甲氧基聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚氨酶及其制备与应用的制作方法

专利名称：：甲氧基聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚氨酶及其制备与应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及用甲氧基聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚氨酶，及其制备与应用。
背景技术：
：早在30多年前，Storr和Burton就提出控制氨基酸在肿瘤治疗上的可能性(StorrJM，BurtonAF.Theeffectsofargininedeficiencyonlymphomacells.BrJCancer.30:50-59(1974))，其中，被研究的最多的是天冬酰胺酶，它能分解细胞生长和细胞生命维持所需的天冬酰胺。在许多白血病(Leukemia)患者中，白血病细胞与正常细胞不同，它们自己不能合成天冬酰胺，必须依靠外界提供的天冬酰胺来维持生存。天冬酰胺酶的治疗耗尽体内肿瘤细胞所需的游离天冬酰胺，从而导致肿瘤细胞死亡，而正常细胞不会受到太大影响。但是，L-天冬酰胺酶是来源于微生物，对人体来说具有很强的免疫原性，进入人体以后很容易诱导生成抗天冬酰胺酶的抗体，产生副作用并影响其疗效；但是，如同Y.K.Park等在AntieancerRes.1:373—376(1981)中描述的，由于L-天冬酰胺酶受其分子量大小的限制，进入人体后容易被肾脏过滤清除，从而影响其在体内的循环半衰期。用聚乙二醇共价修饰的大肠杆菌L-天冬酰胺酶降低了其抗原性，延长了其循环半衰期(Y.Kamisaki等，J.Pharmacol.Exp.Ther.216:410-414(1981));Y.Kamisaki等，Gann.73:47-474(1982))。正常细胞的生长不需要精氨酸，因为它们能通过由精氨琥珀酸合成酶和精氨琥珀酸裂解酶催化的一个两步反应从胍氨酸合成精氨酸。然而肝细胞瘤、黑色素瘤和其他一些的肉瘤不表达精氨琥珀酸合成酶，因而它们是精氨酸的营养缺陷型。精氮酸脱亚氨酶能催化精氨酸向胍氨酸的转化，可被用来清除精氨酸。这方面的研究工作，最早是J.B.Jones在"精氮酸脱亚胺酶对小鼠白血病成淋巴细胞的作用"，博士论文，TheUniversityofOklahoma,1-165页(1981)中开始研究的。他从恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)中提取的精氨酸脱亚胺酶(ADI)，在体外可以有效杀死肿瘤细胞，特别是肝癌和黑色素瘤相关的肿瘤细胞，但是从恶臭假单胞菌中提取的ADI在体内却没能表现出其应有的作用，研究发现是因为中性pH下几乎没有酶活性，并且因为恶臭假单胞菌中提取的精氨酸脱亚胺酶(ADI)对实验动物来说具有很强的免疫原性，进入机体以后很容易诱导生成抗体，形成抗原-抗体免疫复合物从实验动物的血液循环中被快速清除，如Takakuetal，Int.J.Cancer,51:244-249(1992)和美国专利NO.5，474,928中描述的，在此将其公开全部引为参考。Takaku等人用聚乙二醇通过氰尿酰氯基团对从精氨酸支原体中提取的精氨酸脱亚胺酶进行化学修饰。修饰后的精氮酸脱亚胺酶虽然在体外的生物学活性显著下降，但是，由于PEG修饰降低了精氨酸脱亚胺酶的免疫原性，因此在体内保留了抗肿瘤的活性(Takaku等，Jpn丄Cancer.Res.84:1195-1200(1993))。然而，限于当时的技术水平，采用的修饰方式为氰尿酰氯连接基团，这种连接方式并不稳定，而且有可能释放出有毒的代谢产物，因此限制了其在临床上的使用。进一步的，Clark,MikeA在美国专利NO.6183738中所提到的，通过用琥珀酰亚胺基团作为连接基团来修饰精氨酸脱亚胺酶，避免了用氰尿酰氯基团修饰存在的缺陷，也同样制备获得了在动物体内具有抗肿瘤的活性的PEG化精氨酸脱亚胺酶，并在人体中的应用进行了研究(StevenACurley，Hepato-Gastroenterology，50:1208-1211(2003);Francescolzzo,JClinOncol.22:1815-1822(2004);PaoloA.Ascierto，JClinOncol23:7660-7668(2005))。但是，对于常规的用聚乙二醇来修饰生物活性的蛋白，包括精氨酸脱亚胺酶，L-天冬酰胺酶等都会导致酶活性的严重下降，甚至完全丧失。(RezaMehvarJ.PharmPharmaceutSci.3:125-136(2000))。例如O.Schiavon(IIFarmaco55:264—269(2000))研究了用不同的聚乙二醇来修饰Uricase，最终获得的聚乙二醇化Uricase生物学活性仅为原来的0-40%之间；YuyingTan(PROTEINEXPRESSIONANDPURIFICATION12,45—52(1998));ZhijianYang(CANCERRESEARCH,64:6673~6678(2004)研究制备聚乙二醇化methioninase用于肿瘤的治疗，用重均分子量为5000的聚乙二醇修饰methioninase后，也仅保留了40%的生物学活性。而且，对于一个蛋白分子结合多个聚乙二醇后，随着聚乙二醇结合数量的增加，对活性的影响更加显著。FrederickW.Holtsberg等(JournalofControlledRelease,80:259-271(2002))在研究聚乙二醇修饰精氨酸脱亚氨酶时发现，当一个精氨酸脱亚氨酶结合8-10个PEG2o,分子时，其酶活性仅保留了不到50%。对于用于治疗用途的这些PEG修饰的酶，保留生物学活性和增加半衰期，降低免疫原性是一个矛盾。增加PEG修饰程度，可以增加酶在体内的半衰期，降低免疫原性，但是，随着PEG修饰度的增加，往往会导致活性的急剧下降，甚至丧失(YuyingTan，ProteinExpressionandPurification,12:45—52(1998))。如何寻找一个既可以保留或基本保留被修饰酶的活性，又可以增加酶在体内的半衰期，降低免疫原性的制备方法，是人们一直在努力寻找的目标。另一方面，聚乙二醇(PEG)分子必须通过一个活化基团活化，才能与蛋白质表面的反应基团反应，以共价键形式连接到蛋白质分子上。但是，由于蛋白质分子量巨大，因此其潜在的可以与活性PEG反应的基团也是数目众多。在不同的位点结合PEG，其产物的稳定性，生物学活性等性质都是不同的。Yu-SenWang(AdvancedDrugDeliveryReviews54:547-570(2002))研究重组人干扰素a2a(IFNa2a)的PEG修饰时，就对此问题进行了详细阐述。当用12KDsuccinimidylcarbonatePEG(SC-PEG)修饰时，IFNa2a分子中包括N端氨基，Lys,His等共有14个基团可能被修饰，对于单修饰的PEG-IFNa2a，最终分析证明修饰制备所得的PEG-IFNa2a是由14种不同位点结合有一个PEG分子组成的混合物，而且这14种PEG-IFNa2a的活性是不一致的，其相对生物学活性最高保留了37%,最低仅保留了6%。同样的，OlaffiKinstler等(美国专利US5985265，1999年公开)研究重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)的PEG修饰时也发现，当采用20KD的SCM-mPEG(N-hydroxysuccinimidylestersofcarboxymethylmethoxypolyethyleneglycol)修饰时，最终制备获得的单一修饰的PEG-rhG-CSF是由N端，Lys35，Lys41分别结合有一个PEG分子组成的混合物。进一步分析这三种不同的PEG-rhG-CSF分子，发现N端修饰的PEG-rhG-CSF活性最高，保留了原有活性的68%，Lys35和Lys41修饰产物活性分别为56n/。和2P/。，而且Lys35修饰产物是不稳定的，在体外很容易被降解。为了解决PEG修饰rhG-CSF时存在的这些问题，该专利方法提供了一种特别的低pH修饰方法，使PEG能定向结合于rhG-CSF的N端，从而获得均一，稳定而且高活性的PEG-AG-CSF。但是，这些经验都无法用于精氨酸脱亚氨酶的PEG修饰。这是由于精氨酸脱亚氨酶的结构都比这些蛋白要复杂的多，其一级结构中有28个伯胺(视不同来源，精氨酸脱亚氨酶的伯胺数目会略有不同)，现有的修饰方法，无法选择对哪些伯胺基团进行修饰。因此，无论结合的PEG数量的多少，最终的修饰产物总是不均一的。以有28个伯胺的精氨酸脱亚氨酶为例，如果平均修饰有5个PEG分子，则大约有107种组合，如果平均结合10个PEG分子，则大约有5X10"种组合。即使某些伯胺基团由于空间位阻的原因而不能与活性PEG反应，但是修饰反应最终所产生的总产物种类数目仍然是惊人的。如果采用美国专利5985265中特殊的修饰方法，使PEG定点结合于精氨酸脱亚氨酶的N端，虽然可以保持相对较高的活性并获得均一产物，但是N端结合PEG无法完全屏蔽精氨酸脱亚氨酶的免疫原性位点，仍然无法在临床研究使用。因此，现有的PEG修饰的精氨酸脱亚氨酶存在很多的弊端l.有些伯胺基团处于精氨酸脱亚氨酶活性位点，被修饰后会严重影响生物学活性，因此临床使用势必增加酶的用量，但酶用量的增加又会增加免疫原性；2.由于修饰位点的不确定，因此精氨酸脱亚氨酶具有强免疫原性的位点能否被屏蔽也是不确定的；3.由于修饰产物是由数量庞大的混合物组成，用现有的分析方法无法确定修饰混合物中具体每种修饰产物的结构和数量，因5此没有很好的质量控制手段来保证修饰的精氨酸脱亚氨酶混合物的质量稳定性。这些缺陷带来的最终结果是用现有的修饰方法获得的PEG化精氨酸脱亚氨酶在不同批次之间是有区别的，人们无法预测其生物学活性和免疫原性，也缺乏有效的手段进行控制。这些缺陷己经从现有的PEG化精氨酸脱亚氨酶临床试验中已经得到表现，如不确定的抗肿瘤药效，重复给药引起的免疫原性以及由此引发的一些严重的毒副作用，如严重的肝脏损伤，过敏反应，elevatedlipase(Li-JiuanShen，CurrentOpinioninMolecularTherapeutics8:240-248(2006))。许多研究已经证明，增加蛋白质或酶的修饰程度能增加修饰物的循环半衰期，然而增加修饰程度却会减少蛋白或酶的生物学活性(RameshrajaP等，Currentaspectinpharmacologyofmodifiedhomoglobins[J]AdvdrugdelivReview.40,185(2000))。一般地，PEG修饰率低对酶活力影响小，但是半衰期短，被屏蔽的抗原决定簇也少，因此对降低免疫原性的作用也小；PEG修饰率高，半衰期更长，修饰蛋白中被屏蔽的抗原决定簇也多，因此对降低免疫原性的作用大，但是对生物学活性的影响也高。要提高修饰率，降低免疫原性，延长半衰期而不降低被修饰酶的生物学活性，在目前的技术条件下始终是一件极其困难的工作。本发明针对目前存在的这些问题，研究制备了一种高活性，无免疫原性的甲氧基聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚氨酶，来克服现有产品存在的弊端。
发明内容本发明的目的是克服现有技术中的缺陷，提供一种mPEG修饰的精氨酸脱亚氨酶及其制备与应用。本发明一方面公开了一种甲氧基聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚氨酶的制备方法，包括下列步骤1.将精氨酸脱亚氨酶安慰性底物与精氨酸脱亚氨酶混合反应，使精氨酸脱亚氨酶安慰性底物与精氨酸脱亚氨酶的活性位点可逆结合；2.将结合了精氨酸脱亚氨酶安慰性底物的精氨酸脱亚氨酶用甲氧基聚乙二醇修饰；3.分离纯化甲氧基聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚氨酶并去除安慰性底物。步骤1中，精氨酸脱亚氨酶安慰性底物对精氨酸脱亚氨酶的摩尔比为1:1-50:1，在满足精氨酸脱亚胺酶活性结合位点被安慰性底物饱和前提(原则)下，优选的比例范围是3:1-10:1。所述精氨酸脱亚氨酶安慰性底物选自BOC-精氨酸或FMOC-精氨酸。精氨酸脱亚氨酶安慰性底物与精氨酸脱亚氨酶混合反应可在各种常规的甲氧基聚乙二醇修饰精氨酸脱亚氨酶用的缓冲体系中进行，如100mMBicine，pH8.0。步骤2中，将精氨酸脱亚氨酶安慰性底物的精氨酸脱亚氨酶用甲氧基聚乙二醇修饰可采用已知的各种常规的甲氧基聚乙二醇修饰精氨酸脱亚氨酶的条件进行。步骤3中，甲氧基聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚氨酶的纯化可采用巳知的甲氧基聚乙二醇修饰精氨酸脱亚氨酶纯化方式进行，这样可以获得高活力的甲氧基聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚氨酶。由于安慰性底物与酶之间是可逆性结合的，因此在吸附性层析纯化过程中，修饰后的酶会与填料结合，但是未结合安慰性底物直接流出，与酶结合的安慰性底物在冲洗过程中动态解离而被去除。进一步的，步骤3的分离纯化步骤，包括将步骤2的产物通过结合有抗精氨酸脱亚氨酶抗体的亲和层析柱去除暴露有免疫原性位点的聚乙二醇化精氨酸脱亚氨酶。分离纯化步骤中增加该步骤可以获得没有免疫原性的甲氧基聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚氨酶。如本发明实例列举的，亲和层析柱可以为CNBrSepharose4B亲和层析柱。抗精氨酸脱亚氨酶抗体优选抗精氨酸脱亚氨酶多抗。结合有抗精氨酸脱亚氨酶抗体的亲和层析柱中，抗精氨酸脱亚氨酶抗体与亲和层析柱的混合比例较佳的为5土0.5mg抗体:lml填料。本发明第二方面，公开了由上述方法获得的甲氧基聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚氨酶。本发明获得的聚乙二醇化精氨酸脱亚氨酶的基本保留了原有活性，更进一步的，还可以没有免疫原性。其中，所述的精氨酸脱亚氨酶是精氨酸支原体、人型支原体或关节炎型支原体的精氨酸脱亚氨酶。甲氧基聚乙二醇通过连接基团与所述精氨酸脱亚胺酶的伯胺共价相连。所述的连接基团是琥珀酰亚胺基团，包括琥珀酸琥珀酰亚胺酯、丙酸琥珀酰亚胺酯、羧甲酸琥珀酰亚胺酯、琥珀酰亚胺基琥珀酰胺、N-羟基琥珀酰亚胺或其组合。所述的甲氧基聚乙二醇重均分子量范围在5,000到60,000之间。所述的甲氧基聚乙二醇是线性的，也可以是分枝型的。所述的精氨酸脱亚胺酶与3个到10个聚乙二醇分子共价连接，优选的是5-8个甲氧基聚乙二醇分子共价连接。本发明的第三方面，公开了一种药物组合物，它通常含有安全有效量的本发明PEG-ADI以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)缓冲液、氨基酸、糖类、注射用水及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。本发明的化合物可与磷酸盐缓冲液或任何本领域技术人员己知的适当溶液相混合。根据需要，所述的PEG-ADI制剂可以固体(冷冻干燥)或液体剂型施用。本发明第四方面，还公开了上述mPEG修饰的精氨酸脱亚氨酶在制备治疗癌症药物上的应用。所述治疗癌症药物可以是治疗肉瘤、肝细胞瘤或黑色素瘤等癌症的药物。本发明中，术语"聚乙二醇"或"PEG"是指环氧乙垸和水的直链或支链形式缩聚物的混合物，由一般分子式HO(OCH2CH2)nOH来代表，在此n至少为4。用"聚乙二醇"或"PEG"连同其后面的数字后缀一同来表示它的大约平均分子量。例如，PEG2,q是指平均分子量大约为20,000的聚乙二醇。术语"甲氧基聚乙二醇"或"mPEG"是指通过环氧乙烷与甲氧根离子聚合产生的聚乙二醇术语"免疫原性"是指能剌激机体产生抗体和致敏淋巴细胞的特性。术语"安慰性底物"是指能与酶的活性中心结合，但是不能作为酶的底物的一类化合物。术语"修饰"是指用高分子化合物于蛋白质上某些基团通过共价键连接的过程。术语"生物学活性"是指在生物体内或活细胞内具有的某种生理功能。术语"半衰期"是指药物从体内消除一半所需的时间，也是血药浓度下降一半所需要的时间，用"/2表示。术语"黑色素瘤"可以是一种从皮肤或其他器官(包括口腔、食道、肛门、阴道、小脑膜(leptomeningers)、结膜或眼睛)的黑色素细胞系统发展而来的恶性或良性肿瘤。术语"肝细胞瘤"可以是肝的一种恶性或良性肿瘤，包括例如肝细胞性癌。在本发明的公开中，以下的缩写可能被应用ADI,精氨酸脱亚胺酶；rADI，重组精氨酸脱亚胺酶；raADI，重组精氨酸支原体来源精氨酸脱亚胺酶；PEG，聚乙二醇；mPEG,甲氧基聚乙二醇；mPEG-rADI，甲氧基聚乙二醇修饰重组精氨酸脱亚胺酶；BOC-Arg，叔丁氧羰基精氨酸Fmoc-Arg，芴甲氧羰基精氨酸；SS，琥珀酸琥珀酰亚胺酯；SSA，琥珀酰亚胺基琥珀酰胺；SPA，丙酸琥珀酰亚胺酯NHS，N-羟基琥珀酰亚胺;PB,磷酸缓冲液；PBS,磷酸盐缓冲液。本发明的第一个创新是在修饰反应体系中加入特定的精氨酸脱亚氨酶的安慰性底物，特异性保护ADI酶活性中心不被破坏，以提高修饰后的mPEG-ADI的活性。PEG修饰导致蛋白活性的下降，主要是因为PEG对蛋白活性位点中赖氨酸侧链游离NH2基团修饰引起。本发明的研究者通过大量的研究发现，在PEG修饰反应过程中添加ADI的安慰性底物，如BOC-Arg(A^-(feW陽Butoxycarbonyl)-L-arginine,分子式HN=C(NH2)NH(CH2)3CH(COOH)NHC(0)OC(CH3)3)，Fmoc-Arg(A^-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)-L-arginine，分子式C21H24N404)等，这些安慰性底物可以与ADI的催化活性位点可逆性地结合，因此在PEG修饰时由于空间位阻的作用，避免了位于活性位点的赖氨酸被PEG结合(如图1所示)，从而达到保护活性位点的作用，并且使得在同样数量mPEG结合到rADI的情况下，与不加安慰性底物相比，修饰获得的酶活力大大提高。这种保护性修饰方法通过三步反应来完成第一步，rADI与可逆性保护试剂BOC-Arg结合；第二步，添加活性PEG进行PEG修饰反应；第三步，分离获得修饰产物。根据实例2提供的方法，比较了在不同修饰程度下采用本专利方法的优越性。由表I的结果可看出，当修饰率低时，添加安慰性底物对酶活力保留的影响较小。而当raADhSPA-PEG2,比例为1:30(摩尔比)时未添加保护试剂的修饰产物酶活力保留40%，而添加保护试剂的选择性修饰产物的酶活性保留提高到近80%。表1添加安慰性底物对SPA-PEGM(K)()修饰ADI活性的影响raADI:SPA-PEG2Q,比例相对ADI酶活性(％)保护试剂(-)保护试剂(+)1:588.391.0h1565.184.31:3045.778.5采用本发明上述方法修饰获得的PEG-ADI还是不均一的，ADI分子上通常会连接数量不等的PEG分子，因此，始终还有部分PEG-ADI暴露有较多的抗原决定簇从而在重复给药后产生免疫原性。本发明的另一个创新是采用特殊的分离纯化方法，制备出免疫学上更均一的PEG-ADI。这种方法通过如下方式来实现的。首先是制备抗ADI的抗体。将ADI样品免疫小鼠，如Balb/c鼠，然后用提取免疫后的鼠血清，经蛋白A亲和层析柱分离获得抗ADI的鼠抗体。然后将抗ADI的鼠抗体用化学方法结合于层析载体，如溴化氰活化的琼脂糖树脂(CNBr-Sepharose)，将修饰获得的PEG-ADI混合物流经该抗体柱，PEG-ADI混合物中那些还暴露有与抗体结合位点，也就是具有免疫原性的PEG-ADI被特异性结合而从混合物中除去，从而获得免疫学上均一的PEG-ADI制品。类似的，也可以免疫兔，羊甚至黑猩猩等动物，来获得相应的抗ADI抗体，用来上述用途。本发明的化合物的治疗有效量是能有效地抑制肿瘤生长的量。通常，治疗以小剂量开始，然后逐渐增加剂量直至达到完全分解机体内的精氨酸。通常，本发明的化合物的治疗剂量可以是从约1到30U/kg，每周一次到大约每两周一次。此外，本发明的PEG-ADI还可与其他治疗剂联合使用，如化学抗肿瘤治疗剂以达到更好的抗肿瘤治疗效果。本发明的主要优点在于通过在修饰反应中添加安慰性底物来保护活性位点，修饰获得的PEG-ADI与现有的修饰型PEG-ADI相比，在相同的修饰率下，具有更高的生物学活性。其次，通过特异性的亲和层析去除有免疫原性的PEG-ADI,最终制备的PEG-ADI在活性高，免疫学上更均一，在体内没有免疫原性，从而在临床中更为安全有效。图l:保护反应示意图图2:重组aADI(raADI)RP-HPLC图图3:正常鼠免疫原滴度试验结果图4:H22移植瘤模型药效试验具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例1:重组ADI的生产许多研究已经表明，多种支原体来源的ADI，虽然序列上有一定差异，但是其酶学特性是相同的。如精氨酸支原体(ATCC23243)(SEQIDNO:l)、人形支原体(ATCC23114)(SEQIDNO:2〉、关节炎支原体(ATCC23192)(SEQIDNO:3)来源的ADI,氨基酸序列同源性超过96%。文献研究(Clark,MikeA，美国专利NO.6183738)已经证明从比活性、Km、Vmax，和最适pH等方面证明这些酶是生化不可区分的。因此这些不同来源的ADI都适用于本发明。本发明以下的实例中以精氨酸支原体来源的ADI(简称aADI)做举例说明。aADI基因来源于精氨酸型支原体，由于支原体的部分密码子不能被大肠杆菌有效识别和翻译，所以我们采用了全合成的方式，在不改变氨基酸结构的前提下以大肠杆菌偏爱的密码子来设计并合成aADI的全基因(见SEQIDNO:4)。参照S.Misawa在J.Biotechnology，36:145-155(1994)文献方法构建aADI表达株，并复性和纯化。具体方法简述如下aADI重组菌经高密度发酵，离心，收集菌体，高压匀浆破碎菌体，离心收集包涵体。lg包涵体溶解在15ml的增溶液(6M盐酸胍，5mMEDTA，lOmMTris，pH8.5)中，室温搅拌2小时。加入75(3-巯基乙醇继续搅拌30min。然后将增溶液用1800ml的复性液(lOmMPB，pH7.2)缓慢稀释，15'C搅拌复性48小时。复性液用蒸馏水稀释两倍，上样于以流动相AUOmMPB，pH7.2)预平衡好的DEAESepharoseFastFlowXK50/20阴离子交换柱。用含0.5mol/LNaCl的流动相A以50ml/min的速度洗脱，收集目标峰。DEAE柱洗脱的目标峰中加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为1.0mol/L，上样于以流动相A(lOmMPB，l.Omol/L硫酸铵pH7.2)预平衡好的PhenylSpharoseHPXK26/20疏水层析柱。以lOmMPB，pH7.2为流动相B,以10倍柱体积内硫酸铵由l.Omol/L降至0.1mol/L的线性梯度洗脱，收集目标峰。纯化后的重组aADI(raADI)经RP-HPLC证明纯度达到98%(见附图2)。每克包涵体最终获得约10毫克蛋白。分子筛层析分析的结果表明，mADI为二聚体活性状态(约90KD)。实施例2.ADI酶活性测定ADI以精氨酸(Arg)为底物，产物胍氨酸能与血尿氮试剂(BUN)在IOO'C高温下反应显红色。反应体系中加入终浓度10mMArg,5ngADI，补充20mMPB(pH7.2)至500ul，37'C准确反应30min后，取50ul反应液加入血尿氮试剂(BUN)中，混匀，沸水浴lOmin，最后测OD54o,以胍氨酸为标准品作标准曲线。空白对照为不加ADI的血尿氮试剂(BUN)。从标准曲线上换算反应底物胍氨酸的含量(timol)。酶活力单位的定义1个酶活力单位(U)定义为37°C，1分钟内催化lumol精氨酸完全转化为lfxmol胍氨酸的酶活力。用考马斯亮蓝法测定蛋白含量，计算ADI酶的比活力。最后测得纯化后的raADI的比活力约为33U/mg。实施例3:raADI的PEG修饰修饰实验分两组进行反应(1):在100毫升1毫克/毫升的raADI溶液(缓冲体系为100mMBicine，pH8.0)中，按1:30摩尔比加入PEG试剂(mPEG2G。M-SPA，，Nektar)。室温下搅拌反应1小时。修饰后的产物PEG-raADI用Phenyl-SepharoseHP纯化，收集相应目标峰，最后用G25脱盐柱除去(NH4)2S04。最终制备所得产物命名为mPEG2,o-raADI。反应(2):除了先在raADI溶液中加入10毫克/毫升的BOC-Arg(对应BOC-Arg:raADI的摩尔比为5:1)，纯化修饰产物可在洗脱前的平衡阶段适当增加平衡时间，利用安慰性底物与酶之间的可逆性结合与解离特性，则能方便的去除之，其他条件与反应(l)完全一致，最终制备所得产物命名为P-mPEG20000-raADI(protectedmPEG20000-raADI)。反应(3):除了BOC-Arg:raADI的摩尔比为l:1夕卜，其余同反应2。反应(4):除了安慰性底物采用Fmoc-Arg,且Fmoc-Arg:raADI的摩尔比为50:1夕卜，其余同反应2。精氨酸脱亚胺酶的修饰程度的测定参照A.Abuchowski等在J.Biol.Chem，252，3582-3586(1977)描述的方法进行，即用三硝基苯磺酸(TNBS)方法滴定游离氨基，通过比较PEG修饰前后游离氨基变化，确定修饰程度。酶活性检测方法与实施例1一致。检测结果见表2表2反应PEG平均修饰数目比活性(U/mg)相对raADI酶活性(%)1mPEG2oooo-raADI8.215.145.72P-mPEG20000-raADIA8.525.978.5P-mPEG調o-raADIB8.324.273.34P-mPEG讓o-raADIC8.223.771.8实施例4:ADI鼠多克隆抗体的制备将纯化的raADI溶于无菌的生理盐水中，然后与等体积的弗氏完全佐剂混合乳化制成免疫抗原溶液，采用皮下多点注射方法进行免疫处理，按100yg/raADI(次.只)的剂量免疫6周龄Balb/c小鼠20只，随后每次间隔2周再加强免疫2次(100ug/raADI与弗氏不完全佐剂)，35-40天后摘小鼠眼球取血，静止后离心收集血清，即得ADI小鼠多克隆抗体，血清样品-7(TC低温保存备用。实施例5:亲和层析制备免疫学均一的P-PEG400(K)-raADI含抗raADI的多克隆抗体的腹水1500g离心10分钟去除细胞。上样于用平衡缓冲液(20mMPB,pH7.0)预先平衡好的HiTraprProteinAFF5ml柱，再用平衡缓冲液平衡5个柱体积，然后换用0.05M柠檬酸钠(PH4.0)的洗脱缓冲液洗脱，收集目标峰。含raADI多克隆抗体的组分按每毫升50ixL的比例加入lM的磷酸钠(pH8.0)以中和pH。将纯化的raADI多克隆抗体与以50mM磷酸盐缓冲液，pH8.0预处理过的CNBrSepharose4B亲和层析填料按5mgprotein:lml填料的比例混合，4。C过夜，以5倍体积的50mMTris-Cl，pH8.5的缓冲液洗脱未结合的蛋白。制备得到结合有raADI多克隆抗体的CNBr-Sepharose4B亲和层析柱。将实施例3反应的P-PEG2oo(X)-raADI的样品于PBS中透析平衡除盐后,缓慢上样至预先用PBS充分平衡的结合有PEG-raADI多克隆抗体的CNBr-Sepharose4B亲和层析柱上，收集流穿峰，用截留分子量为10000MWCO的AmiconUltm-4超滤管浓縮，比活性及酶活性检测结果见表3。表3:<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>实施例6:正常鼠免疫原性试验选取10只6周龄Balb/C小鼠，分成3组，每组5只。分别肌注10U的mPEG2GOoo-raADI，P-mPEG2DOo()-raADI，取反应2的产物，未经亲和层析纯化的P-mPEG2W)WrraADI(命名为P-mPEG2,()-raADI-W)，每周注射一次，共给药五周。分别在注射前、注射后第三周、第五周时在小鼠尾静脉取血检测抗ADI抗体的滴度，抗体滴度检测采用ELISA法，96孔板包被ADI蛋白，二抗为碱性磷酸酶标记的羊抗鼠多抗。结果如图3所示。结果表明经亲和层析纯化的P-mPEG2。,-raADI比未经亲和层析纯化的P-mPEG2,o-raADI免疫原性有所降低，而未经安慰性底物结合的mPEG2(KKX)-raADI免疫原性最高。实施例7:H22移植瘤模型药效试验为验证P-PEG2G(X)Q-raADI抑制肝细胞性肝癌的作用，随机选取30只6周龄Balb/C小鼠制备荷瘤鼠模型，每只鼠于背部皮下注射5X10S个小鼠肝癌细胞H22，荷瘤后让瘤体生长到大约直径0.5cm，分成4组，分别为P-PEG2,o-raADI治疗组、raADI治疗组、生理盐水组，并以10只正常的Balb/C小鼠为对照组。分别肌注10IUP-PEG2(xK)o-raADI，10IUraADI,生理盐水0.02ral/次'只。每周给药一次，共给药二周，停药后小鼠继续饲养观察二周。与raADI治疗组和生理盐水对照组比较，P-PEG2o,-raADI对H22荷瘤小鼠生存率明显提高，至观察期结束，荷瘤小鼠100%存活，在统计学上均有显著差异(图4)。表4的结果说明P-PEG2QWK)-raADI对H22移植瘤的生长具有显著的抑制效应。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。〈110>杭州基伟生物技术有限公司〈120〉甲氧基聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚氨酶及其制备与应用<130>PCNJW090942<160>4<170>Patentlnversion3.1〈210〉1<211>409<212>PRT<213〉Mycoplasmaarthritidis<400>1MetSerValPheAspSerLysPhe15lieGlyGluLeuGluThrValLeu20LysGlylieHisValTyrSerGlu1015ValHisGluProGlyLysGlulie2530AspTyrlieThrProAlaArgLeuAspGluLeuLeuPheSerAlalie354045UuGluSerHisAspAlaArgLysGluHisLysGluPheValAlaGlu505560LeuLysLysArgGlylieAsnValValGluLeuValAspLeulieVal65707580GluThrTyrAspLeuAlaSerLysGluAlaLysGluLysLeuLeuGlu859095GluPheLeuAspAspSerAlaProValLeuSerAspGluHisArgAla100105110AlaValLysLysPheLeuGinSerGinLysSerThrArgSerLeuVal115120125GluTyrMetlieAlaGlylieThrLysHisAspLeuLyslieGluSer15AspLeuGluLeulie145AspProPheAla135ValAspProMet150ValGlyAsnGlySer165GinArgGluThrTyrLysVaJArg180LysLeuValAsn140ProAsnLeuTyrPheThrArg155160ValThrlieHisTyrMetArg170175PheSerArgPheValPheSerAsnHisPro195SerlieGluGlyLeu185ProTrpTyrTyrGlyLeu210LeuValValGlyVal225LeuAlaLysAsnThr200AspValPheGly215GluArgThrAspSer230LysAlaAsnLyslie245ValAlalieAsnValProLysTrp260MetLeuAspLyslieTyr220LeuGinThrlie235CysGluPheLysVal190AspProAlaGlu205AsnAsnAspThrGlu250Asn丄euMetHisTrpLeuThr275ValPheLysPheAsnAsp290AlaProGinProVal305SerlielieGlyAsp280TrpAspTyrAsp295AsnGlyLeuProThr265LysPheLeuTyrThrLeu240Arglie255LeuAspThr270SerProlieAla285AsnGlyGlyAspAsp310LysProThrLeuLys325AsplieGluArgAlaSerGinlie340ValAlaProGlyLeuVal300LeuGluAspLeuLeuLys315320lieProlieAlaGlyAlaGly330335ThrHisPheAspGlyThrAsnTyrLeuLysThrlie360AlaGlu345VallieGlyTyrAla355AsnAlaAlaLeuGluAlaAlaGlylieThrValLeuProPheAla365ValGly350ArgAsnGlu1370375380ArgGlyAsnGinLeuSerLeuGlyMetGlyAsnAlaArgCysMetSer385390395400MetProLeuSerArgLysAspValLys405〈210>2<211>409〈212>PRT〈213〉Mycoplasmahorainis〈400〉2SerValPheAspSerLysMet1lieAspLeuMet65GluGlyTyrGlu50LysGlulie35SerLeu20Thr5GluThrValProAlaArgHisAspAlaAspArgGlyThrTyrAspThrPheLeuAlaValPheMet130Arg115MetGlu100AlaLeu85Glulie70AlaArg55AsnSerThrValPheLeuLeuSerGlylieThr135PheAsnGlylie10LeuValHisGlu25LeuAspGluLeu40LysGluHisGinValValGluLeu75LysAlaAlaLys90ProVeilLeuThr105SerLysProThr120LysTyrGluLeuHisProLeuSer60ThrGluGluHisGly140ValTyrSerGlu15GlyArgGlulie30PheSerAlalie45PheValLyslieAspLeuValAla80GluPhelieGlu95MaAsnLysLys110GluMetValGlu125ValGluSerGluAsnGluLeulieValAspProMetProAsnLeuTyrPheThrArgAsp145150ProPheAlaSerValGlyAsnGly165lieValArgArgArgGluThrLeu180LeuValLysThr155ValThrlieHisPhe170AlaArgPheValHisProLys195MetProlieGluGlyGly210ValValGlyValSer225AlaLysAsnliePhe185TrpTyrTyrAsp160MetArgTyr175PheArgAsn190AlaMetLysProTrpTyrTyrAsdPro200205ValPhelieTyrAsnAsnGluThrLeuAsp215ArgThrAspLys245AlalieAsnValProLysTrpThrVal260LeuAspLysAsnLysPheLeuTyrSerAsn265PheLeuAsp235ValGlu250LeuMetAsn220ThrlieThrGlu230AlaAsnLysGluValGluPheLysArgLeuLeu240lieVal255ThrTrpLeuThrMetLeuAspLysAsnLys275280PheLysPheTrpAspTyrAspLeuValAspVal290ProGinProGinLeu305lielieAsnLysAsp295AsnGlyLeuPro310ProValLeulieHisLeuAsp270ProlieAlaAsn285GlyGlyAlaGluGlu325lieAlaArgGluThrGluMetGlu340LysProGlyLeuVallieGlyTyrAspThr345lieleuAsp315Prolie330AsnPheAsn300LysLeuLeuGlyAspAlaSer320GlyAlaGlyAla335AsnTyrGlyLeuAlalieLysProGlyLeuVal355360AlaAlaLeuLysAlaAlaGlylieThrThr350AsnGluLysArg365LeuProPheHisThrAsnAlaAlaLeuLysAlaAlaGlylieThrVal370375380GlyAsnGinLeuSerLeuGlyMetGlyAsnAlaArgCysMetSerMet385390ProLeuSerArgLysAspVal405〈210>3<211>410<212>PRT<213>Mycoplasmaarginini〈400〉3SerValPheAspSerLys395400LysTrpMet1lieAspLeuLeu65GluGlyTyrGlu50LysGlulie35SerLeu20Thr5GluSerValProAlaArgHisAspAlaAlaAsnAspThrTyrAspGluPheLeuValValGluAsp145Asplie130HisArg115MetGlu100AsnLeu85Asplie70AlaArg55AsnPheLysLeuVal25LeuAsp40LysGluValValSerGinGluSerGluPheLeuLysMetAlaGlyGluLeulielie135AspProVal105AlaLys120ThrLysProMetVal150ProPheAlaSerValGlyAsnGlyGlylie10HisGluGluLeuHisLysGluLeu75AlaLys90LeuSerLysThrTyrAspProAsn155ValThrHisValTyrProGlyLeuPhe45GinPhe60lieAsp30SerSerGlu15GlulieAlalieValAlaGluLeuAspLysLeuGluGluSerArg125LeuGly140LeuTyrHis110GluValAla80lieGlu95LysValLeuVallieGluAlaPhelieHisTyrThrArg160MetArgTyrLysVa]Arg180AsnHisProLysLeulie195SerlieGluGly165GinArgGluThr170LeuPheSerArg185ProTrpTyrTyrLysLeu210LeuValValGlyVal225LeuAlaLysAsnAsnThr200GlyAspValPhelie215GluArgThrAsp175PheValPheSer190AspProSerLeu205AsnAsnAspThrSer230ValAlaAsnLysTyr220GinThrVallie245ValAlalieAsnValProLysTrp260MetLeuAspLysLeu235CysGluPheLysTrpLeuThr275AsnAspValPheLysPhe290GluProGinProVal305SerlielieAsnGlu250ThrAsnLeuMetHis265LysPheLeuTyrThrLeu240Arglie255AspThrAsp280TrpAspTyrAspLeu295AsnGlyLeuProLeu270ProlieAlaSer285AsnGlyGlyAlaGlu310LysProValLeuVal300GluGlyLeuLys325GlulieGluArgLeu315ProlieAlaGlyAlaSerGinMet340TyrLeuAlalieArgProGlyValVallieGlyTyr355360AsnAlaAlaLeuGluAlaGlu345Vallie330ThrHisPheAspLeuGin320GluGly335GlyThrAsn350ArgAsnGluLysThrAsnAlaAlaLeuGluAlaAlaGlylie370375HisGlyAsnGinLeuSerLeuGlyMetGly385390MetProLeuSerArgLysAspValLysTrpSer365ValUuProPheAsn395Lys380AlaArgCysMetSer400405410〈210〉4〈211〉1233<212〉DNA〈213〉Mycoplasmaarthritidis〈400〉4atgtctgtatttg3C3gt^atttaaaggaattcacgttt60gaatcagttctsgttcacgaaccaggacgcg犯3ttg3Ct3tattac3ccagctagacta120gatg犯ttattattctcagcagccacgatgctag犯aaga180ttcgtagcagaaacgacatcaatgttgttgaatt犯ttg8tttagttgct240atttagcatcacaagaagctatttttagaa300g3CtC3g^Ccagttctatcagaaga^caca犯gtagttgtaaga^acttcttaaaagct360c犯gaa犯tt3gtagaaatc3tg3tggC3gggatcacaa3420ggtatcg犯gC3gatcaxigaattaatcgttgacccaatgccaaacctatacttcacacgt480gacccatttgcatcagtaggtaatggtgtaacaatccact3C3tgCgtt已caaagttaga540caacgtgaaacattattctcaagatttgtaLttctcaaettcaccctaaact600ccatgatactacgacccttcactaaaattatc犯tcg肪ggtgg卿cgtatttatctac660cattagtagttggtgtttctgaaagaactgacttacaaacagttacttta720tta_gcta^a>acattgttgc"tgtg犯ttca犯cgtattgttgc犯tt犯c780gttccaaaatga3c犯ax:tta^tgcactt3ga_c3catg3Ct犯C已3tgtt840aaattcctatactc3ccaatcgctaacgacgtatttei犯ttctgagattatgacttagta■咖ggtggagC6Lg￡l￡lCCeLC￡Laccagttgaa犯cggattacctctagaaggattattacaa960tcaatcattaacaaaaaaccagtttt犯ttcctatcgcaggtg卿gtgc1020cttcgatggttagcaattagaccaggtgtt1080gt犯ttggttaacgctgctctagaagctgc1140gttcttccattccacggtaaccaattatcattaggtatgggtsacgctcgttgtatgtca1200atgcctttattgtt犯gtg3tag12332权利要求1.一种甲氧基聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚氨酶的制备方法，包括下列步骤a、将精氨酸脱亚氨酶安慰性底物与精氨酸脱亚氨酶混合反应，使精氨酸脱亚氨酶安慰性底物与精氨酸脱亚氨酶的活性位点结合；b、将结合了精氨酸脱亚氨酶安慰性底物的精氨酸脱亚氨酶用甲氧基聚乙二醇修饰；c、分离纯化甲氧基聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚氨酶。2.如权利要求l所述甲氧基聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚氨酶的制备方法，其特征在于，步骤a中，精氨酸脱亚氨酶安慰性底物对精氨酸脱亚氨酶的摩尔比为1:1-50:1。3.如权利要求2所述甲氧基聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚氨酶的制备方法，其特征在于,.所述精氨酸脱亚氨酶安慰性底物对精氨酸脱亚氨酶的摩尔比为3:1-10:1。4.如权利要求1所述甲氧基聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚氨酶的制备方法，其特征在于，所述精氨酸脱亚氨酶安慰性底物选自B0C-精氨酸或FM0C-精氨酸。5.如权利要求1-4任一权利要求所述甲氧基聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚氨酶的制备方法，其特征在于，所述步骤c的分离纯化步骤，包括将步骤b的产物通过抗精氨酸脱亚氨酶抗体亲和层析柱去除暴露有免疫原性位点的聚乙二醇化精氨酸脱亚氨酶。6.—种甲氧基聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚氨酶，由权利要求1-5中任一权利要求所述甲氧基聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚氨酶的制备方法制得。7.如权利要求6所述甲氧基聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚氨酶，其特征在于，所述的精氨酸脱亚氨酶为精氨酸支原体、人型支原体或关节炎型支原体的精氨酸脱亚氨酶。8.如权利要求6所述甲氧基聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚氨酶，其特征在于，所述甲氧基聚乙二醇通过连接基团与所述精氨酸脱亚胺酶的伯胺共价相连。9.一种药物组合物，它含有安全有效量的权利要求6-8中任一权利要求所述甲氧基聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚氨酶以及药学上可接受的载体或赋形剂。10.权利要求6-8中任一权利要求所述甲氧基聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚氨酶在制备治疗癌症药物上的应用。全文摘要本发明公开了用甲氧基聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚氨酶及其制备与应用。本发明通过在修饰反应中添加安慰性底物来保护活性位点，修饰获得的PEG-ADI与现有的修饰型EG-ADI相比，在相同的修饰率下，具有更高的生物学活性。其次，通过特异性的亲和层析去除有免疫原性的PEG-ADI，最终制备的PEG-ADI在活性高，免疫学上更均一，在体内没有免疫原性，从而在临床中更为安全有效。文档编号A61K47/48GK101591649SQ20091005464公开日2009年12月2日申请日期2009年7月10日优先权日2009年7月10日发明者凌建群,梁伟峰,温晓芳,王叶飞,王玉娇,敏范,裘霁宛申请人:杭州基伟生物技术有限公司