专利名称：腹泻性贝毒素软海绵酸oa小鼠生物学检测模型的制作方法
技术领域：
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本发明涉及一种腹泻性贝毒素软海绵酸OA的小鼠生物学检测模型的建立，可用于海洋生物技术领域。
背景技术：
腹泻性贝毒(DSP)是由有毒赤潮藻类鳍藻属々i/ opArsis和原甲藻属尸roroc朋^7孤中部分藻种产生的一类脂溶性天然化合物，主要成分为软海绵酸(OA)及其衍生物DTXs 。 DSP引起的中毒症状包括腹泻、恶心、呕吐、下腹部疼痛， 一般在食用后几小时，严重时短至30min发作，且无有效药物治疗。
目前，国内检测0A的方法主要是小鼠法、高效液相色谱法(HPLC)和免疫检测技术(ELISA)。但世界上大多国家还是将小鼠法和HPLC列为赤潮毒素警戒标准和检测方法。HPLC法可准确分析毒素的含量和种类，检测限可低至ng/g级，但样品前处理过程复杂，且仪器昂贵，需要专门的分析技术人员；免疫检测法虽然快速、高效，但亦存在抗体的提供不足和交叉反应等缺点；此外，蛋白质磷酸酶抑制试验检测法，具有灵敏、准确、快速、样品处理简单等优点，但该试验需要特殊的试剂及检测仪器，在我国基层普及有一定的难度。
而小鼠生物检测为藻毒素半定性分析方法，被美国公职分析化学家协会(AOAC)推广为DSP标准检测方法，同时也是唯一国际大多数国家普遍接受的统一方法。小鼠生物检测法虽然不像液相色谱-质谱法那样能精确定量毒素的含量，但因其具有可靠性强、使用广泛、有历史数据、能表达出样品中实际毒性、不需要复杂设备且操作程序简便易行等优点，被认为是比较可靠的腹泻性贝毒素定性与定量检测法，因而目前很多国家将其作为常规的筛检手段，被广泛应用于检测贝类中的腹泻性贝毒素。
但小鼠生物检测法主要缺点是生物体本身存在品系、性别和个体差异，试验结果会因所采用小鼠株系的不同而有差异。
发明内容
本发明的目的是要提供一种腹泻性贝毒素软海绵酸0A的小鼠生物学检测模型，它不但可靠性较强、使用广泛、有历史数据、能表达出样品中实际毒性，而且不需要复杂设备，操作程序简便易行。
3本发明的目的是这样实现的建立一种腹泻性贝毒素软海绵酸OA的小鼠生物学检测模型，包括以下步骤-
(1) 标准毒素的稀释
用稀释液稀释软海绵酸。将软海绵酸稀释为系列浓度，l化/mL、 2Pg/mL、 3化/mL、 5Pg/mL、7Pg/mL、 lOPg/mU 15Pg/mL。先进行预备试验，在此基础上再进行正式试验。
(2) 毒素LD5。值的确定
试验组每只小鼠腹腔注射lmL标准毒素液，空白对照组每只小鼠注射lmLW的吐温60溶液。从注射完毕到死亡时呼出最后一口气的时间为死亡时间，24h为一个观察周期。预试验每个浓度组注射小鼠3只，正式试验每个浓度组注射9只。详细记录小鼠的中毒症状与死亡情况，根据小鼠中毒死亡情况确定最小全致死和最大全不致死毒素浓度，并应用改良寇氏(Korbor)法计算LD5。；
(3) 建立剂量与中间死亡时间曲线
在确定LD5。的基础上，进一步增加毒素浓度，每个浓度组注射9只小鼠，以确定毒素剂量-中间死亡时间曲线和毒素剂量单位-中间死亡时间曲线。
所述的稀释液为含1%吐温60的9 g/L生理盐水溶液。
所述的中毒症状出现的早晚与毒素浓度有关，最早的在30min后出现症状，最晚的在10h之后出现， 一般在2h-7h后出现。典型症状为颤抖，痉挛，不时用前爪抓嘴或用嘴舔腹部，怕冷，蜷縮在一起，大多数小鼠出现排尿和腹泻症状；步态不稳，前后摆动，部分小鼠后腿僵直，以两条前腿拖动身体匍行；临死之前极度挣扎，眼球突出，尾巴变黑，呼吸急促，且张口呼吸；随后因呼吸障碍和心力衰竭而死。
所述的毒素剂量单位以鼠单位(MU)表示，腹泻性贝毒素1MU的定义是使一只体重约16-20g的小鼠在24h内死亡所需腹腔注射的毒素。
所述的小鼠为封闭群昆明系小鼠。
本发明通过建立小鼠生物学检测模型检测腹泻性贝毒素软海绵酸OA ，采用了封闭群昆明系小鼠为动物模型，建立了地方小鼠品系一个鼠单位所代表的腹泻性贝毒素毒性剂量值，具有重要的理论与实践意义。
因此，本发明具有以下优点
1. 检测方法可靠性较强、使用广泛、有历史数据、能表达出样品中实际毒性、不需要复杂设备且操作程序简便易行。
2. 实验对象昆明系小鼠品系稳定，价格低廉，数量充足。3.发明使用封闭群昆明系小鼠，确定了腹泻性贝毒素对我国昆明小鼠的腹腔注射LD5。，建立了剂量-死亡时间曲线和剂量单位-中间死亡时间曲线以及剂量单位-中间死亡时间相关直线，这些为利用昆明系小鼠检测腹泻性贝毒素的普及应用奠定了强有力的基础。
图1是毒素剂量-中间死亡时间曲线(Curve of OA dosage-death time);
图2是毒素剂量单位-中间死亡时间曲线(Curve of OA dosage MU-death time);
图3是剂量-死亡时间相关直线(Correlative line dosage-death time)。
具体实施方式
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本实施例中所用的材料为0A标准品(购自台湾藻类生物技术有限公司)，实验对象为昆明品系小鼠(体重19-21g,雄性，购于上海斯克莱实验动物有限责任公司)。
实施例l:腹泻性贝毒素LDsn的测定
首先用含1%吐温60的9 g/L生理盐水溶液，对0A标准品进行稀释，得到以下7个毒素浓
度(1Pg/mL、 2Pg/mL、 3Mg/mL、 5l^g/mL、 7Pg/mL、 10^g/mL、 15^g/niL)。进行预试验，记录
小鼠中毒死亡情况，确定其毒素最小全致死浓度为7^/mL，最大全不致死浓度为2^/mL(表l)。
表1毒素致死浓度结果
毒素浓度(pg/mL)
Concentration of toxin10 7 5 32 1
试验动物数/n
3 3 3 3 3
number of test animals死亡动物数/n
3 3 3 2 1
number of dead animals
在最小全致死和最大全不致死毒素浓度区间内设8个等比浓度组，分别为l. 95^/mL、2. 34Mg/mL、 2. 8lMg/mL、 3. 38Mg/mL、 4. 05Hg/mL、 4. 864g/raL、 5. 83Pg/mL、 7.00 Pg/mL,进行正式试验。记录中毒症状与死亡数，依此计算死亡率(见表2)。根据改良寇氏(Korbor)法计算得出logLDs。为0,603， LD5。/20g mouse约为4. 015[ig (200. 75Pg/kg);也就是腹泻性贝毒素0A对我国的昆明系小鼠腹腔注射所测定的1MU所代表的剂量约为4. 015Pg， 95%可信限为3. 826-4. 20扭g。
表2毒素剂量-死亡率结果
毒素浓度/ (pg/ml)剂量4ig试验动物数/n死亡动物数/n死亡率/%
Conen加tion of toxinDosageNumber of test animalsNumber of dead animalsDeath rate
7.007.0099100
5.835.839了78
4.864.869667
4.054.059556
3.383.38933
2.812.819111
2.342.349111
1.951.95900
实施例2:毒素剂量-中间死亡时间曲线和毒素剂量单位-中间死亡时间曲线的确定在确定LD5o值基础上，迸一步设置了10个毒素浓度组进行试验，以建立毒素剂量-中间
死亡时间曲线和毒素剂量单位-中间死亡时间曲线。各浓度组及其对应的毒素剂量、剂量单位
及小鼠中间死亡时间见表3。
表3剂量-中间死亡时间试验结果毒素浓度/(pg/ml)剂量&g剂量单位/mu中间死亡时间/h
Concentration of toxinDosag6Mouse unitMean time of death
20.020.04.9800.88
15.015.03.7401.20
12.012.02.9902.30
7.57.51.8684.60
6.86.81.6945.80
6.56.51.6197.20
6.06.01.4949.60
5.85.81.44512.67
5.55.51.37017.40
5.05.01.24522.26
根据表3的数据，分别获得毒素剂量-中间死亡时间曲线y = 600.57x'
6(图l)和毒素剂量单位-中间死亡时间曲线y =26.06x—2'257 (图2)。在剂量5.8 6.5ug范围内，剂量与死亡时间之间呈线性关系，此时，小鼠的死亡范围为7.20 12.6711，因此，在实际检测工作中，小鼠的死亡时间在上述范围内结果最佳。
将死亡时间t变为时间倒数l/t，对OA的毒素单位(MU)取对数(logMU)，再进行直线回归，得直线回归方程为y=0.5363x +0.1295，其中y代表西加毒素毒性单位的对数log MU， x代表时间倒数l/t，经计算相关系数为0.9488(图3)。
总之，本发明通过系列试验，求得昆明系小鼠一个鼠单位所代表的腹泻性贝毒素OA的剂量，建立了腹泻性贝毒素OA剂量与昆明系小鼠中间死亡时间的对应关系，从而为检测海产品贝类中是否含有腹泻性贝毒素OA及含量多少提供了行业参考标准，对研究贝类中OA含量的毒性具有重要意义。
权利要求
1.一种腹泻性贝毒素软海绵酸OA含量的小鼠生物学检测模型，其特征在于包括如下步骤(1)标准毒素的稀释用稀释液将软海绵酸稀释为7个毒素浓度1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、5μg/mL、7μg/mL、10μg/mL、15μg/mL的标准毒素液；(2)毒素LD50值的确定试验组每只小鼠腹腔注射1mL标准毒素液，空白对照组每只小鼠注射1mL1％的吐温60溶液；从注射完毕到死亡时呼出最后一口气的时间为死亡时间；24h为一个观察周期；预试验每个浓度组注射小鼠3只，正式试验每个浓度组注射9只；根据小鼠中毒死亡情况确定最小全致死和最大全不致死毒素浓度，并应用改良寇氏法计算LD50；(3)建立剂量与中间死亡时间曲线；在确定LD50的基础上，进一步增加毒素浓度，每个浓度组注射9只小鼠，以确定毒素剂量-中间死亡时间曲线和毒素剂量单位-中间死亡时间曲线。
2. 如权利要求1所述的生物学检测法,其特征在于所述的稀释液为含1%吐温60的9 g/L 生理盐水溶液。
3. 如权利要求1所述的小鼠生物学检测模型，其特征在于所述的小鼠为封闭群昆明系小鼠。
全文摘要
本发明涉及一种腹泻性贝毒素软海绵酸OA的小鼠生物学检测模型的建立，用于海洋生物检测领域。本发明使用封闭群昆明系小鼠，确定了腹泻性贝毒素对我国昆明小鼠的腹腔注射LD<sub>50</sub>，建立了剂量-死亡时间曲线和剂量单位-中间死亡时间曲线以及剂量单位-中间死亡时间相关直线，这些为利用昆明系小鼠检测腹泻性贝毒素的普及应用奠定了基础。本发明用于检测OA的可靠性较强、成本低廉，应用范围广，能表达出样品中实际OA含量，而且不需要复杂设备，操作程序简便易行。
文档编号A61K49/00GK101623505SQ20091005508
公开日2010年1月13日 申请日期2009年7月21日 优先权日2009年7月21日
发明者何培民, 柳俊秀 申请人:上海海洋大学