专利名称：一种水产品中痕量藻毒素含量的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种水产品中痕量藻毒素含量的检测方法，属于分析化学领域，更具体涉及水产品中污染物的检测技术领域。本发明将富集纯化技术与超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱联用相结合，对水产品中微囊藻毒素和节球藻毒素进行定量分析。
背景技术：
近年来我国大部分湖泊水体富营养化加剧，造成夏季蓝藻大量繁殖，发生“水华” 现象。蓝藻衰败过程中产生有害蓝藻毒素，其中微囊藻毒素(microcystin，MC)和节球藻毒素(nodUlarin，N0D)是淡水蓝绿藻产生的两大类肝毒素。MC具有环状七肽结构，性质稳定， 是肿瘤促进剂，其中以MC-RR、MC-YR、MC-LR最为常见，世界卫生组织推荐饮用水中MC-LR的限量标准为1 μ g/L，并推荐人群最大可耐受日摄入量为每千克0.04 Ug0 NOD具有与MC 相似的环状五肽结构，是直接的致癌物质。值得注意的是藻毒素不仅通过饮用水威胁人类健康，而且能在动植物等水产品中聚集，通过食物链威胁人类健康。由于目前缺乏防止藻类水华发生的有效措施，因此要预防和消除藻毒素对人畜的危害，监测和控制藻毒素在各类水产品中的限量是行之有效的方法。传统检测手段主要有小鼠腹腔注射生物分析法、酶联免疫法、蛋白磷酸酶抑制等生化分析方法，但存在操作较复杂，受复杂基体干扰影响大，且不能用于不同种类的分析鉴定等缺点。液相色谱和质谱联用法已经被应用于水体和生物体中多种藻毒素化合物的检测，而近年来开发出超高效液相色谱(Ultra Performance Liquid Chromatography, UPLC)方法具有分析速度快、样品分析通量高、分析灵敏度高等特点，对于复杂生物体中目标物的分析有着更大的优势。通过结合质谱成为藻毒素定性定量的强有力工具，样本在质谱仪中被转化为去溶剂化的离子，通过改变内源电压获取有价值的碎片，特别是特征碎片离子来检测复杂基质中的藻毒素，不同分子质量的藻毒素同系物，通过超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱联用监测那些在一定保留时间下，某特定质量数的离子强度达到定量目的。因此，建立灵敏度高、回收率高、 重现性好的水产品中痕量MC-RR、MC-YR、MC-LR和NOD分析方法，成为研究的关键。
发明内容
本发明的目的是针对水产品样品基体复杂，藻毒素痕量存在，前处理技术难度大等问题，拟开发一种灵敏度高、回收率高、快速、准确的分析技术，实现对水产品样品中 MC-RR、MC-YR、MC-LR 及 NOD 的定量测定。本发明的技术方案如下
一种水产品中痕量藻毒素含量的检测方法，称取一定量的样品用溶剂浸泡，采用超声辅助萃取方式，使藻毒素萃取到溶剂中，通过离心分离，减压浓缩后，将提取浓缩液上固相萃取柱，洗脱液氮吹浓缩，定容后直接用于超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱分析。 步骤为
A.样品的提取将冷冻干燥的水产品样品粉碎均勻，按0.20 g干粉加正丁醇-甲醇-水(体积比1 4 15，下同)抽提液5-10mL比例，浸泡10 min后，超声波功率为 150-250W，超声10 min, 12000 r/min离心10-15 min,移取上层清液，沉淀再抽提两次(条件同前)，合并上清液，40°C以下减压浓缩至5 mL。B.样品的富集及纯化采用已活化的500mg C18固相萃取柱对步骤A得到的浓缩液上样富集藻毒素，控制流速lmL/min ；依次用纯水、10%的甲醇水溶液各3_5mL冲洗固相萃取柱，控制流速2mL/min ；最后用5_10 mL 0. 05-0. 1%三氟乙酸的甲醇溶液洗脱柱上藻毒素，控制流速2-3mL/min，洗脱液在30°C条件下氮吹浓缩，于_18°C冷冻保存。C.色谱分析前将步骤B保存的冷冻品用甲醇定容并用0.22 μ m有机滤头过滤， 定容体积1. OOmL。D、超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱分析
液相色谱条件超高效液相色谱柱Acquity UPLC BEH C18柱，2. 1 mmXIOO mmXl. 7 μ m,柱温为45°C ；流动相为A 水；B 乙腈；A、B均含体积分数0. 10%甲酸，流速为0. 30 mL/min ；梯度洗脱程序为0-6. O min 含B :20%_35%，其余组分为A ;6. 0-8. O min 含B 35%-100%，其余组分为A ；
质谱条件Q-TOF-MS条件电喷雾离子源正离子电离模式ESI+;离子源温度 IOO0C ；脱溶剂气温度:2500C ；毛细管电压3. 5 kV ；锥脱溶剂气流量:500 L/h ；锥孔电压 30 V ；锥孔气流量50 L/h ；四级杆范围m/z: 100-1500 ；碰撞能量6V ；TOF离子飞行方式采用V模式，选择离子监测模式，目标化合物以保留时间和特征离子确定，绘制标准曲线， 以外标法进行定量测定。步骤B所述的C18固相萃取柱的活化顺序为5mL色谱纯甲醇、5mL超纯水、3mL 5%甲醇水溶液，流速均为lmL/min。其中所述藻毒素为MC-RR、MC-YR、MC-LR及NOD的色谱分析保留时间及定量离子见表1。表1四种藻毒素的色谱分析保留时间及定量离子
权利要求
1.一种水产品中痕量藻毒素含量的检测方法，其特征在于称取一定量的样品用溶剂浸泡，采用超声辅助萃取方式，将藻毒素萃取到溶剂中，通过离心分离，减压浓缩后，将藻毒素提取浓缩液上固相萃取柱，洗脱液氮吹浓缩，定容后直接用于超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱分析；该方法依次包括以下步骤(1)、样品的提取将冷冻干燥的水产品样品粉碎均勻，按0.20g干粉加正丁醇-甲醇-水体积比1 4 15抽提液5-10mL比例，浸泡10 min后，超声波功率为150-250W，超声10 min, 12000 r/min离心10-15 min，移取上层清液，沉淀用同前的条件再抽提两次，合并上清液，40°C以下减压浓缩至5 mL ；(2)、样品的富集及纯化采用已活化的500mgC18固相萃取柱对步骤(1)得到的浓缩液上样富集藻毒素，控制流速lmL/min;依次用纯水、10%的甲醇水溶液各3_5mL冲洗固相萃取柱，控制流速2mL/min ；最后用5_10 mL 0. 05%-0. 1%三氟乙酸的甲醇溶液洗脱柱上藻毒素，控制流速2-3mL/min，洗脱液在30°C条件下氮吹浓缩，于_18°C冷冻保存；(3)、色谱分析前将步骤(2)保存的冷冻品用甲醇定容并用0.22ym有机滤头过滤，定容体积1. OOmL ；(4)、超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱分析液相色谱条件超高效液相色谱柱Acquity UPLC BEH C18柱，2. 1 mmXIOO mmXl. 7 μ m,柱温为45°C ；流动相为A 水；B 乙腈；A、B均含体积分数0. 10%甲酸，流速为0. 30 mL/min ；梯度洗脱程序为0-6. O min 含B :20%_35%，其余组分为A ;6. 0-8. O min 含B 35%-100%，其余组分为A;质谱条件Q-TOF-MS条件电喷雾离子源正离子电离模式ESI+;离子源温度 IOO0C ；脱溶剂气温度:250°C ；毛细管电压3. 5 kV ；锥脱溶剂气流量:500 L/h ；锥孔电压 30 V;锥孔气流量50 L/h;四级杆范围m/z: 100-1500 ；碰撞能量6V ;TOF离子飞行方式采用V模式，选择离子监测模式，目标化合物以保留时间和特征离子确定，绘制标准曲线， 以外标法进行定量测定。
2.根据权利要求1所述的水产品中痕量藻毒素含量的检测方法，其特征在于步骤B 所述的C18固相萃取柱的活化顺序为5mL色谱纯甲醇、5mL超纯水、3mL 5%甲醇水溶液， 流速均为lmL/min。
3.根据权利要求1所述的水产品中痕量藻毒素含量的检测方法，其特征在于其中所述藻毒素为微囊藻毒素MC-RR、MC-YR、MC-LR及节球藻毒素NOD。
全文摘要
本发明涉及一种水产品中痕量藻毒素含量的检测方法，属于分析化学领域，更具体涉及水产品中污染物的检测技术领域。本方法将富集纯化技术与超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS)联用相结合，对水产品中微囊藻毒素和节球藻毒素定量分析，其处理步骤包括超声提取、固相萃取纯化、超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱联用技术快速测定水产品中的微囊藻毒素MC-RR、MC-YR、MC-LR和节球藻毒素NOD。本发明建立的方法能够快速分析水产品中的藻毒素含量，其灵敏度高、专属性好，易于操作且回收率高。
文档编号G01N30/88GK102393435SQ20111035201
公开日2012年3月28日 申请日期2011年11月9日 优先权日2011年11月9日
发明者何恩奇, 徐夏叶, 杨健, 武铄, 虞锐鹏, 钮伟民, 陈海燕, 陶冠军 申请人:江南大学