专利名称：一种通过染色体加倍诱变和筛选小球藻高产新种质的方法
技术领域：
本项发明涉及一种通过染色体加倍诱变和筛选小球藻高产新种质的方法，适用于淡水养殖池塘水质净化和渔业增产。
背景技术：
池塘集约化养殖模式下，大量投喂配合饲料，其中的氮磷仅有9. 1%和17. 4%被鱼类同化，残留饲料和鱼类排泄物形成水体污染物，危害水生动物生长发育，诱发多种疫病，造成水产品质量下降。如何净化和回用养殖废水已成为制约渔业经济发展的技术瓶颈。利用小球藻等微藻处理水产养殖废水，一方面可以净化污水，另一方面可以获得有价值的藻类，促进养殖业的可持续发展。蛋白核小球藻pyrenoidosa )粉粗蛋白含量63%，不仅是一种高效的污水处理物种，也是一种优良的生物饵料资源。Domenico等利用小球藻在光暗循环为14 10的条件下处理模拟氨氮废水，发现氮的去除过程主要发生在有光的时段。小球藻去除水体污染物效果的好坏取决于其光合活性，并受控于氮、磷初始浓度、水温、光强、进水负荷、停留时间等一系列基本参数。虽然小球藻在处理水产养殖废水中显示了其优越性并取得了很大进展，但仍然存在一些问题有待解决。其中，选育和改良具有高效净化能力、营养价值高的新型小球藻藻种是重要的研发方向。
发明内容
本发明旨在提供一种淡水小球藻诱变培育方法，该方法可有效地诱变培育出水质净化能力强的小球藻高产优势藻株。为实现上述目的，本发明提供的一种淡水小球藻诱变培育方法包括以下步骤
(O前培养吸取Irnl液体 原藻种接种到含30ml HB-4液体培养基的三角瓶中进行诱
变前的活化培养，无菌操作，于27°C ±1 V、光照强度30001UX、光照周期为12h 12h条件下光照培养至对数生长期备用。(2 )诱变处理在HB-4培养液中添加不同浓度秋水仙碱，制成O. 01%、O. 02%、
O.03%、O. 04%、O. 05%、O. 06% 6个浓度梯度的小球藻诱变培养液，接种原藻种后于温度27°C ±1 °C、140r/min、光照强度30001ux、光照周期12h 12h条件下，分别培养6 h、12h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h、120h 进行诱变处理。(3)初筛和恢复培养每一时间水平诱变结束后，离心分离经诱变的藻细胞，接种到HB-4液体培养基，于27°C ±1 °C、140 170r/min、光照强度30001ux，光照周期为12h 12h、通气条件下进行恢复培养，每隔6h测定OD53tlnm值，以OD53tlnm峰值出现最早和峰值最大的实验组为优势突变组。(4)复筛和纯化培养运用涂布平板法，将将初筛获得的小球藻转接到HB-5固体分离培养基上进行分离培养，挑选色泽浓绿、半径大的藻株群落，获得优势突变型小球藻纯藻株，转接到试管内HB-4固体斜面培养基上纯化培养。(5)性能检测经分离筛选的藻株进行下面各项指标的检测①小球藻核及叶绿体DNA含量检测；
②小球藻叶绿素含量检测；
③小球藻稳定期藻细胞浓度测定；
④小球藻胞内可溶性蛋白质含量鉴定；
⑤小球藻水质净化效能鉴定。
以上给出了本发明的一种通过染色体加倍诱变和筛选创造小球藻高产新种质的方法，下面以具体实施方式
并结合附图对本发明作详细描述。图1小球藻核及叶绿体DNA的流式细胞仪测定结果。
具体实施例方式(I)前培养吸取Iml液体原藻种接种到含30ml HB-4 (配方见表I和表3)液体培养基的三角瓶中进行诱变前的活化培养，无菌操作，于27°C ±1 °C、光照强度30001UX、光照周期为12h 12h条件下培养至对数生长期备用。表1HB-4 配方
权利要求
1.一种通过染色体加倍诱变和筛选创造小球藻高产新种质的方法，包括以下步骤(1)前培养对液体原藻种进行诱变前的活化适应培养；(2)诱变处理配制小球藻诱变剂梯度浓度培养液，培养不同时间进行诱变处理；(3)初筛和恢复培养每一时间水平诱变处理结束后，在培养液中进行恢复培养，分别筛选小球藻浓度峰值出现时间最早和峰值最大的实验组；(4)优势突变型小球藻纯藻株的筛选和纯化培养运用涂布平板法，将初筛获得的小球藻转接到固体分离培养基进行分离培养，筛选优势突变藻株并进行连续多代的纯化培养；(5 )对分离的优势突变小球藻株进行生理性能检测。
2.根据权利要求1所述的通过染色体加倍诱变和筛选创造小球藻高产新种质的方法，其特征在于，其中步骤(I)所述的前培养条件是原藻种于27 °C±1 °C、光照强度30001ux、光照周期12h 12h条件下液体培养至稳定期。
3.根据权利要求1所述的通过染色体加倍诱变和筛选创造小球藻高产新种质的方法，其特征在于，其中步骤(2)所述的诱变处理方法是在HB-4培养液中添加不同浓度秋水仙碱，制成O. 01%,O. 02%,O. 03%,O. 04%,O. 05%,O. 06% 6个浓度梯度的小球藻诱变培养液，接种原藻种后于温度27 °C ±1 °C、140r/min、光照强度30001ux、光照周期12h 12h条件下，分别培养 6 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h、120h。
4.根据权利要求1所述的通过染色体加倍诱变和筛选创造小球藻高产新种质的方法，其特征在于，其中步骤(3)所述的初筛和恢复培养方法是诱变后的藻细胞接种到HB-4液体培养基于27°C±1 °C、140 170r/min、光照强度30001ux、光照周期为12h 12h、通气条件下恢复培养，以OD53tol峰值出现最早和峰值最大的实验组为优势突变组。
5.根据权利要求1所述的通过染色体加倍诱变和筛选创造小球藻高产新种质的方法，其特征在于，其中步骤(4)所述的优势突变型小球藻纯藻株的筛选和纯化培养方法为在HB-5固体分离培养基上，挑选色泽浓绿、半径大的藻株群落，转接到试管内HB-4固体斜面培养基上纯化培养。
6.根据权利要求1所述的通过染色体加倍诱变和筛选创造小球藻高产新种质的方法，其特征在于，其中步骤(5)所述的优势突变小球藻株生理性能检测是按下列指标进行①小球藻核及叶绿体DNA含量检测；②小球藻叶绿素含量检测；③小球藻稳定期藻细胞浓度测定；④小球藻胞内可溶性蛋白质含量鉴定；⑤小球藻水质净化效能鉴定。
全文摘要
本发明公开一种通过染色体加倍诱变和筛选小球藻高产新种质的方法，主要步骤包括对液体原藻种进行诱变前的活化培养，配制小球藻诱变剂梯度浓度培养液进行诱变处理，对诱变处理后的小球藻在培养液中进行恢复培养和初筛，然后将初筛获得的小球藻转接到固体分离培养基进行分离培养，筛选优势突变藻株并进行连续多代的纯化培养，检测其生长性能。本发明筛选的小球藻优势突变藻株发酵培养液应用于淡水养殖水体，可提高水质净化效果，并能提高滤食性鱼类及鱼苗的产量。
文档编号C12N1/12GK103060308SQ20131001111
公开日2013年4月24日 申请日期2013年1月14日 优先权日2013年1月14日
发明者蒋立科, 卢文轩, 杨坤 申请人:安徽省农业科学院水产研究所, 合肥汇科农业科技开发有限公司, 卢文轩