专利名称：一种有毒甲藻纯种的分离、与大规模培养方法
技术领域：
本发明涉及Amphidinium klebsii的藻种纯系分离途径、培养方法及其应用。具体地说是一种有毒甲藻的纯种分离与大规模生产的方法。
背景技术：
甲藻毒素是海洋生物活性物质中研究、开发进展最为迅速的领域之一。海洋中能产生毒素的藻类约有60-78种，其中以有毒甲藻最多，占73-75％。甲藻毒素的种类繁多，常见的有麻痹性贝毒(PSP)、腹泻性贝毒(DSP)、记忆缺失性贝毒(ASP)、神经性贝毒(NSP)以及西加鱼毒(Ciguatoxin，Maitotoxin，Ostreotoxin)等几大类。从目前的研究进展来看，甲藻毒素在研究癌症机理和开发抗癌、镇痛、麻醉、抗病毒、抗菌等各种治疗药方面有着非常广阔的应用前景。此外，甲藻毒素作为药理研究工具药的应用前景也非常广阔。由于自然环境中有毒甲藻的细胞密度非常低，其毒素是通过贝类或鱼类的摄食富集达到一定浓度而起作用，因而毒素原材料的来源困难极大程度地制约了毒素的进一步深入研究。目前国际市场上毒素种类较少，价格高昂。要得到大量的甲藻毒素无非有两个途径一是应用海洋生物技术，从天然环境中分离有毒甲藻，并在实验室内进行甲藻纯系的高密度大规模培养，从中提取结构和功能上新颖的生理活性物质甲藻毒素；二是模拟藻细胞的合成途径进行仿生有机合成。但这些毒素的分子量往往较大，很难进行合成。因此分离提取成为目前唯一可行的途径。因而，开展有毒甲藻的高密度高毒性培养，研究毒素的产生与调控机理具有十分重要的意义。
Amphidinium klebsii是一种有毒甲藻，有报道Amphidinium属的种可以产生溶血性毒素，也有报道从该属的种类中得到有抗肿瘤活性、抗菌活性的化合物。本发明的目的是研究一种有毒甲藻Amphidinium klebsii的纯种分离与培养方法。以期获得大量的原材料制取甲藻毒素。
发明内容
Amphidinium klebsii的藻种纯系的分离方法在热带珊瑚礁水域采集大型海藻，洗出附生物，收集上清部分，即得含Amphidinium klebsii藻细胞的水样。取样现场表层水温25-30℃，盐度30-38‰，pH7.8-8.4。从水样中分离的Amphidinium klebsii藻细胞用天然海水、f/2、改造的无硅K/2、K培养液，在25-30℃、5000～11000Lux自然光、明暗周期12/12h的环境条件下建立藻株。经在实验室多次分离、驯化培养，分离纯化后得到Amphidinium klebsii的纯系。这是我国首次得到该种的纯系。
大规模培养方法原藻液2000ml，密度约200000cells/ml，在K培养液中平均生长约一周左右按1∶3比例扩种。先在体积为5升的三角烧瓶中进行扩种培养，大约五至七天后按1∶3扩种移至体积约20升的圆柱形玻璃缸中，继续分级扩种至体积分别为150升、250升和5000升内贴瓷砖的水池中进行大规模培养。培养配方为天然海水、f/2、改造的无硅K/2、K培养液。培养的环境条件如下海水盐度30～31，pH8.78～9.1，水温波动范围20～28℃，光照强度4000至8000Lux，明暗周期12/12h。培养过程中每天进行适当次数的搅动以确保大部分藻体白天悬浮。这是我国首次大规模养殖成功该种。
收集方法一般情形刚扩种的藻液呈淡黄色。随着藻细胞的一天天生长繁殖，藻液由淡黄色渐渐地变为深黄色，最终转变为褐色乃至深褐色。此时加用沉淀剂使藻细胞大量沉淀，收集沉淀并用400目的筛绢过滤藻液收集藻体。具体收集流程如下(1)在藻液中加入浓度为0.20～0.35‰的KAl(SO4)2·12H2O后搅拌形置半小时左右。如上层水体中仍然有少许藻细胞聚集物漂浮，只需轻轻搅动即可。
(2)用胶管抽去上清水体，收集沉淀于器皿中并逐级浓缩。
(3)把沉淀的倒入分液漏斗中静置。
(4)放出分液漏斗中的下层沉淀至孔径为400目的滤膜上，滤去多余的水分。
(5)用药勺刮取筛绢上的藻膏至收集瓶中放置冰箱中冻存。
在甲藻生产性培养中，通过使用絮凝剂使甲藻沉淀，收集沉淀物再离心得到藻膏，是一种创新。这种方法既可以避免单独使用絮凝剂易致用量过大，细胞破裂造成内容物外泄的问题，又解决了大生产中连续离心收集的费时费力问题。
本发明所提供的培养方法可以从自然界中分离得到Amphidinium klebsii的纯系，以达到提取活性次生代谢产物的目的。
本发明所述方法包括如下步骤1、Amphidinium klebsii的藻种纯系的分离方法在热带珊瑚礁水域采集大型海藻，洗出附生物，收集上清部分，即得含Amphidinium klebsii藻细胞的水样。取样现场表层水温25-30℃，盐度30-38‰，pH7.8-8.4。分离的藻细胞用天然海水、f/2、改造的无硅K/2、K培养液，在25-30℃、5000～11000Lux自然光、明暗周期12/12h的环境条件下建立藻株。经在实验室多次分离、驯化培养，分离纯化后得到Amphidinium klebsii的纯系。
2、规模性的培养与收集方法培养的配方及环境条件如下培养配方为天然海水、f/2、改造的无硅K/2、K培养液。培养的环境条件为海水盐度30～31，pH8.78～9.1，水温波动范围20～28℃，光照强度4000至8000Lux，明暗周期12/12h。此时加用沉淀剂使藻细胞大量沉淀，收集沉淀并用400目的筛绢过滤藻液收集藻体。
下面通过实施例对发明进行详细描述实施例1在热带珊瑚礁水域采集大型海藻500g，加入1000ml海水，洗出附生物，收集上清部分，即得含Amphidinium klebsii藻细胞的水样。取样现场表层水温24℃，盐度35‰，pH8.048。分离的藻细胞用天然海水、f/2、无硅的K/2、K培养液，在24±2℃、5000～11000Lux自然光、明暗周期12/12h的环境条件下建立藻株。经在实验室多次分离、驯化培养，分离纯化后得到Amphidiniumklebsii的纯系。
实施例2在热带珊瑚礁水域采集大型海藻1000g，加入2000ml海水，洗出附生物，收集上清部分，即得即得含Amphidinium klebsii藻细胞的水样。取样现场表层水温25℃，盐度35.3‰，pH8.050。分离的藻细胞用天然海水、f/2、无硅的K/2、K培养液，在25±3℃、5000～11000Lux自然光、明暗周期12/12h的环境条件下建立藻株。经在实验室多次分离、驯化培养，分离纯化后得到Amphidinium klebsii的纯系。
实施例3在热带珊瑚礁水域采集大型海藻2000g，加入3000ml海水，洗出附生物，收集上清部分，即得含Amphidinium klebsii藻细胞的水样。取样现场表层水温26℃，盐度36‰，pH8.050。分离的藻细胞用天然海水、f/2、无硅的K/2、K培养液，在27±2℃、5000～11000Lux自然光、明暗周期12/12h的环境条件下建立藻株。经在实验室多次分离、驯化培养，分离纯化后得到Amphidinium klebsii的纯系。
本发明所提供的Amphidinium klebsii纯系的用途，是可作为大规模生产以得到充足的原材料，提取次生代谢产物——甲藻毒素。
利用本发明的方法分离培养Amphidinium klebsii纯系，可大幅度提高其增值率，达到该种的单种大规模生产的目的，以得到充足的原材料，并提取次生代谢产物——甲藻毒素。利用本发明的方法分离培养Amphidinium klebsii纯系，设备简单，经济效益大。
权利要求
1.一种有毒甲藻(Amphidinium klebsii)的纯种分离与大规模培养的方法，其特征在于A，藻种纯系的分离1)，在热带珊瑚礁水域采集大型海藻，洗出附生物，收集上清部分，即得含(Amphidinium klebsii)藻细胞的水样；2)，分离的藻细胞，在培养液中建立藻株；3)，在实验室反复多次分离、驯化培养，重复步骤2)，分离纯化后得到(Amphidinium klebsii)的纯系；B，大规模培养方法1)，原藻液2000ml，密度约200000cells/m1，在K培养液中平均生长约一周左右按1∶3比例扩种，先在体积为5升的三角烧瓶中进行扩种培养，大约五至七天后按1∶3扩种移至体积约20升的圆柱形玻璃缸中，继续分级扩种至体积分别为150升、250升和5000升内贴瓷砖的水池中进行大规模培养；2)，当扩种的藻液由淡黄色，最终转变为褐色乃至深褐色，此时分别用筛绢或滤纸或加用沉淀剂使藻细胞大量沉淀，收集沉淀并用400目的筛绢过滤藻液收集藻体，具体收集步骤如下(1)在藻液中加入浓度为0.20～0.35‰的KAl(SO4)2·12H2O后搅拌；(2)用胶管抽去上清水体，收集沉淀于器皿中并逐级浓缩；(3)把沉淀的倒入分液漏斗中静置；(4)放出分液漏斗中的下层沉淀至孔径为400目的滤膜上，滤去多余的水分；(5)用药勺刮取筛绢上的藻膏至收集瓶中放置冰箱中冻存。
2.根据权利要求1中所述的有毒甲藻(Amphidinium klebsii)的纯种分离与与大规模生产的方法，其特征在于纯种分离的条件A1)，中的取样现场表层水温25-30℃，盐度30-38‰，pH7.8-8.4。
3.根据权利要求1中所述的有毒甲藻(Amphidinium klebsii)的纯种分离与大规模生产的方法，其特征在于藻种纯系分离所述的A2)，中培养藻株的条件为天然海水、f/2、改造的无硅K/2、K培养液，在25-30℃、5000～11000Lux自然光、明暗周期12/12h的环境条件下建立藻株。
4.根据权利要求1中所述的有毒甲藻(Amphidinium klebsii)的纯种分离与大规模培养的方法，其特征在于大规模生产的培养B的环境条件如下培养配方为天然海水、f/2、改造的无硅K/2、K培养液，海水盐度30～31，pH8.78～9.1，水温波动范围20～28℃，光照强度4000至8000Lux，明暗周期12/12h。培养过程中每天进行适当次数的搅动以确保大部分藻体白天悬浮。
全文摘要
本发明涉及Amphi dinium klebsii的纯种分离途径、培养方法及其应用。具体地说是一种有毒甲藻的纯种分离与大规模培养的方法。海洋中能产生毒素的藻类约有60－78种，从目前的研究进展来看，甲藻毒素在研究癌症机理和开发抗癌、镇痛、麻醉、抗病毒、抗菌等各种治疗药方面有着非常广阔的应用前景。由于自然环境中有毒甲藻的细胞密度非常低，因而毒素原材料的来源困难，制约了它的应用。本发明的目的是研究一种有毒甲藻的纯种分离与培养方法。从自然水体中分离培养Amphidinium klebsii纯系，大幅度提高其增值率，达到该种的单种大规模生产的目的，以得到充足的原材料。
文档编号A01H13/00GK1526279SQ03146858
公开日2004年9月8日 申请日期2003年9月18日 优先权日2003年9月18日
发明者龙丽娟, 吴军, 李庆欣, 张偲 申请人:中国科学院南海海洋研究所