一种利用寇式隐甲藻atcc30772发酵废弃菌渣制备高产量纳他霉素的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用寇式隐甲藻ATCC30772发酵废弃菌渣制备高产量纳他霉素的方法，它是一种往发酵培养基中添加寇式隐甲藻ATCC30772发酵废弃菌渣提高纳他霉素产量的方法。本发明具有操作简单、发酵成本低、节能环保、产量有较明显提高等优势。
【专利说明】一种利用寇式隐甲藻ATCC30772发酵废弃菌渣制备高产量纳他霉素的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及以纳塔尔链霉菌iStreptomyces natalensis)发酵生产纳他霉素的工艺方法，特别是一种利用隐甲藻发酵生产DHA所得发酵废弃菌渣来提高纳他霉素产量的生产方法。
技术背景
[0002]纳他霉素是一种多烯类大环内酯抗生素，主要由恰塔努加链霉菌$tr印tomyceschmanovgensis)、褐黄抱链霉菌 i^treptomyces giIvosporeus)和纳塔尔链霉菌^Streptoyces natalensis')等发酵产生。它的分子的疏水部分即大环内酯的双键部分以范德华力与细胞质膜上的留醇分子结合，形成抗生素一留醇复合物，由此破坏了细胞质膜的渗透性，而它的的亲水部分即内酯的多醇部分则在膜上形成水孔，损伤膜的通透性，继而引起菌体细胞内氨基酸、电解质等重要物质渗出，最终导致菌体死亡。
[0003]作为一种新型的生物食品防腐剂，纳他霉素以其高效广谱的杀菌效果及无毒无害的安全保证，在全球发展迅速，其产品的应用不断拓展至食品加工、医药等多个行业。1982年6月，美国FDA (Food and Drug Administration)正式批准纳他霉素可以用作食品防腐剂 ;1997年，中国卫生部批准可以在我国食品中使用纳他霉素作为防腐剂。
[0004]目前，国内外提高纳他霉素发酵水平主要是通过诱变育种、调整发酵工艺、基因工程等手段，而采用添加另外一种发酵废弃菌渣来提高纳他霉素产量的报道并不多见；尤其未发现有公布使用寇式隐甲藻ATCC30772发酵废弃菌渣来提高纳他霉素产量的报道，此方法既提高了目标产物产量，降低了生产成本，缩短了发酵周期，又节约了能源，实现了废物再利用，有利于环境保护。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种利用寇式隐甲藻ATCC30772发酵废弃菌渣制备高产量纳他霉素的方法。
[0006]一种利用寇式隐甲藻ATCC30772发酵废弃菌渣制备高产量纳他霉素的方法，其特征在于:包括以下步骤:
(1)将隐甲藻ATCC30772发酵200-240个小时之后的发酵液离心，得菌体沉淀，用蒸馏水清洗3次，在80°C左右的烘箱中干燥，研磨成粉末；
(2)在纳塔尔链霉菌发酵的0-72h间一次性加入寇式隐甲藻ATCC30772发酵废弃菌渣，发酵结束后得纳他霉素。
[0007]述的一种利用寇式隐甲藻ATCC30772发酵废弃菌渣制备高产量纳他霉素的方法，其特征在于:
包括以下步骤:
(I)将隐甲藻ATCC30772发酵200-240个小时之后的发酵液离心，得菌体沉淀，用蒸馏水清洗3次，在80°C烘箱中干燥，研磨成粉末；
(2)在纳塔尔链霉菌发酵的0-72h间一次性加入寇式隐甲藻ATCC30772发酵废弃菌渣，5-50g/L, pH 7.0-7.5，发酵结束后得纳他霉素。
[0008]一种利用寇式隐甲藻ATCC30772发酵废弃菌渣制备高产量纳他霉素的方法，其特征在于:包括以下步骤:
O摇瓶种子培养
无菌条件下，将适量纳塔尔链霉菌孢子涂布于琼脂斜面培养基中，置于27-30°C培养间中培养6-10天，然后将培养好的孢子配置成孢子悬浮液，吸取l_3ml加入盛有摇瓶种子培养基的三角瓶中，27-30°C条件下摇床培养36-48h，摇床转速为180_250rmp ；
所述琼脂斜面培养基为葡萄糖5-15g/L，酵母浸膏l_5g/L，麦芽浸粉l_5g/L，蛋白胨3-10g/L，琼脂粉 10-20g/L，pH 7.0-7.5 ；
所述种子培养基为葡萄糖10-30g/L，酵母粉30-50g/L，酵母浸膏3_10g/L，pH7.0-7.5 ；
2)摇瓶发酵培养
将种子液按5%-10% 的接种量接入盛有发酵培养基的三角瓶中，27-30°C条件下摇床培养36-48h，摇床转速为180-250rmp ;在发酵20_30h加0.5%_1%的丙酸钠，同时在0_72h发酵时间内一次性添加寇式隐甲藻ATCC30772发酵废液弃菌渣5_50g/L，pH 7.0-7.5，发酵结束后得纳他霉素；
所述发酵培养基为葡萄糖5-15g/L，可溶性糊精30-50g/L，酵母粉20_40g/L，pH
7.0-7.5。
[0009]所述的一种利用寇式隐甲藻ATCC30772发酵废弃菌渣制备高产量纳他霉素的方法，其特征在于:
所述寇式隐甲藻ATCC30772发酵废弃菌渣是寇式隐甲藻ATCC30772菌株用作实验室摇瓶发酵DHA产品所产生的发酵废弃菌渣。其发酵方法为将斜面保藏的寇式隐甲藻ATCC30772活化后接入装有50ml种子培养基的250ml的三角瓶中，在22_28°C、80-100r/min下培养2-5天，然后按5%_10%的接种量接种到装有100mL发酵培养基的500ml的三角瓶，18-20摄氏度下培养7-10天。将所得发酵液离心，得菌体沉淀，用蒸馏水清洗3次，在80°C烘箱中干燥，研磨成粉末。
[0010]经测定，在纳塔尔链霉菌发酵初始0-72h添加寇式隐甲藻ATCC30772发酵废弃菌渣l_50g/L可提高纳他霉素产量同未添加废弃菌渣的对照相比提高了 10%-50%。
[0011]本发明采用添加寇式隐甲藻ATCC30772发酵废弃菌渣方法发酵生产纳他霉素所具有的优点是:
1.明显提高了纳他霉素产量；
2.操作简单，将寇式隐甲藻ATCC30772发酵废弃菌渣加入纳塔尔链霉菌发酵液，实现废物利用，不仅降低了生产成本，而且减少了对环境的污染。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1为实施例1的发酵产物纳他霉素产量曲线，在图1中，横坐标为发酵时间(h)，纵坐标为发酵液中所测得的纳他霉素产量(g/L)；图2为实施例2的发酵产物纳他霉素产量曲线，在图2中，横坐标为发酵时间(h)，纵坐标为发酵液中所测得的纳他霉素产量(g/L)；
图3为实施例3的发酵产物纳他霉素产量曲线，在图3中，横坐标为发酵时间(h)，纵坐标为发酵液中所测得的纳他霉素产量(g/L)；
图4为对比例I的发酵产物纳他霉素产量曲线，在图4中，横坐标为发酵时间(h)，纵坐标为发酵液中所测得的纳他霉素产量(g/L)。
【具体实施方式】
[0013]下面通过实施例对本发明做详细说明。
[0014]实施例1
1)寇式隐甲藻ATCC30772菌渣制备:将斜面保藏的寇式隐甲藻ATCC30772活化后接入装有50ml种子培养基的250ml的三角瓶中，在25°C、90r/min下培养3天，然后按10%的接种量接种到装有100mL发酵培养基的500ml的三角瓶，20摄氏度下培养9天。将所得发酵液离心，得菌体沉淀，用蒸馏水清洗3次，在80°C烘箱中干燥，研磨成粉末。
[0015]2)摇瓶种子培养:无菌条件下，将纳塔尔链霉菌孢子涂布于琼脂斜面培养基中，置于28°C培养间里培养，再 将培养好的纳塔尔链霉菌实验菌株配置成孢子悬浮液，吸取Iml此悬浮液加入种子培养基(葡萄糖10g/L，酵母粉50g/L，酵母浸膏5g/L，pH 7.2)的三角瓶中，摇瓶转速220rpm、28°C、培养40h。
[0016]3)摇瓶发酵培养:将培养好的种子液以10%的接种量接种于发酵培养基(葡萄糖10g/L，可溶性糊精40g/L，酵母粉30g/L，pH 7.2)的三角瓶中，摇瓶转速220rpm、28°C、培养120h。在发酵24时添加0.6%的丙酸钠，并在发酵培养开始后Oh时三组实验摇瓶中分别添加10g/L、20g/L和30g/L的寇式隐甲藻ATCC30772发酵废弃菌渣(其余时间不添加)。至发酵结束时发酵液中纳他霉素产量通过HPLC法测定分别达到4.53g/L、4.71 g/L和4.42g/L(参见图1)。
[0017]HPLC检测方法如下:
取0.5ml纳他霉素发酵液,加入7ml甲醇,充分摇匀后,6000rpm离心10min,取上清液用0.45Mffl微孔滤膜过滤即得到待测液。
[0018]标准品的配制:精确称取0.02g、0.04g、0.06g、0.08g、0.1g纳他霉素标准品，分别用甲醇溶解并定容至100ml,配制成0.2g/L、0.4g/L、0.6g/L、0.8g/L、l.0g/L的纳他霉素标准溶液，并制成标准曲线，待检测样品时用。
[0019]HPLC条件:仪器为岛津LC-15C ;流动相为甲醇:水=70:30 (与发酵培养基体积比v/v);色谱柱是岛津LC-C18 (5Mm, 4.6mmX 250mm);柱温为25°C ;检测波长为303nm ;每次进样量为；20μ1进样流速为1.0ml/min。
[0020]实施例2
O寇式隐甲藻ATCC30772菌渣制备同实施例1 ;
2)摇瓶种子培养方法同实施例1;
3)摇瓶发酵培养:将培养好的种子液以10%的接种量接种于发酵培养基(葡萄糖IOg/L，可溶性糊精40g/L，酵母粉30g/L，pH 7.2)的三角瓶中，摇瓶转速220rpm、28°C、培养120h。在发酵24时添加0.6%的丙酸钠，并在发酵培养开始后24h时三组实验摇瓶中分别添加10g/L、20g/L和30g/L的寇式隐甲藻ATCC30772发酵废弃菌渣(其余时间不添加)。至发酵结束时发酵液中纳他霉素产量通过HPLC法测定分别达到4.791g/L、5.044g/L和4.84Ig/L (参见图2)。
[0021]实施例3
O寇式隐甲藻ATCC30772菌渣制备同实施例1 ;
2)摇瓶种子培养方法同实施例1;
3)摇瓶发酵培养:将培养好的种子液以10%的接种量接种于发酵培养基(葡萄糖IOg/L，可溶性糊精40g/L，酵母粉30g/L，pH 7.2)的三角瓶中，摇瓶转速220rpm、28°C、培养120h。在发酵24时添加0.6%的丙酸钠，并在发酵培养开始后48h时三组实验摇瓶中分别添加10g/L、20g/L和30g/L的寇式隐甲藻ATCC30772发酵废弃菌渣(其余时间不添加)。至发酵结束时发酵液中纳他霉素产量通过HPLC法测定分别达到4.031g/L、4.266g/L和3.987g/L (参见图3)。
[0022]通过以上实施例可以看出，整个发酵过程只添加一次并且分别在发酵过程中Oh、24h和48h时往发酵培养基中添加10g/L、20g/L和30g/L的寇式隐甲藻ATCC30772发酵废弃菌渣，产量比较稳定，说明发酵过程中在以上三个时间点添加以上不同体积的高山被孢霉发酵废液都可以得到较高的纳他霉素产量，其中24h添加20g/L的寇式隐甲藻ATCC30772发酵废弃菌渣时纳他霉素产量最高。
[0023]对比例I O寇式隐甲藻ATCC30772菌渣制备同实施例1 ;
2)摇瓶种子培养方法同实施例1;
3)摇瓶发酵培养:将培养好的种子液以10%的接种量接种于发酵培养基(葡萄糖IOg/L，可溶性糊精40g/L，酵母粉30g/L，pH 7.0)的三角瓶中，摇瓶转速220rpm、28 °C、培养120h，并在发酵24时添加0.6%的丙酸钠。至发酵结束时发酵液中纳他霉素产量通过HPLC法测定达到3.857g/L(参见图4未添加发酵废弃菌渣曲线)。而在发酵24h开始时添加20g/L的寇式隐甲藻ATCC30772发酵废弃菌渣测得的纳他霉素产量达到5.044g/L。(参见图4添加发酵废弃菌渣曲线)
通过对比例和实施例可以看出，添加寇式隐甲藻ATCC30772发酵废弃菌渣所得纳他霉素产量比未添加的纳他霉素产量提高至少30%。
【权利要求】
1.一种利用寇式隐甲藻ATCC30772发酵废弃菌渣制备高产量纳他霉素的方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)将隐甲藻ATCC30772发酵200-240个小时之后的发酵液离心，得菌体沉淀，用蒸馏水清洗3次，在80°C左右的烘箱中干燥，研磨成粉末； (2)在纳塔尔链霉菌发酵的0-72h间一次性加入寇式隐甲藻ATCC30772发酵废弃菌渣，发酵结束后得纳他霉素。
2.根据权利要求1所述的一种利用寇式隐甲藻ATCC30772发酵废弃菌渣制备高产量纳他霉素的方法，其特征在于: 包括以下步骤: (1)将隐甲藻ATCC30772发酵200-240个小时之后的发酵液离心，得菌体沉淀，用蒸馏水清洗3次，在80°C烘箱中干燥，研磨成粉末； (2)在纳塔尔链霉菌发酵的0-72h间一次性加入寇式隐甲藻ATCC30772发酵废弃菌渣，5-50g/L, pH 7.0-7.5，发酵结束后得纳他霉素。
【文档编号】C12R1/89GK104017846SQ201410245899
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年6月4日 优先权日:2014年6月4日
【发明者】卢诗瑶, 孙立洁, 袁丽霞, 肖尚, 吴金勇, 陈祥松, 姚建铭 申请人:中国科学院等离子体物理研究所, 武汉中科光谷绿色生物技术有限公司