专利名称：一种简易、快速、灵敏的东海原甲藻现场检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及海洋生物技术领域，尤其涉及的是一种简易、快速、灵敏的东海原甲藻现场检测试剂盒。
背景技术：
赤潮是指由于海洋浮游生物，包括藻类(主要原因种)、原生动物和细菌的过度繁殖或聚集造成海水变色的现象。近年来，由于人类活动的加剧，海洋日趋富营养化，导致赤潮频发，并已成为一种全球性的生态灾害，给水产养殖业、捕捞业和滨海旅游业造成了巨大损失，同时也给海洋生态环境带来负面影响，甚至直接威胁人类健康。有害赤潮在我国呈现出爆发次数增多、面积扩大、持续时间延长和危害加剧的趋势。如在2004年我国爆发赤潮的次数就达120次，特别是1998— 2000年连续3年我国的东海就曾发生过由东海原甲藻引起的面积达上千平方公里的特大赤潮，为世界罕见，因此，赤潮引起了公众和政府的高度重视。对赤潮原因种(包括东海原甲藻)进行正确鉴定是研究、认识和防治其引起的赤潮的前提和基础，同时更应建立简单、快速和特异性强的检测方法，监测赤潮高发区的水环境，对可能爆发的有害赤潮进行预警，特别是指导渔业生产者及时采取应对措施，以减少经济损失。当前，对自然水样中的赤潮藻(包括东海原甲藻)的检测的传统方法，主要是以其分类学特征为基础，借助光镜和电镜对其细胞形态特征进行观察，并最终对其进行鉴定。最近，分子生物学技术为赤潮藻的鉴定提供了新思路。赤潮藻的分子检测技术以藻细胞的基因组核糖体DNA (rDNA)为靶目标，其主要原因是藻类基因相对恒定，不会像其表观形态特征随环境条件的不同而发生变化。因此，其可克服形态学鉴定法的缺点，具有特异性强，检测迅速的特点。近年来，出现了大量有关赤潮藻分子检测方法，包括DNA测序、限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)>随机扩增多态性DNA (RAPD) (random amplified polymorphic DNA)、全细胞突光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)、实时突光定量PCR和三明治杂交(sandwich hybridization, SHA)等。而建立的东海原甲藻的分子检测技术主要包括基于核酸荧光探针和荧光抗体探针的FISH、实进定量PCR及SHA等。可见，当前还没有一项赤潮藻的现场检测技术，也没有赤潮藻的便携式检测试剂盒的报道。
发明内容
本发明是提供一种能快速现场检测自然水样中东海原甲藻的便携式试剂盒，该检测试剂盒主要是基于核酸(rRNA)的反转录及环介导等温扩增技术原理制成。本发明的技术方案如下一种简易、快速、灵敏的东海原甲藻现场检测试剂盒，由以下试剂组成⑴试剂A为自然样品核酸粗提试剂，其组成为2% (m/v) CTAB, 0. 5% (ν/ν) β -mercaptoethanol,1. 4 M NaCl, 20 mM EDTA, 100 mM Tris-Cl, 10 U RNase Inhibitor ；(2)试剂B为反转录特异性引物溶液，其浓度为10 ymol/L ;核酸序列为5’-CCTTGGTCCGTCTTTCAAGA -3’ ；(3)试剂 C 为反转录反应液 I，其组成为142.86 mM Tris-HCl; 214.29 mM KCl;8. 57 mM MgCl2, 28. 57 mM DTT 和 11. 43 mM dNTP ；(4)试剂 D 为反转录反应液 II，其组成为20 U/μ L RNase Inhibitor, 100 U/μ LRTase M-MLV ；(5)试剂E为核酸扩增反应液I，组成为(5.1)内部引物浓度2. 17 μ M ;核酸序列(PLF3) :5，-CCTGCCTTGTGTGTCA ACG-3’，核酸序列(PLB3) :5’ -AGTCATCGTCTTTGCG TCAG -3’ ；(5. 2)外部引物浓度0. 22 μ M ;核酸序列(PLFIP) :5，-CCGCAAATGAGTTCTGCCAAGGTITTGCGATCGAGGAAAACTCCA-3’，核酸序列(PLBIP) :5’-GTCTGGTTGCAGTGTCTTTGGCTITTAAATGCCCAAGTCACCTGG-3，)；(5. 3) O. 43 mM dNTP ；(5. 4)1. 09 M 甜菜碱;(5.5) Bsm Buffer :21. 74 mM Tris-HCl (pH 8.8)，10.87 mM KCl, 10.87 mM(NH4) 2S04, 2. 17 mM MgSO4, 0. 11% (v/v) Triton X-100 ；(6)试剂 F 为核酸扩增反应液 II,即 8 U/ μ L Bsm DNA polymerase largefragment ； (7)试剂 G 为显色液 GeneFinder ；(8)对照(8.1)阳性对照检测样品东海原甲藻的总RNA ；(8. 2)阴性对照检测样品赤潮异湾藻的总RNA。与现有技术相比，本发明存在以下有益效果(I)无需特殊的设备，可实现现场检测现有的分子检测方法必须借助特别的实验仪器，如DNA测序需要PCR仪和测序仪，限制性片段长度多态性和随机扩增多态性DNA需要DNA电泳仪，全细胞荧光原位杂交需要荧光显微镜，实时荧光定量PCR需要荧光定量PCR仪，三明治杂交需要酶标仪等，这就使得这些检测方法必须在实验室才能完成，无法对自然水体中的赤潮藻进行现场检测；而本检测试剂盒只需要简易的设备，适宜用于现场检测。(2)检测方法简单现有分子技术检测操作复杂，对检测人员的技术要求高，本操作试剂盒只需按说明书操作即可，适宜于推广应用。(3)检测灵敏度高在进行核酸扩增(环介等温扩增)之前，多了一步核酸的反转录步骤，因此其检测灵敏度较其它分子检测方法灵敏度高。
图1为本发明试剂盒的检测效果图，注PC，阳性对照；NC，阴性对照，1—10，阳性结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。1.试剂盒组成(I)试剂A为自然样品核酸粗提试剂，其组成为2% (m/v) CTAB, 0.5% (v/V) β -mercaptoethanol,1. 4 M NaCl, 20 mM EDTA, 100 mM Tris-Cl, 10 U RNaseInhibitor ；(2)试剂B为反转录特异性引物溶液，其浓度为10 ymol/L;核酸序列为5’ -CCTTGGTCCGTCTTTCAAGA -3’ ；(3)试剂 C 为反转录反应液 I，其组成为142.86 mM Tris-HCl; 214.29 mM KCl;8. 57 mM MgCl2, 28. 57 mM DTT 和 11. 43 mM dNTP ；(4)试剂 D 为反转录反应液 II，其组成为20 U/μ L RNase Inhibitor, 100 U/μ LRTase M-MLV ；(5)试剂E为核酸扩增反应液I，组成为(5.1)内部引物浓度2. 17 μ M ;核酸序列(PLF3) :5，-CCTGCCTTGTGTGTCA ACG-3’，核酸序列(PLB3) :5’ -AGTCATCGTCTTTGCG TCAG -3’ ；(5. 2)外部引物浓度0· 22 μ M ;核酸序列(PLFIP) :5’-CCGCAAATGAGTTCTGCCAAGGTITTGCGATCGAGGAAAACTCCA-3’，核酸序列(PLBIP) :5’-GTCTGGTTGCAGTGTCTTTGGCTITTAAATGCCCAAGTCACCTGG-3，)；(5. 3) O. 43 mM dNTP ；(5. 4)1. 09 M 甜菜碱；(5.5) Bsm Buffer :21. 74 mM Tris-HCl (pH 8.8)，10.87 mM KCl, 10.87 mM(NH4) 2S04, 2. 17 mM MgSO4, 0. 11% (v/v) Triton X-100 ；(6)试剂 F 为核酸扩增反应液 II,即 8 U/ μ L Bsm DNA polymerase largefragment ；(7)试剂 G 为显色液 GeneFinder ；(8)对照(8.1)阳性对照检测样品东海原甲藻的总RNA ；(8. 2)阴性对照检测样品赤潮异湾藻的总RNA。2、本检测试剂盒的使用操作步骤(I)水样的采集及藻细胞的过滤采集自然水样，混匀，用5 mL—次性灭菌针头吸取检测样品，将滤膜(孔径0.45 μ m，直径13 mm)安置于过滤器上，手推过滤；(2)洗膜及膜的简切处理用针头吸取去离子水，将含有藻细胞的滤膜洗涤2次，将滤膜从过滤器取下，用灭菌的剪刀将其剪成碎屑，并用镊子将膜碎屑放入1. 5 mL离心管中；(3) RNA粗提液的制备用枪头吸取50 - 100 μ L试剂A加入到离心管中，短暂离心后，于涡旋振荡器上剧烈 振荡至少5 min，并经短暂离心，上清液即为RNA粗提液；(4)反转录制备cDNA模板(对照实验从此步做)吸取(4)制备的RNA粗提液(阳性对照和阴性对照模板)5 μ L到200 μ L离心管中，并加入I μ L试剂B，短暂离心混匀，水浴锅70°c温育10 min后，立即冰浴至少2 min ;在上述反应液中加入3. 5 μ L试剂C和
0.5 “1^试剂0，短暂离心后，置于421反应1 h，再经70°C变性15 min后，立刻冰浴，制得cDNA模板；(5)核酸扩增反应在200 μ L离心管中分别加入23 μ L试剂Ε、1 μ L平共处(5)制备的cDNA模板和I 4 1^试剂？，离心混匀，在651反应I h，并80°C处理10 min结束反(6)显色反应在上述反应管中加入O. 4 μ L试剂G，振荡混勻，肉眼观察结果。(7)结果判读(参照图1):参照阴性和阳性对照结果进行检测样品的叛读，其中阳性对照反应液呈绿色(PC)、阴性对照反应液呈橙黄色(NC)，如果测试反应管显绿色(同阳性对照)则表明水样中有东海原甲藻的存在，如果测试反应管管呈橙黄色(同阴性对照)，则表明水样中无东海原甲藻的存在。应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属 于本发明所附权利要求的保护范围。
权利要求
1.一种简易、快速、灵敏的东海原甲藻现场检测试剂盒，其特征在于，由以下试剂组成(1)试剂A为自然样品核酸粗提试剂，其组成为2% (m/v) CTAB, 0.5% (v/V) β -mercaptoethanol, 1.4 M NaCl, 20 mM EDTA, 100 mM Tris-Cl, 10 U RNaseInhibitor ；(2)试剂B为反转录特异性引物溶液，其浓度为10ymol/L;核酸序列为5’ -CCTTGGTCCGTCTTTCAAGA -3’ ；(3)试剂C为反转录反应液I，其组成为142.86mM Tris-HCl, 214.29 mM KCl; 8.57mM MgCl2, 28. 57 mM DTT 和 11. 43 mM dNTP ；(4)试剂D为反转录反应液II，其组成为20U/μ L RNase Inhibitor, 100 U/μ LRTase M-MLV ；(5)试剂E为核酸扩增反应液I，组成为(5.1)内部引物浓度2. 17 μ M ;核酸序列(PLF3) :5，-CCTGCCTTGTGTGTCA ACG -3，，核酸序列(PLB3) :5’ -AGTCATCGTCTTTGCG TCAG -3’ ；(5. 2)外部引物浓度0. 22 μ M ;核酸序列(PLFIP) :5，-CCGCAAATGAGTTCTGCCAAGGTITTGCGATCGAGGAAAACTCCA-3’，核酸序列(PLBIP) :5’-GTCTGGTTGCAGTGTCTTTGGCTITTAAATGCCCAAGTCACCTGG-3，)；(5. 3) 0. 43 mM dNTP ；(5. 4)1. 09 M舌甘菜碱；(5.5) Bsm Buffer :21. 74 mM Tris-HCl (pH 8.8)，10.87 mM KCl, 10.87 mM(NH4)2S04, 2. 17 mM MgSO4, O. 11% (v/v) Triton X-100 ；(6)试剂F 为核酸扩增反应液 II，即 8 U/ μ L Bsm DNA polymerase large fragment ；(7)试剂G为显色液GeneFinder ；(8)对照:(8.1)阳性对照检测样品东海原甲藻的总RNA ；(8. 2)阴性对照检测样品赤潮异湾藻的总RNA。
全文摘要
本发明公开了一种简易、快速、灵敏的东海原甲藻现场检测试剂盒。所述的试剂盒由自然样品核酸粗提试剂、反转录特异性引物溶液、反转录溶液、核酸扩增反应液、核酸扩增引物及显色液等组成。该检测试剂盒的检测原理是以藻细胞的rRNA为靶序列，通过核酸的反转录制备模板，环介导等温扩增靶序列。试剂盒的检测过程只需简易的设备，检测快速，检测结果可通过肉眼直接进行判断，且具有较高的灵敏度，可用于日常水环境的现场检测，对东海原甲藻赤潮的预警有一定的实用价值。
文档编号C12Q1/04GK103060454SQ20131001093
公开日2013年4月24日 申请日期2013年1月11日 优先权日2013年1月11日
发明者陈国福, 张春云 申请人:哈尔滨工业大学(威海)