溶液和酶液混合为反应液，在最适反应条件是指温度，转速振荡培养器 的转速等，例如37°C，200r/min下，使之发生催化反应，并开始计时，经过催化反应设定的 时间，例如30min后，取出反应液，迅速高温灭活，检测底物浓度的变化；
4.测定反应液中的苯环含量将上述催化反应前后的反应液稀释相应倍数，例如 50-100倍，使其吸光度在所述线性方程范围内；稀释后的反应液在最大吸收波长下测试反 应前后的吸光度，并根据所述线性方程计算反应前后的底物浓度。5.计算微生物降解苯环的酶活在本发明测试方法中，酶活的定义是1ml酶液 或菌悬液，在Imin时间内，降解Iymol含苯环物质中的苯环，定义为一个酶活单位U/ml。依据下述公式(1)，计算获得微生物降解苯环的酶活 酶活 U= Δ C/M/AtX IO3(1)
(1)式中，Δ C表示催化反应前后反应液中底物的浓度变化，单位为g/L ；M表示底物的 相对分子量，单位为g/mol，Δ t表示催化反应时间，单位为min ；IO3为各个量的单位与规定 酶活单位之间的校正量。本发明未述及之处适用于现有技术。下面给出本发明测试方法的具体实施例具体实施例仅是为了进一步详细说明本 发明，不构成对本发明申请权利要求的限制。实施例1
以对苯二甲酸为唯一碳源，杆菌F4降解对苯二甲酸的酶活。采用磷酸盐缓冲液(3g/L磷酸二氢钾和7g/L的磷酸氢二钠)配制浓度分别为1， 2，5，10，20，30，40mg/L的对苯二甲酸溶液(标准溶液)，在紫外分光光度计上对所配制 的对苯二甲酸溶液进行全波长扫描，确定其最大吸收波长在240nm，然后在240nm波长下， 测定所述不同浓度的对苯二甲酸溶液的吸光度，对应浓度-吸光度绘制的曲线图(参见图 1)，找出其线性拟合度达标(拟合度达到0. 99986)的浓度范围为l_40mg/L，拟合得到线性 方程(2):Y = 0.08342 +0.07584 XX，其中X代表对苯二甲酸浓度，Y代表紫外吸光度，线 性方程(2 )用于计算本例降解过程中苯环含量的变化。待测酶活的菌悬液的催化条件，需要加入3g/L磷酸二氢钾和7g/L的磷酸氢二钠 作缓冲溶液，维持体系稳定的PH值=6. 8，采用该缓冲溶液配制lg/L的对苯二甲酸溶液。将底物溶液灭菌后，加热到37°C，将离心后的菌体悬浮在灭菌后的溶液中，混合均 勻后，在37°C，200r/min下振荡反应，并开始计时，经过30min后，取出反应液，迅速95°C水 浴灭活5min，检测底物变化
将上述反应前后的反应液稀释50倍，使之在所述线性方程的浓度范围之内。稀释后的 溶液在240nm波长下，测试反应前后的吸光度分别为1. 607和1. 472。根据线性方程计算反 应前后对苯二甲酸的浓度分别为1. 004g/L和0. 915g/L ；将所得对苯二甲酸的浓度值代入 酶活公式(1)中，酶活U= Δ C/M/ Δ tX 103，其中，M为166. 13，Δ t为30，即得到该菌悬液 的酶活为U=O. 018。实施例2
补加酵母粉为有机氮源，杆菌F4降解对苯二甲酸的酶活。对苯二甲酸标准溶液的测定和对应浓度_吸光度绘制的曲线图同实施例1 (参见 图1)，拟合得到线性方程(2):γ = 0.08342 +0.07584 XX，其中，X代表对苯二甲酸浓度，Y 代表紫外吸光度，线性方程(2)可用于计算本例降解过程中苯环含量的变化。在催化反应液中加入酵母粉作有机氮源可有效催进微生物对碳源的消耗速率，从 而提高酶活。为了确定酶活的提高程度，向反应液中加入lg/L的酵母浸出粉，同时加入3g/ L磷酸二氢钾和7g/L的磷酸氢二钠作缓冲溶液，维持体系稳定的pH值=6. 8，最后加入对苯 二甲酸，配成lg/L的溶液。将底物溶液灭菌后加热到37°C，将离心后的菌体悬浮在灭菌后的溶液中，混合均 勻后，在37°C，200r/min振荡反应，并开始计时。经过30min后，取出反应液，迅速95°C水浴 灭活5min，检测底物变化。
5
将上述反应前后的反应液稀释50倍，使之在线性方程的浓度范围之内。稀释后的 溶液在240nm波长下测试反应前后吸光度分别为1. 607和1. 341。根据线性方程计算反应 前后对苯二甲酸浓度分别为1. 004g/L和0. 829g/L。代入公式(1 )，酶活U= Δ C/M/ Δ t · IO3,(其中M为166. 13，Δ t为30)得到菌悬 液酶活为U=0.035。与实施例1中结果比较发现，加入酵母粉可将菌悬液的酶活提高将近 1倍。实施例3
以原儿茶酸为唯一碳源，细菌TJ降解原儿茶酸的酶活。采用磷酸盐缓冲液(4g/L磷酸二氢钾和6g/L的磷酸氢二钠)配制浓度分别为1， 2，5，10, 20, 30, 40mg/L的原儿茶酸溶液，全波长扫描，确定其最大吸收波长在250nm， 在250nm波长下测定不同浓度溶液的吸光度，对应浓度-吸光度做出曲线图(参见图2)，找 出其线性拟合度达标(拟合度达到0. 99971)的浓度范围为l_40mg/L，拟合得到线性方程 (3):Y = 0. 07613 +0. 07579 X X，其中X代表原儿茶酸浓度，Y代表紫外吸光度，线性方程 (3)可用于计算降解过程中苯环含量的变化。待测酶活的菌悬液的催化条件需要加入4g/L磷酸二氢钾和6g/L的磷酸氢二钠作 缓冲溶液，维持体系稳定的PH值为7左右，因此，采用缓冲溶液配制2g/L的原儿茶酸溶液。将底物溶液灭菌后加热到37°C，将离心后的菌体悬浮在灭菌后的溶液中，混合均 勻后，在37°C，200r/min振荡反应，并开始计时。经过30min后，取出反应液，迅速95°C水浴 灭活5min，检测底物变化。将上述反应前后的反应液稀释100倍，使之在线性方程的浓度范围之内。稀释后 的溶液在250nm波长下测试反应前后吸光度分别为1. 592和1. 491。根据线性方程计算反 应前后对苯二甲酸浓度分别为2. 000g/L和1. 867g/L。代入公式(1)，酶活U= Δ C/M/ Δ tX103,(其中M为154. 12，Δ t为30)得到菌悬 液酶活为:U=0. 029。实施例4
补加酵母粉为有机氮源，细菌TJ降解原儿茶酸的酶活。原儿茶酸标准溶液的测定和对应浓度_吸光度绘制的曲线图同实施例3，拟合得 到线性方程(3):Y = 0.07613 +0.07579ΧΧ，其中X代表原儿茶酸浓度，Y代表紫外吸光度。 可线性方程(3)用于计算本例降解过程中苯环含量的变化。在催化反应液中加入酵母粉作有机氮源可有效催进微生物对碳源的消耗速率，从 而提高酶酶活。为了确定酶活的提高程度，向反应液中加入3g/L的酵母浸出粉，同时加入 4g/L磷酸二氢钾和6g/L的磷酸氢二钠作缓冲溶液，维持体系稳定的pH值为7左右，最后加 入原儿茶酸配成2g/L的溶液。将底物溶液灭菌后加热到37°C，将离心后的菌体悬浮在灭菌后的溶液中，混合均 勻后，在37°C，200r/min振荡反应，并开始计时。经过30min后，取出反应液，迅速95°C水浴 灭活5min，检测底物变化。将上述反应前后的反应液稀释100倍，使之在线性方程的浓度范围之内。稀释后 的溶液在250nm波长下测试反应前后吸光度分别为1. 592和1. 388。根据线性方程计算反 应前后对苯二甲酸浓度分别为2. 000g/L和1. 731g/L。
代入公式(1 )，酶活U= Δ C/M/ Δ t · IO3,(其中M为154. 12，Δ t为30)得到菌悬 液酶活为u=0. 058。与实施例3中结果比较发现，加入酵母粉可将菌悬液的酶活提高1倍
^^ ο实施例5
补加酵母粉为有机氮源，细菌TJ降解原儿茶酸的酶活。原儿茶酸标准溶液的测定和对应浓度_吸光度绘制的曲线图同实施例3，拟合得 到线性方程(3):Y = 0.07613 +0.07579ΧΧ，其中X代表原儿茶酸浓度，Y代表紫外吸光度。 可线性方程(3)用于计算本例降解过程中苯环含量的变化。在催化反应液中加入酵母粉作有机氮源可有效催进微生物对碳源的消耗速率，从 而提高酶酶活。为了确定酶活的提高程度，向反应液中加入2g/L的酵母浸出粉，同时加入 4g/L磷酸二氢钾和6g/L的磷酸氢二钠作缓冲溶液，维持体系稳定的pH值为7左右，最后加 入原儿茶酸配成1. 5g/L的溶液。将底物溶液灭菌后加热到37°C，将离心后的菌体悬浮在灭菌后的溶液中，混合均 勻后，在37°C，200r/min振荡反应，并开始计时。经过30min后，取出反应液，迅速95°C水浴 灭活5min，检测底物变化。将上述反应前后的反应液稀释75倍，使之在线性方程的浓度范围之内。稀释后的 溶液在250nm波长下测试反应前后吸光度分别为1. 592和1. 324。根据线性方程计算反应 前后对苯二甲酸浓度分别为1. 500g/L和1. 235g/L。代入公式(1 )，酶活U= Δ C/M/ Δ t · IO3,(其中M为154. 12，Δ t为30)得到菌悬 液酶活为u=0. 057。与实施例3中结果比较发现，加入酵母粉可将菌悬液的酶活提高将近 1倍。
权利要求
一种微生物降解苯环的酶活测试方法，该测试方法包括以下步骤(1) 制作底物浓度与吸光度之间关系的标准曲线配制一系列不同含苯环浓度的底物溶液，并在紫外分光光度计上进行全波长扫描，进而确定不同含苯环浓度的底物溶液的最大吸收波长，然后在其最大吸收波长下测定不同含苯环浓度的底物溶液的吸光度，绘制底物浓度与吸光度之间关系的标准曲线图，找出底物浓度与吸光度之间线性拟合度达到0.999以上的底物浓度范围，拟合得到用于计算降解过程中苯环含量变化的线性方程；所述底物为含苯环的物质；(2) 配制底物溶液根据待测活力的酶或菌悬液的催化条件，配制底物溶液；(3) 催化反应将底物溶液和酶液预先分别加热到各自最适反应温度，然后将底物溶液和酶液混合为反应液，在最适反应条件下，使之发生催化反应，并开始计时，经过催化反应设定的时间后，取出反应液，迅速高温灭活，检测底物浓度变化；(4)测定反应液中的苯环含量将上述催化反应前后的反应液稀释相应倍数，使其吸光度在所述线性方程范围内；稀释后的反应液在最大吸收波长下测试反应前后的吸光度，并根据所述线性方程计算反应前后的底物浓度；(5) 计算微生物降解苯环的酶活依据下述公式(1)，计算获得微生物降解苯环的酶活酶活U=△C/M/△t×103 (1)(1)式中，△C表示催化反应前后反应液中底物的浓度变化，单位为g/L；M表示底物的相对分子量，单位为g/mol，△t表示催化反应时间，单位为min；103为各个量的单位与规定酶活单位之间的校正量。
2.根据权利要求1所述的微生物降解苯环的酶活测试方法，其特征在于所述的底物为 对苯二甲酸或原儿茶酸；所述的催化条件是指3-4g/L磷酸二氢钾和6-7g/L的磷酸氢二钠 作缓冲溶液，维持体系稳定的PH值=6. 8-7. 0，最后加入底物，配成l_2g/L的溶液；所述最 适反应温度为37°C ；所述最适反应条件是指温度37°C，振荡培养器的转速200r/min ；所述 设定时间为30min ；所述的相应倍数为50-100倍。
3.根据权利要求1或2所述的微生物降解苯环的酶活测试方法，其特征在于在所述的 催化反应液中加入l_3g/L的酵母浸出粉。
全文摘要
本发明公开一种微生物降解苯环的酶活测试方法，该测试方法包括1.制作底物浓度与吸光度之间关系的标准曲线，找出底物浓度与吸光度之间线性拟合方程；2.根据待测活力的酶或菌悬液的催化条件，配制底物溶液；3.将底物溶液和酶液预先分别加热到各自最适反应温度，然后混合并在最适反应条件下催化反应，反应后检测底物浓度变化；4.测定反应液中的苯环含量稀释催化反应前后的反应液，使其吸光度在线性方程范围内，并在最大吸收波长下测试其吸光度，然后根据线性方程计算反应前后的底物浓度；5.计算依据公式(1)酶活U=△C/M/△t×103，计算获得微生物降解苯环的酶活。
文档编号G01N21/75GK101936909SQ20101026754
公开日2011年1月5日 申请日期2010年8月31日 优先权日2010年8月31日
发明者巩继贤, 张健飞, 张卫玲, 李政, 李秋瑾 申请人:天津工业大学