作为一氧化氮合成酶抑制剂的精氨酸类似物的制作方法

专利名称：：作为一氧化氮合成酶抑制剂的精氨酸类似物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及L-精氨酸衍生物、其制备方法和含有它们的药物组合物。本发明的化合物具有NO合成酶抑制剂的生物活性。鉴于NO合成酶在病理生理学中所具有的潜在作用(S.Moncada，R.M.J；Palmer等，“氧化氮生理学、病理生理学和药理学”，《药学述评》43卷2期109-142页)，因此这样的化合物有可能是重要的降压剂、抗菌剂、免疫抑制剂、抗动脉硬化剂、促血管生成剂、止痛剂、抗偏头痛剂、眼科试剂、或抗糖尿病剂。因此，人们考虑将这些化合物用作药物的有效成分，来治疗中枢及外周神经系统疾病，如大脑梗塞、偏头痛及头痛、癫痫、大脑或脊柱损伤、神经变性和/或自身免疫性疾病，如早老性痴呆、帕金森病、杭廷顿舞蹈病、肌萎缩性脊髓侧索硬化、传染性大脑神经病(AIDS)、急性及慢性疼痛、对吗啡衍生物、影响精神的药物及酒精的耐受与依赖、眼神经疾病、以及抑郁症。人们同样也考虑将它们用于治疗其它疾病，如那些与炎型或非炎型胃肠系统及泌尿系统机能障碍有关的疾病，有溃疡性结肠炎、胃炎、Chronn病、排尿困难、胃食管反流、腹泻，还有与心血管系统或支气管肺系统有关的疾病，如低血压、高血压、动脉粥样硬化、肺纤维化、硬皮病、哮喘、肺动脉高血压、肝硬变、糖尿病，以及炎症或传染性疾病，如关节炎、多关节炎、败血病性休克、脉管炎，甚至还有阴茎勃起障碍、阴茎异常勃起或节育。本发明涉及通式I的L-精氨酸衍生物其中A代表氢原子、低级烷基或硝基；E代表氧原子或共价键；n等于零或1至12的整数；R1与R2各自代表支链或直链低级烷基链，或者R1与R2和与其相连的氮原子共同构成一饱和或不饱和的5元或6元环，如下式所示其中X代表氧原子、硫原子、氮原子、亚氨基、烷基亚氨基、或亚甲基；n等于零，E代表共价键，A代表氢原子，R1与R2各自代表低级烷基或共同构成哌啶、吗啉或咪唑环，或者A代表硝基，R1与R2构成哌啶环的通式I化合物除外。低级烷基指含有1至6个碳原子的烷基。优选为含有1至4个碳原子的直链或支链烷基，选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基或叔丁基。R1与R2可与其相连的氮原子共同构成饱和或不饱和的5元或6元环。该环选自吡咯、哌啶、吡咯烷、咪唑、咪唑烷、吡唑、吡唑烷、吡啶、哌嗪、吡嗪、嘧啶、哒嗪、异噻唑、或吗啉。本发明特别涉及通式I中n为1至12整数的化合物，优选为E代表氧原子，A代表硝基或氢原子，R1与R2构成吗啉、哌啶、或咪唑环。本发明同样特别涉及通式I中n等于零的化合物，且E代表共价键，A代表硝基，R1与R2构成吗啉环。本发明同样涉及本发明衍生物的药学上可接受的盐。该盐为有机酸或无机酸的盐，如氢氯酸、氢溴酸、乙酸、富马酸、磺酸、甲苯磺酸、马来酸、羧酸、或磷酸。羧酸例如可选自乙酰水杨酸、水杨酸、甲芬那酸、布洛芬、舒林酸、或吲哚美辛。通式I中，若n等于零，E代表共价键，要么A代表氢原子，R1与R2共同构成哌啶或吗啉环，要么A代表硝基，R1与R2构成哌啶环，这样的化合物在文献中已有记载。在这些文献资料(《欧洲药物化学杂志》23卷6期(1988)，《生物化学》23卷1期(1984)，专利申请FR2320088、FR2240720)中，这些衍生物用于制备抗血栓形成的L-精氨酸衍生物。通式I中，若n等于零，E代表共价键，A代表氢原子，R1与R2共同构成咪唑环，这样的化合物据记载是一种合成中间体(《生命之源》(OriginsofLife)14卷(1984)，351-357页)。不过，并没有描述这些产物的任何药理活性。其它式I衍生物，即n等于零、E代表共价键、A代表氢原子、R1与R2分别代表低级烷基的化合物，将其活性与胰岛素进行了比较(Z.Naturforsch.TeilC.，28卷5-6期，1973；Hope-Seyler′sZ.Physiol.Chem.，353卷11号，1972，1661-1670页)。但是血栓形成与糖尿病所涉及的范畴明显有别于本发明所述及的NO合成酶范畴。本发明涉及通式I化合物的制备方法，该方法由下列步骤组成在一种偶合剂的存在下，在0至30℃范围内，使通式(2)化合物与通式(3)化合物反应，其中A代表低级烷基或硝基，R3代表一保护基团；H-E-(CH2)n-NR1R2(3)其中n、E、R1与R2定义同上；然后裂解如此得到的通式(4)化合物的保护基团R3，得到通式I化合物，其中A代表硝基或低级烷基。如果需要得到通式I中A代表氢原子的化合物，就使用通式I中A代表硝基的相应化合物，并裂解硝基裂解可通过氢化裂解反应进行。起始化合物(3)与其中A代表硝基的起始化合物(2)是已知的，并有市售其中A代表低级烷基的化合物(2)可按照已知的方法制备(Synth.Commun.21(1)，99(1991))。第一步在0至30℃的温度范围内进行，优选在0℃与环境温度之间。所用溶剂必须能够溶解式II的硝基精氨酸衍生物优选使用DMF。使用一种偶合剂进行反应。从一般用于肽的合成中的偶合剂中选择一种即可，因此可用N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)、苯并三唑-1-基-氧三(二甲氨基)鏻六氟磷酸盐(BOP)或苯并三唑-1-基-氧-三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐(PyBOP)。偶合剂中也可使用添加剂，如1-羟基苯并三唑(HOBt)或4-二甲氨基吡啶(DMAP)，已知它们在碳二亚胺起作用的肽合成中能加速偶合作用的进行。保护基团R3可以是任何通常用于肽合成中的保护基团，如苯氧基羰基(Z)和叔丁氧基羰基(BOC)。在A代表氢原子的化合物I的制备中，R3基优选为在氢化裂解硝基的条件下同样可被裂解的基团。在这种情况下，R3基的裂解与硝基的裂解可同步进行。本发明也涉及药物组合物，该组合物含有至少一种如通式I的化合物或其盐作为活性成分其中A代表氢原子、低级烷基、或硝基；E代表氧原子、或共价键；n等于零或1至12的整数；R1与R2各自代表支链或直链低级烷基链，或者R1与R2和与其相连的氮原子共同构成一饱和或不饱和的5元或6元环，如下式所示其中X代表氧原子、硫原子、氮原子、亚氨基、烷基亚氨基、或亚甲基；n等于零，E代表共价键，A代表氢原子，R1与R2各自代表低级烷基或共同构成咪唑、吗啉或哌啶环，或者A代表硝基，R1与R2构成哌啶环的通式I化合物除外，其中这些化合物与至少一种稀释剂或药学上可接受的载体结合。本发明同样涉及一种药物组合物，该组合物含有至少一种如通式IA的化合物或其盐作为活性成分其中A代表氢原子、低级烷基、或硝基；E代表氧原子、或共价键；n等于零或1至12的整数；R1与R2各自代表支链或直链低级烷基链，或者R1与R2和与其相连的氮原子共同构成一饱和或不饱和的5元或6元环，如下式所示其中X代表氢原子、硫原子、氮原子、亚氨基、烷基亚氨基、或亚甲基；n等于零，E代表共价键，A代表氢原子，R1与R2各自代表低级烷基的通式IA化合物除外，并结合了至少一种稀释剂或药学上可接受的载体。按照本发明的药物组合物可选择适宜的给药方式，尤其是口服和胃肠外给药。因此该组合物可以是胶囊、片剂、凝胶、口服液、注射液的形式，或适用于缓释的形式。本发明的化合物给药的剂量范围可以是每天0.1至1000毫克之间。优选地，化合物给药的剂量范围在1至100毫克之间。本发明最后涉及如通式IB的L-精氨酸衍生物的用途其中A代表氢原子、低级烷基、或硝基；E代表氧原子、或共价键；n等于零或1至12的整数；R1与R2分别代表支链或直链低级烷基链，或者R1与R2和与其相连的氮原子共同构成一饱和或不饱和的5元或6元环，如下式所示其中X代表氢原子、硫原子、氮原子、亚氨基、烷基亚氨基、或亚甲基，该L-精氨酸衍生物用于制备治疗中枢及外周神经系统疾病的药物、治疗胃肠道及泌尿系统的炎型或非炎型疾病的药物、或治疗与心血管或支气管肺系统有关的疾病的药物。本发明通过下列实施例得到说明例1L-NG-硝基精氨酸(L-NNA)的吗啉代乙基酯A＝NO2E＝On＝2第1步将等分子数(10-2M)的L-N-Boc-NG-硝基精氨酸与N-β-羟乙基吗啉溶于30毫升无水二甲基甲酰胺(DMF)中，然后加入3×103M二甲氨基吡啶(DMAP)。溶液冷却至0℃，再加入10-2M二环己基碳二亚胺(DDC)。在0℃下搅拌10分钟，然后继续在室温下搅拌24小时。滤除所生成的二环己基脲沉淀，并除去溶剂。残余物用乙酸乙酯重悬，用水洗涤一次，再用饱和NaCl洗涤一次。除去溶剂得到一粘性产物，经硅胶柱层析(洗脱液为CHCl3/MeOH95∶5，再用90∶10)，得到油状化合物(4)，使其结晶。熔点128℃。TLCRf0.38(CHCl3/EtOH85∶15)I.R.(cm-1)γ-NH3400-3200；γ-酯1740；γ-BOC1710.质谱MH+＝433.1H-NMR，100MHz，CDCl3.TMSδppm7.8(2H，NH2)；5.5(d，1H.NHBoc)；4.3(m，3H，CHNHCO，CO2CH2)；3.8-3.2(m，7H，CH2NH，CH2-O-CH2，NH)；2.5(m，6H，3CH2N))；1.7(m，4H，CH2CH2)；1.4(s，9H，tBu).第2步NH2功能基的去保护。将上一步中得到的化合物(4)溶于无水二恶烷中，在室温下将过量的4HHCl滴加入二噁烷中。溶液变浑浊，剧烈搅拌15小时，直至缓慢生成白色沉淀为止。轻轻倒出上面的二噁烷，残余物用无水乙醚洗涤两次，旋蒸干燥。将此固体溶于水，并冷冻干燥。得到二盐酸盐形式的化合物I。熔点230℃-吸湿性白色粉末。TLCRf0.39(2-丙醇/H2O/NH4OH7∶3∶0.1).MH+(基峰)＝333[αD20]＝+3.81(H2O)1H-NMR，100MHz，D2O，δppm4.5(m，2H，CO2CH2)；4.1(t，1H，CH(NH2)CO)；3.7(m，4H，CH2OCH2)；3.4-3.1(m，8H，CH2N)；1.9-1.5(多重4H，CH2-CH2).例2L-NNA的哌啶子基乙酯A＝NO2E＝On＝2第1步用N-(β-羟乙基)-哌啶代替N-(β-羟乙基)-吗啉，按照例1中第1步所述的方法得到相应的通式(4)化合物。白色固体-熔点98℃TLCRf0.22(CHCl3/EtOH8∶2)1H-NMR，100MHz，CDCl3，TMSδpp7.6(2H，NH2)；5.5(t，1H，NHBoc)；4.3(t，3H，CH-NHCO和CO2CH2)；3.4(多重，3H，CH2HN，NH)；2.7-2.3(多重6H，3CH2N)；1.7-1.4(多重19H，tBu和5CH2).第2步按照例1中第2步所述的方法得到二盐酸盐形式的化合物I。熔点250℃-吸湿性白色固体TLCRf0.36(2-丙醇/H2O/NH4OH7∶3∶0.1)MH+＝331(基峰)[αD20]＝+5.78(H2O)1H-NMR，100MHz，D2O，δppm4.5(m，2H，CO2CH2)；4.1(t，1H，CH(NH2)CO)；3.5-2.7(m，8H，4CH2N)；1.7-1.3(m，10H，5CH2).例3L-NNA的3-(二甲氨基)丙酯A＝NO2E＝On＝3第1步用3-(二甲氨基)丙醇代替N-(β-羟乙基)-吗啉，按照例1中第1步所述的方法得到相应的通式(4)化合物。用快速层析法(CHCl3/EtOH8∶2)精制化合物(4)。得到一粘性产物。TLCRf0.17(CHCl3/MeOH7∶3).1H-NMR，100MHz，CDCl3，TMS，δppm5.4(d，1H，NHBoc)；4.2(m，3H，COOCH2和CHNHBoc)；3.4(m，2H，NHCH2)；2.3(m，8H，CH2N和(CH3)2N)；1.7(m，6H，3CH2).第2步按照例1中第2步所述的方法得到二盐酸盐形式的化合物I。熔点178℃-吸湿性白色固体TLCRf0.28(2-丙醇/H2O/NH4OH7∶3∶0.1)MH+(基峰)＝3781H-NMR，100MHz，D2O，δppm4.15(m，3H，CH(NH2)CO，COOCH2)；3.1(m，4H，NHCH2和CH2N)；2.2(s，6H，(CH3)N)；1.7(m，6H，3CH2).例4L-NNA的吗啉代丙基酯A＝NO2E＝On＝3第1步用3-吗啉代丙醇代替N-(β-羟乙基)-吗啉，按照例1中第1步所述的方法得到相应的化合物(4)。后者用快速层析法纯化。熔点106℃。TLCRf0.34(CHCl3/EtOH85∶15).1H-NMR，100MHz，CDCl3，TMS，δppm7.8(2H，NH2)；5.4(d，1H，NHBoc)；4.3(m，3H，CHNHBoc，CO2-CH2)；3.8-3.3(m，7H，CH2NH，CH2-O-CH2，NH)；2.4(m，6H，3CH2N)；1.9(m，6H，3CH2)；1.4(s，9H，tBu).第2步按照例1中第2步所述的方法得到二盐酸盐形式的化合物I。熔点232℃-吸湿性白色固体TLCRf0.39(2-丙醇/H2O/NH4OH7∶3∶0.1)[αD20]＝+8.2(H2O)MH+＝347(基峰)1H-NMR100MHz，D2O，δppm4.15(m，3H，CH(NH2)CO，CO2-CH2)；3.9-3.3(m，6H，CH2OCH2，CH2NH)，3.1-2.9(m，6H，3CH2N)；2-1.4(多重，6H，3CH2).例5L-NNA的吗啉代己基酯A＝NO2E＝On＝6第1步用6-吗啉代己醇代替N-(β-羟乙基)-吗啉，按照例1中第1步所述的方法得到相应的化合物(4)。后者用快速层析法(CHCl3/EtOH90∶10)精制。得到一粘性产物。熔点99℃TLCRf0.32(CHCl3/EtOH85∶15).1H-NMR，100MHz，CDCl3，TMS，δppm7.7(2H，NH2)；5.4(d，1H，NHBoc)；4.25(m，3H，CHNHBoc，CO2-CH2)；3.6-3.3(m，7H，CH2NH，CH2OCH2，NH)；2.4(m，6H，3CH2N)；1.8-1.3(多重，23H，tBu+6CH2).第2步按照例1中第2步所述的方法得到化合物I的二盐酸盐。熔点214℃-吸湿性化合物TLCRf0.52(2-丙醇/H2O/NH4OH7∶3∶0.1)MH+＝389(基峰)[αD20]＝+6.67(H2O)1H-NMR，100MHz，D2O，δppm4.1(m，3H，CH(NH2)CO，CO2CH2)；4-3.3(多重，6H，CH2OCH2，CH2NH)；2.1-1.9(m，6H，3CH2N)；1.8-1(m，12H，6CH2)例6L-NNA的咪唑-1-基-乙基酯A＝NO2E＝On＝2第1步用2-羟乙基-3-咪唑代替N-(β-羟乙基)-吗啉，按照例1中第1步所述的方法得到相应的化合物(4)。后者用硅胶柱层析(CHCl3/EtOH9∶1再用88∶12)纯化。熔点102℃TLCRf0.19(CHCl3/EtOH/NH4OH85∶15∶0.1).1H-NMR，100MHz，CDCl3，TMS，δppm8(2H，NH2)7.6(1H，NH)；7(d，2H，咪唑)；5.7(d，1H，NHBoc)；4.3-4.1(m，5H，CHNHBoc，CO2CH2，CH2-咪唑)；3.3(d，2H，CH2NH)；1.4(m，13H，tBu，2CH2).第2步按照前面例1中第2步所述的方法得到二盐酸盐形式的所需化合物I。熔点228℃-吸湿性黄色固体MH+＝314(基峰)TLCRf0.39(2-丙醇/H2O/NH4OH7∶3∶0.1)1H-NMR，100MHz，D2O，δppm7.3(d，2H，咪唑)；4.4(m，4H，CO2CH2)andCH2-咪唑)；4(t，1H，CH(NH2)CO)；3.1(t，2H，CH2NH)；1.5(m，4H，2CH2).例7L-精氨酸的吗啉代乙基酯A＝HE＝On＝2第1步按照前述方法(例1，第1步)，使L-N(Z)-NG-硝基精氨酸、即R3基代表Z保护基团的化合物II与N-(β-羟乙基)-吗啉反应，得到相应的化合物(4)。用快速层析法(CHCl3/EtOH9∶1再用89∶11)精制化合物(4)。得到一粘性产物。熔点65℃TLCRf0.28(CHCl3/EtOH85∶15).1H-NMR，100MHz，CDCl3，TMS，δppm8.5(1H，NH)；7.3(2H，NH2)；7.2(s，5H，φ)；5.7(d，1H，NHZ)；5(s，2H，CH2φ)；4.2(m，3H，CHNHZ和CO2CH2)；3.6(m，6H，CH2NH和CH2OCH2)；3.4(1H，NH)；2.4(m，6H，3CH2N)；1.6(m，4H，2CH2).第2步将上一步中得到的化合物(4)溶于乙醇，进行氢化裂解；氢解反应条件为环境温度、50磅/平方英寸压力、在10％Pd/C存在下的PARR仪器中进行。用TLC追踪前体化合物的消失，反应在四小时内结束。过滤，在40℃下除去溶剂。粘性残余物用少量乙醇回收。加入1N氢氯酸的乙醚溶液，搅拌三小时。逐渐生成沉淀。取固体用无水乙醚洗涤两次。减压干燥并冷冻干燥。得到含盐酸的淡黄色产物，易吸湿。熔点＞240℃(分解)MH+＝288(基峰)1H-NMR，100MHz，D2O，δppm4.4(m，2H，CO2CH2)；4.1(t，1H，CH(NH2)CO)；3.7(m，4H，CH2OCH2)；3.4(m，4H，CH2N，NHCH2)；3.1(m，4H，N(CH2)2)；1.6(m，4H，2CH2).例8L-精氨酸的哌啶子基乙酯A＝HE＝On＝2用N-(β-羟乙基)-哌啶代替N-(β-羟乙基)-吗啉，按照例7中第1步的方法可得到相应的通式(4)化合物。用快速层析法精制。第2步按照前述方法(例7，第2步)得到化合物I的盐酸盐。例9L-精氨酸的N-咪唑-1-基乙基酯A＝HE＝On＝2用N-(β-羟乙基)-哌啶代替N-(β-羟乙基)-吗啉，按照例7中第1步的方法可得到相应的通式(4)化合物。用快速层析法精制。第2步按照前述方法(例7，第2步)得到化合物I的盐酸盐。例10L-NG-甲基精氨酸(L-NMA)的吗啉代乙基酯A＝CH3E＝On＝2第1步按照例1中第1步的方法使L-N(Z)-NG-甲基精氨酸与N-(β-羟乙基)-吗啉反应，可得到相应的通式(4)化合物。用硅胶柱层析精制。第2步按照例7中第2步所述的方法可得到化合物I的盐酸盐。例11L-NNA的吗啉酰胺A＝NO2E＝共价键n＝0第1步L-NBoc-NG-硝基精氨酸的酰胺将等摩尔的L-N-Boc-NG-硝基精氨酸、吗啉、和1-羟基-苯并三唑(HOBT)溶于无水DMF中；冷却至0℃，加入1当量的DDC。在0℃下保持10分钟。在0℃下继续反应20分钟，然后在环境温度下反应6小时。进行常规的处理后，用快速层析法(洗脱液CHCl3/MeOH95∶5)得到一油状物，其结晶。TLCRf0.66(CHCl3/MeOH8∶2)IRcm-1γNH3400-3300；γBoc1700；γ酰胺16301H-NMR，100MHz，CDCL3，TMS，δppm5.8(1H，d，NHBoc)；3.7(m，1H，CHNBoc)；3.5(多重，4H，2CH2O)；3.4(m，2H，NH-CH2)；2.8(m，4H，CH2-N-CH2)；1.7(m，4H，CH2CH2)；1.4(s，9H，tBu).第2步NH2功能基的去保护。将上一步中得到的产物(4)溶于无水二氯甲烷中，加入20％三氟乙酸。在环境温度下搅拌，放掉气体。除去溶剂，残余物用水回收。使溶液通过离子交换树脂。得到一粘性产物，用丙酮结晶。熔点＝246℃；MH+＝289TLCRf0.18(CHCL3/MeOH8∶2)[αD20]＝+17.2(H2O)I.R.cm-1γNH3400-3300；γ酰胺16301H-NMR，100MHz，D2O，δppm3.8(m，1H，CH(NH2)CO)；3.5(m，8H，吗啉)；3.1(m，2H，CH2NH)；1.4(m，4H，CH2CH2)例12L-NG-硝基精氨酸的吗啉代乙基酯和布洛芬的盐将2×10-3M布洛芬溶于含有2当量氢氧化钠的15毫升水中；向此溶液中缓慢加入2×10-3ML-NNA的吗啉代乙基酯的水溶液(7毫升)。混合物变浑浊；在搅拌下加热至60℃达30分钟。得到一澄清溶液，冷却后冷冻干燥得到白色粉末。熔点＞260℃-水溶性盐1H-NMR，100MHz，D2O，δppm7(4H，φ)；4.6(m，3H，CHNCO和CO2CH2)；3.7-3.4(m，6H，2CH2N)；3-2.9(m，4H，N(CH2)2)；2.3(d，2H，CH2-φ)；1.7-1.5(多重，5H，2CH2和CH)；1.2(d，3H，CH3)；0.7(d，6H，2CH3).按照相同方法得到例1化合物酯的水杨酸盐(例13)和相同酯与舒林酸的盐(例14)。所有这些盐都是吸湿性的。例15乙酰水杨酸和L-NNA的吗啉酰胺的盐将L-NNA的吗啉酰胺溶于30毫升水中。边搅拌边加入乙酰水杨酸，使其在混合物中缓慢溶解。将澄清溶液冷冻干燥得到白色粉末。熔点＞240℃-水溶性盐同样方法可得到例11化合物与其它羧酸如水杨酸、舒林酸或布洛芬所形成的盐。所有这些盐都是吸湿性的。按照本发明的化合物的生物活性通过下列试验得到说明。1.体外生物活性的测定1.1构成内皮的NO合成酶给以脱羟肾上腺素预收缩的大鼠离体主动脉由卡巴可引起依赖型内皮舒张(Auguetetal.，1992)，按照产物对该依赖型内皮舒张的拮抗能力来评价其对组成性内皮NO合成酶的抑制特性。材料和方法用颈断裂法杀死SpragueDawley雄性大鼠(290-350克)，取出胸部主动脉。将主动脉置于含葡萄糖的KrebsHenseleit培养基中，该培养基组成如下(mM)，NaCl118；KCl4.7；MgSO41.17；KH2PO41.18；CaCl22.5；NaHCO325；葡萄糖11。将该培养基保持在37℃下并连续通以碳氧气流(95％O2，5％CO2)。除去与主动脉相连的额外组织及脂肪，将主动脉小心地切成环状(2毫米宽)，在2克张力作用下悬挂在20ml的槽中。使用连接在数据记录系统(IOSDei-Lierre)上的等距探测器记录主动脉的收缩。产物和处理方法间隔一小时后，给以脱羟肾上腺素(PE10-6M)，提高动脉的紧张性。当收缩达到最大值时(10分钟)，在槽中加入卡巴可(10-5M)以证明内皮层的完整性。将其洗涤并间隔45分钟，在达到最大收缩时向槽中再加入PE(10-6M)；在达到最大舒张时注射105M卡巴可。待测产物以累积剂量加入槽中。结果总结在下表中表1产物IC50(μM)L-NMMA12L-NA7氨基胍＞100例110例230例375例410例55例680例7＞100例11＞100例125例1310例1491.2组成性神经元NO合成酶简介NO合成酶活性的测定按照Bredt和Snyder(1990)所述的方法进行。材料和方法迅速取出SpragueDawley大鼠(280克，CharlesRiver)小脑，在4℃下解剖，用Thomaspotter(10个来回)在提取缓冲液中进行匀浆处理，所用提取缓冲液体积相当于每克组织5毫升HEPES缓冲液。然后将所得匀浆化物离心(4℃下21000g离心15分钟)。取出上清液，使其通过1毫升预先用蒸馏水和提取缓冲液清洗过的DowexAG50WX-8Na+柱(BioRad型)。然后将样本在4℃下保存，迅速定量。定量在玻璃试管中进行，试管中加入了100微升培养缓冲溶液，该溶液中含有100mMpH7.4的HEPES、2mMEDTA、2.5mMCaCl2、2mM二硫苏糖醇、2mM还原的NADPH、10μg/ml钙调蛋白和10μM四氢生物蝶呤。加入25微升含有100nM氚标记精氨酸(放射性比度56.4居里/毫摩尔，Amersham)与40μM无放射性的精氨酸的溶液。加入50微升匀浆化物引发反应开始，最终体积为200微升(所缺少的25微升不是水就是待测产物)。在环境温度下培养30分钟后，加入2毫升终止缓冲液(20mMHEPES，pH5.5；2mMEDTA)使酶反应终止。使样品通过1毫升Na+型DowexAG50WX-8树脂柱，用2毫升蒸馏水洗脱。加入10毫升闪烁液体后，用液体闪烁光度计对放射性进行定量测定。按照同样的试验方法，用50微升提取缓冲液代替50微升样品作空白。每个试验都测定总的放射性。结果以每毫克蛋白质每分钟生成的瓜氨酸的pmol数表示。蛋白质浓度按照Bradford法(1976)进行测量(表2)。表2产物IC50(μM)L-NMMA2.8L-NA0.6氨基胍510例12.3例24例310例41.5例52例61.8例7＞10例11＞300例120.36例131例140.71.3可诱导的NO合成酶巨噬细胞利用前炎性刺激可诱导的NO合成酶产生一氧化氮。从预先用LPS(大肠杆菌)和IFNγ刺激48小时的J774A1脊髓单核细胞的匀浆化物中制得巨噬细胞的可诱导NO合成酶。材料和方法1-细胞NO合成酶的培养和诱导在5％CO2气氛及37℃下，将J774A1细胞(ATCCref.TIB67)在10％SVF的DMEM培养基中培养。在150cm2的培养皿中，每cm2接种5×103个细胞。在LPS(1微克/毫升)与鼠IFN-γ(50单位/毫升)的存在下，在10％SVF的DMEM培养基中培养24小时。2-部分纯化的NO合成酶的制备细胞用PBS洗涤后，置于细胞刮器上4毫升冷缓冲液A中(4℃)(缓冲液Ahepes50mM，二硫苏糖醇0.5mM，用1NNaOH调至pH4)。当场加入胃酶抑素A1mg/ml、亮肽素1mg/ml、大豆胰蛋白酶抑制剂1mg/ml、抗蛋白酶1mg/ml、PMSF(Pefobloc)10mg/ml。离心(1000g，4℃，5分钟)后，收集离心所得的沉积物，重悬于1毫升缓冲液A，在4℃下进行声处理，使匀浆化物进行超速离心(100000g，4℃，60分钟)。向上清液中加入10％甘油，再在-80℃下冷冻，所得制剂在同一天内进行试验，不过在-80℃下贮藏10天后仍保持活性。保存等份样品用于按照Badford微量测定法进行蛋白质定量。3-酶试验本试验是在NO合成酶的作用下将L-精氨酸转化为L-瓜氨酸。a.L-精氨酸转化为L-瓜氨酸-缓冲液B为反应缓冲液Hepes100mM，二硫苏糖醇1mM，用1NNaOH调至pH7.4。该缓冲液在4℃下保存若干天。配制时加入NO合成酶协同因子，即10μM四氢生物蝶呤、10μMFAD、2mMNADPH、2.5mMCaCl2、1mg/mlBSA(使酶可溶)。-L-精氨酸溶液L-精氨酸终浓度为40μM。为使反应继续进行下去，向溶液中加入(3H)-L-精氨酸达到100nM的最终浓度，制得一同位素稀释溶液。-酶制剂根据预试验所显示出来的酶活性，使用原溶液或原溶液的1/10。-抑制剂将含水介质或DMSO中的抑制剂浓缩溶液加入完全缓冲液B中，与不加抑制剂的对照组作对比试验。适当时加入DMSO对照。试验用体积(微升)</tables>在37℃下，水浴培养15分钟。-终止反应加入2毫升缓冲液C终止反应20mMHepes、2mMEDTA，用1NHCl调至pH5.5。-L-精氨酸与L-瓜氨酸的分离分离在0.5毫升用缓冲液C预平衡的Dowex50X-8(阳离子交换树脂)中进行，在末端置一玻璃球使其仅允许液体通过的注射器中。50X-8保留L-精氨酸。将收集的样品贮藏起来，其余部分用2毫升蒸馏水洗脱出剩余的瓜氨酸。向4毫升含水介质中加入16毫升InstagelPlus，用Packard探测器对发生闪烁的瓶计数。-计算按下式计算每组值[cpm(样品)-cpm(空白)]/[cpm(对照)-cpm(空白)]用Fig.P6C作出回归曲线。测定产物的IC50。IC50为使用不同酶制剂的两次试验的平均值。结果见表3。表3产物IC50(μM)L-NA20.5L-NMMA9.5氨基胍29.6例129例253例330例4110例5380例615例722例11＞300例1240例1328例14382.体内生物活性测定角叉菜胶水肿原理角叉菜胶是从藻类中提取的粘多糖，足底部注射角叉菜胶悬浮液能诱发局部炎症反应。抗炎化合物按照其不同的作用方式能拮抗此水肿反应(Winteretal.，1962)。NO合成酶抑制剂在本试验中显示出了一定的作用(Antunesetal.，1991)。材料和方法140至215克的SpragueDawleyVAF雄性大鼠(CharlesRiver，St.AubinlesElbeuf)每8只为一组，禁食18小时(n＝8)。-在一只后爪的跖垫部注射1％角叉菜胶的生理血清悬浮液，引起水肿，每只大鼠注射0.1毫升。-用体积描记法，在角叉菜胶注射前、后1.5及3小时测量后爪体积。计算每只动物每次测量时的后爪发炎率(水体积描记仪-UgoBasile)。结果结果见表4(NS＝不明显；*＝明显；**＝很明显；***＝非常明显)。表4</tables>权利要求1.通式I的L-精氨酸衍生物及其药学上可接受的盐，其中A代表氢原子、低级烷基或硝基；E代表氧原子或共价键；n等于零或1至12的整数；R1与R2各自代表支链或直链低级烷基链，或者R1与R2和与其相连的氮原子共同构成一饱和或不饱和的5元或6元环，如下式所示其中X代表氢原子、硫原子、氮原子、亚氨基、烷基亚氨基、或亚甲基；n等于零，E代表共价键，A代表氢原子，R1与R2分别代表烷基或共同构成哌啶、吗啉或咪唑环，或者A代表硝基，R1与R2构成哌啶环的通式I化合物除外。2.根据权利要求1的衍生物，其中n为1至12的整数。3.根据权利要求2的衍生物，其中E代表氧原子，A代表硝基或氢原子，R1与R2构成吗啉、哌啶或咪唑环。4.根据权利要求1的衍生物，其中n等于零，E代表共价键，A代表硝基，R1与R2构成吗啉环。5.根据权利要求1至4中任一项的化合物的制备方法，该方法由下列步骤组成在一种偶合剂存在下，在0至30℃范围内，使通式(2)化合物与通式(3)化合物反应，其中A代表低级烷基或硝基，R3代表一保护基团；H-E-(CH2)n-NR1R2(3)其中n、E、R1与R2定义同上；然后裂解如此得到的通式(4)化合物的保护基团R3，而得到其中A代表硝基或低级烷基的通式I化合物，如果需要得到通式I中A代表氢原子的化合物，通过裂解硝基使通式I中A代表硝基的相应化合物去保护。6.根据权利要求5的方法，其中所用的偶合剂为N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)、苯并三唑-1-基-氧三(二甲氨基)鏻六氟磷酸盐(BOP)或苯并三唑-1-基-氧-三吡咯烷鏻六氟磷酸盐(PyBOP)。7.根据权利要求5或6的方法，其中1-羟基苯并三唑(HOBt)或4-二甲氨基吡啶(DMAP)用作偶合剂的添加剂。8.根据权利要求5至7中任一项的方法，其中R3保护基团为苄氧基羰基(Z)和叔丁氧基羰基(Boc)。9.根据权利要求5至8中任一项的用于制备其中A代表氢原子的化合物I的方法，其中R3基与硝基同时裂解。10.含有至少一种权利要求1至4中任一项的化合物作为活性成分，并结合了至少一种药学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物。11.含有至少一种式IA化合物或其盐作为活性成分并结合了至少一种药学上可接受的稀释剂或载体的药物组合物其中A代表氢原子、低级烷基、或硝基；E代表氧原子或共价键；n等于零或1至12的整数；R1与R2各自代表支链或直链低级烷基链，或者R1与R2和与其相连的氮原子共同构成一饱和或不饱和的5元或6元环，如下式所示其中X代表氢原子、硫原子、氮原子、亚氨基、烷基亚氨基、或亚甲基，n等于，E代表共价键，A代表氢原子，R1与R2各自代表低级烷基的通式I化合物除外。12.通式IB的L-精氨酸衍生物或其盐的用途其中A代表氢原子、低级烷基、或硝基；E代表氧原子或共价键；n等于零或1至12的整数；R1与R2各自代表支链或直链低级烷基链；或者R1与R2和与其相连的氮原子共同构成一饱和或不饱和的5元或6元环，如下式所示其中X代表氢原子、硫原子、氮原子、亚氨基、烷基亚氨基、或亚甲基，该L-精氨酸衍生物用于制备治疗中枢及外周神经系统疾病的药物。13.如权利要求12所述的通式IB的L-精氨酸衍生物的用途，用于制备治疗泌尿及胃肠道系统的炎型或非炎型机能障碍的药物。14.如权利要求12所述的通式IB的L-精氨酸衍生物的用途，用于制备治疗与支气管肺或心血管系统有关的疾病的药物。全文摘要公开了通式(Ⅰ)的L－精氨酸衍生物,其制备方法和含有所述衍生物的药物组合物。这种化合物具有一氧化氮合成酶抑制剂的生物活性。式中A为氢原子、低级烷基或硝基,E为氧原子或其价键,n为0或1—12的整数,R文档编号C07C229/26GK1179774SQ9619288公开日1998年4月22日申请日期1996年3月4日优先权日1995年3月4日发明者C·布罗奎特,P·E·查布里尔迪拉萨尼里申请人:科学研究与运用咨询公司